微挥和荧光素-提拉美化物，用于小鼠肾上腺的多重免疫染色 – 使用来自同一宿主物种的未结合原抗体

摘要

利用来自同一宿主物种的初级抗体，已经建立了几种不同的多路免疫染色方法。在这里，我们描述了在正式固定石蜡嵌入小鼠肾上腺部分进行多倍免疫染色期间，使用微波介导的抗体剥离和荧光素-酪酰胺来阻止抗体的交叉反应。

摘要

免疫染色在生物医学研究中广泛应用，以显示特定蛋白质的细胞表达模式。多路免疫染色允许使用多种原抗体进行标记。为了尽量减少抗体交叉反应，使用间接染色进行多路免疫染色需要来自不同宿主物种的未标记原抗体。然而，不同物种抗体的适当组合并不总是可用的。在这里，我们描述了一种使用来自同一宿主物种（例如，在本例中两种抗体来自兔子）的未标记原抗体的方法，用于在形式固定的石蜡嵌入（FFPE）小鼠肾上腺部分进行多倍免疫荧光。该方法使用抗原检索步骤中使用的相同程序和试剂来去除先前染色的原抗体复合物的活性。幻灯片使用一般免疫染色方案染色的第一个初级抗体，然后与生物浸化二级抗体结合步骤。然后，采用一种以氟磷-酪酰胺为基质的avidin-生物素-过氧化物酶信号开发方法。通过浸入微波沸腾柠酸钠溶液8分钟，剥离了第一原发抗体复合物的免疫活性。不溶性氟磷-酪酰胺沉积留在样品上，使滑道上沾染了其他主要抗体。虽然这种方法消除了大多数误报信号，但抗体交叉反应的某些背景可能仍然存在。如果样品富含内源性生物锡，则可以使用过氧化物酶结合二级抗体替代生物异化二级抗体，以避免从回收的内源性生物锡中误化的假阳性。

引言

在多路免疫染色中，使用结合原抗体直接染色可提供信息性结果。不使用二级抗体，直接染色方法具有来自抗体交叉反应的虚假共定位信号的低风险。然而，在原抗体上的偶联记者（荧光、酶）或生物锡限制了其未来用途。或者，间接免疫染色通常通过使用未结合的初级抗体与标记的次级抗体提供更强的信号。理想情况下，用于多倍免疫染色的未结合原抗体应来自不同宿主物种，以避免抗体交叉反应。然而，不同宿主物种的初级抗体的适当组合并不总是可用的。

已经建立了几种方法来消除二级抗体与不需要的初级抗体反应的风险。一种常见的方法是使用F（ab）单体抗体在第二原抗体¹染色之前，阻断第一原抗体复合物上任何剩余的结合表位。抗体剥离，这是类似于条带和重新探针的西方斑点片，去除以前染色的抗体复合物，而不剥离可检测的检测报告分子的沉积，如3，3'-二氨基苯甲二甲酸酯四氯化物^（DAB）2和荧光酪酰胺沉积^3。使用这种方法，不同颜色的记者从分子可以在同一张幻灯片上显示多路复用结果。通过完全去除先前沉积的抗体层，以及从其他抗体^4、5中对齐随后获得的图像，也可以实现多重染色。这些方法都提供了可靠的结果，尽管每种方法都有其局限性，并且需要复杂的过程或特殊的成像系统。

本协议显示了使用常用缓冲液的抗体剥离方法的应用。该协议可用于对正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 小鼠肾上腺部分执行多倍免疫荧光染色，同时使用来自同一宿主物种的两种未标记的主要抗体。

研究方案

1. 使用第一抗体染色

1. 脱蜡和再水化 FFPE 滑动，每个步骤分配 5 分钟:二甲苯或等效试剂 3x、100% 乙醇 2x、95% 乙醇 1x、70% 乙醇 1x、50% 乙醇 1x 和蒸馏水 2x。
   注:滑轨应从此补液步骤开始保持湿润，直到安装到最后一步。
2. 对于可选的抗原检索，将幻灯片放入 275 mL 的沸腾柠子钠溶液（10 mM，pH = 6.0）8分钟。为了保持溶液沸腾，将幻灯片平放在 14 x 9.5 x 9 cm³ （W x L x H） 移液器的底盒上，带盖子和微波炉，将溶液在 700 W 微波炉中加热 8 分钟。然后从微波炉中取出移液器提示盒，打开盖子，让溶液在室温 （RT） 下冷却至少 20 分钟。
3. 将滑片转移到含有PBST（磷酸盐缓冲盐水，含0.1%多索巴20/80）的科普林罐中。用 PBST 清洗 5 分钟 3 倍。如果未立即移动到下一步，则将此步骤中的幻灯片与 PBST 一起存储在 RT 处的 Coplin jar 中数小时，或在 4°C 下存储 1-2 天（如果不立即移动到下一步）。
4. 准备阻滞溶液使用二级抗体宿主物种的正常血清作为阻断试剂。也可以使用其他商业阻断试剂。如果使用本研究提出的正常血清，将100μL的正常驴血清加入4.9 mL的PBST。阻隔溶液可在4°C下储存长达3天。
5. 要进行阻塞，请从幻灯片上摆脱 PBST，并快速用足够的阻止解决方案覆盖它们。在加湿室中用RT孵育幻灯片30分钟。
6. 使用阻隔溶液制备原抗体溶液（两个幻灯片为500 μL），将原抗体稀释至所需浓度。溶液应储存在冰上，直到使用。
   1. 对于3+HSD，将2μL的3μHSD加入498μL的阻断溶液中。
   2. 对于TH，将0.5μL的TH抗体加入499μL的阻断溶液中。
   3. 对于β-卡腾宁，将1μL的β-卡泰宁抗体加入499μL的阻断溶液中。
   4. 对于20μHSD，在499μL的阻断溶液中加入1μL的20+HSD抗体。
   5. 对于CYP2F2，将2μL的CYP2F2抗体加入498μL的阻断溶液中。
7. 通过从幻灯片中摇动阻塞溶液，用足够的原抗体溶液快速覆盖原抗体，孵育原抗体。在4°C的加湿室中孵育幻灯片过夜。在孵育过程中，幻灯片可以覆盖一小块石蜡薄膜，以防止干燥。
8. 第二天早上用PBST清洗幻灯片5分钟3次。
9. 使用阻隔溶液将生物浸化二级抗体稀释至所需浓度（例如，驴抗小鼠抗体的1μL或驴抗兔抗体进入499μL的阻断液）制备二级抗体溶液（两片幻灯片为500μL）解决方案）。溶液应储存在冰上，直到使用。
10. 通过从幻灯片上甩掉PBST，用足够的二级抗体溶液快速覆盖它们，孵育第二抗体。在 RT 处将幻灯片孵育在加湿室中 1 小时。
    注:如果内源性生物锡是一个问题，请使用过氧化物酶结合的二级抗体，而不是生物异位化二级抗体。如果在步骤 1.10 中使用过氧化物酶结合的二级抗体，则跳转到步骤 1.14。
11. 用 PBST 清洗幻灯片 5 分钟 3 倍。
12. 在PBS的499μL中加入0.5 μL的SA-HRP溶液（两片幻灯片为500 μL），制备马萝卜过氧化物酶结合链球菌蛋白（SA-HRP）溶液（两片幻灯片为500μL）。最终浓度为1微克/mL。
13. 使用 SA-HRP 解决方案孵育。从幻灯片中摆脱 PBST，使用足够的 SA-HRP 解决方案快速覆盖幻灯片。在 RT 处将幻灯片孵育在加湿室中 0.5 小时。
14. 用 PBST 清洗幻灯片 5 分钟 3 倍。
15. 根据制造商的说明（例如，5 μL 的荧光磷-酪酰胺）将氟磷-酪酰胺与其稀释缓冲液稀释至稀释缓冲液（例如，将 5 μL 的氟磷-酪酰胺转化为 496 μL 稀释缓冲液），从而制备荧光酸酯溶液。
16. 通过从幻灯片中甩出PBST，用足够的荧光磷-酪酰化物溶液快速覆盖幻灯片，使用氟磷-酪酰胺执行信号开发。在RT的加湿室中孵育1分钟。可以调整孵育时间以获得所需的荧光强度。通过将幻灯片转移到含有 PBST 的科普林罐中，停止反应。用 PBST 清洗幻灯片 3 分钟 2 倍。
17. 信号可以在荧光显微镜下快速检查，以确认该阶段的结果。如果未使用盖玻片，请在每个部分涂抹一滴甘油:PBS （1:1），以保持样品湿润。用 PBST 清洗幻灯片 3 分钟 2 倍。在进入下一步之前，幻灯片可在 4°C 的 PBST 中存储几天。

2. 剥去第一抗体

1. 将滑片放入 275 mL 的沸腾柠子钠溶液（10 mM，pH = 6.0）中至少 8 分钟。将幻灯片平放在 14 x 9.5 x 9 cm³ （W x L x H） 移液器底部，带盖子，在 700 W 微波炉中用 70% 的功率微摇溶液 8 分钟，使溶液保持沸腾。如果首选较长的剥离时间，则可能需要使用沸腾的柠酸钠溶液从缓冲液中顶下，以保持幻灯片始终保持在缓冲液中。从微波炉中取出移液器提示盒，打开盖子，让溶液在 RT 下冷却至少 20 分钟。
2. 将幻灯片转移到包含 PBST 的科普林罐中。用 PBST 清洗 5 分钟 3 倍。如果不立即执行下一步，将幻灯片存放在带有 PBST 的 Coplin 罐中，在 RT 上存放几个小时或 4°C 1-2 天。

3. 第二抗体染色

1. 从阻止步骤开始，按照步骤 1.5 中的步骤 1.5 到步骤 1.14 中的相同过程。在信号开发步骤（步骤 1.15 和步骤 1.16）中，在不同的荧光光谱中使用荧光素-酪酰胺。
   注:可以使用此方法多次剥离幻灯片，以便进行多路染色。最后一种抗体不需要作为报告人使用氟磷-酪酰胺。荧光团二级抗体可用于显示来自最后一个初级抗体的信号。
2. 在RT孵育2μg/mL 4'，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）或Hoechst溶液，如果需要核计数器染色，在RT上孵育1分钟。然后用 PBST 清洗幻灯片 3 分钟 2 倍。

4. 使用荧光显微镜检测信号的成像

1. 安装盖玻片，安装一滴适合免疫荧光的安装介质。
2. 对于成像，使用荧光显微镜检测每个荧光通道的信号。从核染色 （DAPI） 通道和 4x 透镜开始，以定位幻灯片上的组织。
3. 切换到 10 倍镜头进行成像。调整曝光时间（300 ms）和光源强度（80%强度）。如果信号太亮或太暗，请调整这些设置。在不移动舞台的情况下拍摄每个通道的照片。每个通道可能需要重新聚焦。使用显微镜的软件或 ImageJ（imagej.nih.gov/ij/）合并每个通道的图像。

结果

结果来自经过所有步骤处理的样本，包括抗原检索步骤1.2。这里使用的所有二级抗体都是生物异位。氟磷-酪酰胺用于从第一和第二原抗体产生信号。使用配备 FITC 立方体（用于绿色荧光）、TxRED 立方体（用于 Cy3）和 DAPI 立方体（用于 DAPI）的荧光显微镜捕获图像。

微摆动介导剥离消除了交叉反应性。
小鼠FFPE肾...

讨论

多路免疫染色可用于检查两种或两种以上抗原的细胞共定位。当初级抗体与不同的检测器（直接染色）结合时，这种广泛使用的技术提供了令人信服的共定位结果。然而，与间接染色相比，直接染色通常提供较弱的信号，这涉及结合的二级抗体来检测初级抗体。在间接染色中，高质量的多路免疫染色结果取决于二级抗体能否区分不同的原抗体。由于可能的抗体交叉反应，使用间接染色方法的多重?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Biotinylated donkey anti-mouse	JacksonImmuno	715-066-151	1:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbit	JacksonImmuno	711-066-152	1:500 dilution
DAPI	BioLegend	422801	2 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin	JacksonImmuno	016-030-084	1:1,000 dilution
Microwave oven, 700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	1:250 dilution
Mouse anti-TH	Santa Cruz	SC-25269	1:1,000 dilution
Normal donkey serum	JacksonImmuno	017-000-121	2% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSD	Kerafast	EB4002	1:500 dilution
Rabbit anti-3βHSD	TransGenic	KO607	1:250 dilution
Rabbit anti-TH	NOVUS	NB300-109	1:1,000 dilution
Rabbit anti-β-catenin	Abcam	ab32572	1:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)	JacksonImmuno	016-303-084	1:1,000 dilution
TSA Cy3 Tyramide	PerkinElmer	SAT704B001EA	1:100 dilution
TSA Fluorescein Tyramide	PerkinElmer	SAT701001EA	1:100 dilution