마우스 부신에 멀티플렉스 면역 염색을 위한 마이크로 웨이브 및 플루오로포어 티라미드 - 동일한 숙주 종에서 분리되지 않은 1 차 항체를 사용하여

요약

동일한 숙주 종으로부터의 1차 항체를 사용하여 멀티플렉스 면역염색을 위해 여러 가지 다른 방법이 확립되었다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀 내장 마우스 부신 절편에서 멀티플렉스 면역 염색 동안 항체 교차 반응성을 차단하기 위해 마이크로파 매개 항체 스트리핑 및 플루오로포폴-티라미드의 사용을 설명한다.

초록

면역 염색은 주어진 단백질의 세포 발현 패턴을 보여주기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용된다. 멀티플렉스 면역 염색은 다중 1 차적인 항체를 사용하여 표지를 허용합니다. 항체 교차 반응성을 최소화하기 위해, 간접 염색을 이용한 멀티플렉스 면역 염색은 다른 숙주 종으로부터의 표지되지 않은 1차 항체를 필요로 한다. 그러나, 상이한 종 항체의 적절한 조합이 항상 이용 가능한 것은 아니다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE) 마우스 부신 절편상에 대한 다중 면역형광에 대해 동일한 숙주 종(예를 들어, 두 항체가 토끼로부터)으로부터 표지되지 않은 1차 항체를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 항원 회수 단계에서 사용되는 동일한 절차 및 시약을 사용하여 이전에 염색된 1차 항체 복합체의 활성을 제거한다. 슬라이드는 일반적인 면역 염색 프로토콜을 사용하여 제1 차 항체로 염색하고 생체면역이차 항체를 이용한 결합 단계를 따랐다. 이어서, 아비딘-비오틴-과산화증 신호 개발 방법을 기질로서 불소-티라미드와 함께 사용하였다. 제1 차 항체 복합체의 면역활성을 전자레인지에 침지하여 8분 동안 구연산나트륨 용액을 제거하였다. 불용성 형광부-티라미드 증착은 샘플에 남아 있었고, 이는 슬라이드가 다른 1차 항체로 염색될 수 있게 하였다. 이 방법은 대부분의 거짓 양성 신호를 제거하지만, 항체 교차 반응성에서 일부 배경은 남아있을 수 있습니다. 시료가 내인성 비오틴으로 농축되는 경우, 과산화공소 이차 항체는 회수된 내인성 비오틴으로부터 거짓 양성을 피하기 위해 생체연화된 이차 항체를 대체하는데 사용될 수 있다.

서문

멀티플렉스 면역 염색에서, 공액 된 1 차 항체를 사용하여 직접 염색은 유익한 결과를 제공 할 수 있습니다. 이차 항체를 사용하지 않고, 직접 염색 방법은 항체 교차 반응성으로부터거짓 동경화 신호의 위험이 낮다. 그러나, 1차 항체상에 공액된 리포터(플루오로폴레, 효소) 또는 비오틴은 향후 사용을 제한한다. 대안적으로, 간접 면역 염색은 일반적으로 표지된 이차 항체를 가진 비공액 1차 항체를 사용하여 더 강한 신호를 제공한다. 이상적으로, 멀티플렉스 면역염색에 사용되는 비conjugated 1 차 항체는 항체 교차 반응성을 피하기 위해 상이한 숙주 종으로부터 와야 한다. 그러나, 상이한 숙주 종으로부터의 1차 항체의 적절한 조합이 항상 이용 가능한 것은 아니다.

바람직하지 않은 1차 항체와 반응하는 이차 항체의 위험을 제거하기 위해 여러 가지 방법이 확립되었다. 한 가지 일반적인 방법은 제1 차 항체 1로 염색하기 전에 제1 차 항체 복합체에 대한 잔존 결합 에피토프를 차단하는 F(ab) 단일성 항체를 사용하는^것이다. 서양 블롯 시트의 스트립 및 재프로브와 유사한 항체 스트리핑은 3,3'-다미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)² 및 형광 티라미드 증착^3와같은 검출 가능한 리포터 분자의 증착을 제거하지 않고 이전에 염색된 항체 복합체를 제거한다. 이 방법을 사용하면 서로 다른 색상의 리포터 분자가 동일한 슬라이드에서 멀티플렉스 결과를 표시할 수 있습니다. 멀티플렉스 염색은 또한 이전에 증착된 항체층을 완전히 제거하고 다른 항체로부터 이후에 획득된 이미지의^정렬에의해 달성된다^4,5. 각 방법에는 한계가 있고 복잡한 절차 또는 특별한 이미징 시스템이 필요하지만 이러한 방법은 모두 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다.

본 프로토콜은 일반적으로 이용 가능한 완충제의 사용과 함께 항체 스트리핑 방법의 적용을 나타낸다. 이 프로토콜은 동일한 숙주 종으로부터 2개의 표지되지 않은 1차 항체를 가진 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 마우스 부신 절편에서 다중 면역형광 염색을 수행하는데 사용될 수 있다.

프로토콜

1. 첫 번째 항체로 염색

1. 제왁스와 다음 단계각각에 5분 할당된 FFPE 슬라이드를 재수화: 자일렌 또는 등가 시약 3x, 100% 에탄올 2x, 95% 에탄올 1x, 70% 에탄올 1x, 50% 에탄올 1x 및 증류수 2x.
   참고: 슬라이드는 이 재수화 단계에서 최종 단계에서 장착될 때까지 촉촉한 상태를 유지해야 합니다.
2. 선택적 항원 회수의 경우, 슬라이드를 끓는 구연산나트륨 용액(10 mMM, pH = 6.0)의 275 mL에 8분 동안 놓습니다. 용액을 끓이게 하려면 슬라이드를 14 x 9.5 x 9cm^3(W x L X H) 파이펫 팁 박스의 바닥에 평평하게 놓고 70% 전원을 70% 전원으로 70% 전원으로 700W 전자레인지에 8분간 돌리세요. 그런 다음 전자 레인지에서 파이펫 팁 상자를 제거하고 뚜껑을 열고 용액을 실온 (RT)에서 적어도 20 분 동안 식힙니다.
3. PBST를 포함하는 코플린 항아리에 슬라이드를 전송합니다 (0.1 % 폴리 소르베이트 20/80와 인산완충 식염수). PBST로 5분 3x로 씻으소서. 즉시 다음 단계로 이동하지 않을 경우, 즉시 다음 단계로 이동하지 않을 경우, 몇 시간 동안 RT또는 4 °C에서 1-2 일 동안 코플린 항아리에 PBST와 함께이 단계에서 슬라이드를 저장합니다.
4. 차단 용액을 준비하기 위해 이차 항체의 숙주 종의 정상 혈청을 차단 시약으로서 사용한다. 다른 상업적 차단 시약도 사용될 수 있다. 본 연구에서 제시된 연구에 사용되는 정상 혈청을 사용하는 경우, PBST의 4.9 mL에 정상 당나귀 혈청 100 μL을 추가하십시오. 차단 용액은 최대 3일 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
5. 차단을 위해 슬라이드에서 PBST를 흔들어 충분한 차단 솔루션으로 신속하게 덮습니다. 30 분 동안 가습 챔버에서 RT에서 슬라이드를 인큐베이션.
6. 원발성 항체를 원하는 농도로 희석시키기 위해 차단 용액을 사용하여 1차 항체 용액(2개의 슬라이드에 대해 500 μL)을 준비한다. 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관해야합니다.
   1. 3βHSD의 경우, 차단 용액의 498 μL에 3βHSD의 2 μL을 추가합니다.
   2. TH의 경우, TH 항체의 0.5 μL을 499 μL의 차단 용액에 넣습니다.
   3. β-카데닌의 경우, β-카데닌 항체 1μL을 차단 용액 499 μL에 넣습니다.
   4. 20αHSD의 경우, 차단 용액의 499 μL에 20αHSD 항체의 1 μL을 추가합니다.
   5. CYP2F2의 경우 CYP2F2 항체 2μL을 498 μL의 차단 용액에 추가합니다.
7. 슬라이드에서 차단 용액을 흔들어 1 차 항체와 배양하고 충분한 원발성 항체 용액으로 신속하게 덮습니다. 슬라이드를 4°C에서 밤새 가습 챔버에 인큐베이션합니다. 배양 도중 슬라이드는 건조를 방지하기 위하여 파라핀 필름의 작은 조각에 의해 엄호될 수 있습니다.
8. 다음날 아침 5 분 3x에 대한 PBST로 슬라이드를 씻어.
9. 이차 항체 용액(2개의 슬라이드에 대해 500 μL)을 차단 용액을 사용하여 생체측화된 이차 항체를 원하는 농도로 희석(예를 들어, 당나귀 항마우스 항체 또는 당나귀 항토끼 항체의 1 μL을 499μL로 차단함) 솔루션)을 참조하십시오. 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관해야합니다.
10. 슬라이드에서 PBST를 떨고 충분한 이차 항체 용액으로 신속하게 덮음으로써 두 번째 항체와 배양합니다. RT에서 1 시간 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양하십시오.
    참고: 내인성 비오틴이 우려되는 경우, 생체연화된 이차 항체 대신 과산화공수이차전항체를 사용한다. 1.10단계에서 과산화아제-이차 항체를 사용하는 경우 1.14단계로 이동한다.
11. PBST로 슬라이드를 5분 3x로 세척합니다.
12. 고추냉이 과옥시다아제(SA-HRP) 용액(SA-HRP) 용액(2개의 슬라이드에 500 μL)을 PS 499μL에 SA-HRP 0.5 μL을 추가하여 준비합니다. 최종 농도는 1 μg/mL입니다.
13. SA-HRP 솔루션으로 인큐베이션합니다. 슬라이드에서 PBST를 흔들고 충분한 SA-HRP 솔루션으로 슬라이드를 빠르게 덮습니다. RT에서 0.5 시간 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양하십시오.
14. PBST로 슬라이드를 5분 3x로 세척합니다.
15. 제조업체의 지침에 따라 플루오로포폴-티라미드를 희석 완충액으로 희석하여 플루오로포레-티라미드 용액을 준비합니다(예: 플루오로폴로폴레 티라미드의 5 μL을 희석 버퍼의 496 μL로).
16. 슬라이드에서 PBST를 떨고 충분한 플루오로폴레 티라미드 용액으로 슬라이드를 빠르게 덮음으로써 플루오로폴레 티라미드로 신호 개발을 수행합니다. RT에서 1 분 동안 가습 챔버에서 배양하십시오. 배양 시간은 원하는 형광 강도를 얻기 위해 조정될 수 있다. 슬라이드를 PBST가 들어 있는 코플린 항아리로 옮겨 반응을 멈춥시다. PBST로 슬라이드를 3분 2x로 세척합니다.
17. 신호는 이 단계에서 결과를 확인하기 위하여 형광 현미경의 밑에 빨리 검사될 수 있습니다. 커버립을 사용하지 않는 경우, 각 섹션에 글리세롤:PBS(1:1) 한 방울을 발라 시료를 촉촉하게 유지하십시오. PBST로 슬라이드를 3분 2x로 세척합니다. 슬라이드는 다음 단계로 이동하기 전에 며칠 동안 4°C에서 PBST에 저장될 수 있다.

2. 첫 번째 항체 를 제거

1. 275 mL의 끓는 구연산나트륨 용액 (10 mMM, pH = 6.0)에 슬라이드를 놓고 적어도 8 분 동안 끓이십시오. 슬라이드를 14 x 9.5 x 9 cm³ (W x L X H) 파이펫 팁 상자의 바닥에 평평하게 놓고 70 0 분 동안 70 % 전력으로 용액을 마이크로 웨이브하십시오. 더 긴 스트리핑 시간이 바람직한 경우, 항상 완충액에 침지된 슬라이드를 유지하기 위해 끓는 구연산나트륨 용액을 사용하여 버퍼를 상부에 두어야 할 수도 있다. 전자 레인지에서 파이펫 팁 상자를 제거하고 뚜껑을 열고 용액을 RT에서 적어도 20 분 동안 식힙니다.
2. 슬라이드를 PBST가 들어 있는 코플린 항아리에 옮김을 옮김을 넣습니다. PBST로 5분 3x로 씻으소서. 다음 단계가 즉시 수행되지 않으면, 슬라이드를 PBST가 있는 코플린 항아리에 몇 시간 동안 또는 1-2일 동안 4°C에서 보관한다.

3. 두 번째 항체로 얼룩

1. 차단 단계부터 시작하여 1.5단계부터 1.14단계까지 동일한 절차를 따릅니다. 신호 개발 단계(단계 1.15 및 단계 1.16)에서, 다른 형광 스펙트럼에서 형광-티라미드를 사용한다.
   참고: 이 방법을 사용하여 슬라이드를 여러 번 제거하여 멀티플렉스 얼룩을 허용할 수 있습니다. 마지막 항체는 리포터로서 형광포극-티라미드를 필요로 하지 않는다. 형광 공액 이차 항체는 마지막 1 차 항체로부터의 신호를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
2. 핵 카운터 염색이 필요한 경우 RT에서 2 μg/mL 4', 6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI) 또는 Hoechst 용액을 1분 동안 인큐베이트합니다. 그런 다음 PBST로 슬라이드를 3 분 2x로 씻습니다.

4. 신호를 검출하기 위하여 형광 현미경을 사용하여 화상 진찰

1. 면역 형광에 적합한 장착 매체를 떨어 뜨려 커버 슬립을 장착하십시오.
2. 화상 진찰을 위해, 각 형광 채널의 신호를 검출하기 위하여 형광 현미경을 이용하십시오. 핵 염색(DAPI) 채널과 4x 렌즈로 시작하여 슬라이드에서 조직을 찾습니다.
3. 이미징을 위해 10x 렌즈로 전환합니다. 노출 시간(300ms)과 광원 강도(80% 강도)를 조정합니다. 신호가 너무 밝거나 너무 어둡으면 이러한 설정을 조정합니다. 무대를 이동하지 않고 각 채널의 사진을 촬영합니다. 각 채널에 대해 다시 초점을 맞추는 것이 필요할 수 있습니다. 현미경의 소프트웨어 또는 ImageJ (imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 각 채널의 이미지를 병합합니다.

결과

결과는 항원 회수 단계 1.2를 포함하는 기재된 모든 단계로 처리된 샘플로부터 수득되었다. 여기에서 사용된 모든 이차 항체는 생체화되었다. 플루오로포레-티라미드는 제1 차 및 제1차 항체로부터의 신호를 개발하기 위해 사용되었다. 이미지는 FITC 큐브(녹색 형광의 경우), TxRED 큐브(Cy3용), DAPI 큐브(DAPI용)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 캡처되었습니다.

토론

멀티플렉스 면역염색은 2개 이상의 항원들의 세포 동국화를 검사하는데 유용하다. 이 널리 사용되는 기술은 1 차 항체가 다른 기자 (직접 염색)와 공액 될 때 설득력있는 동국화 결과를 제공합니다. 그러나, 직접 염색은 일반적으로 1 차적인 항체를 검출하기 위하여 공액한 이차 항체를 관련시키는 간접 염색에 비교된 더 약한 신호를 제공합니다. 간접 염색에서, 고품질 멀티플렉스 면역염색 결과?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Biotinylated donkey anti-mouse	JacksonImmuno	715-066-151	1:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbit	JacksonImmuno	711-066-152	1:500 dilution
DAPI	BioLegend	422801	2 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin	JacksonImmuno	016-030-084	1:1,000 dilution
Microwave oven, 700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	1:250 dilution
Mouse anti-TH	Santa Cruz	SC-25269	1:1,000 dilution
Normal donkey serum	JacksonImmuno	017-000-121	2% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSD	Kerafast	EB4002	1:500 dilution
Rabbit anti-3βHSD	TransGenic	KO607	1:250 dilution
Rabbit anti-TH	NOVUS	NB300-109	1:1,000 dilution
Rabbit anti-β-catenin	Abcam	ab32572	1:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)	JacksonImmuno	016-303-084	1:1,000 dilution
TSA Cy3 Tyramide	PerkinElmer	SAT704B001EA	1:100 dilution
TSA Fluorescein Tyramide	PerkinElmer	SAT701001EA	1:100 dilution