Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte

Résumé

Plusieurs méthodes différentes ont été établies pour l’immunostaining multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte. Ici, nous décrivons l’utilisation du décapage micro-ondes d’anticorps et du fluorophore-tyramide pour bloquer la réactivité croisée d’anticorps pendant l’immunostaining multiplex sur les sections surrénales paraffines formalin-fixes de paraffine.

Résumé

Immunostaining est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour montrer le modèle d’expression cellulaire d’une protéine donnée. L’immunostaining multiplex permet l’étiquetage à l’aide de plusieurs anticorps primaires. Pour minimiser la réactivité croisée des anticorps, l’immunostaining multiplex à l’aide de taches indirectes nécessite des anticorps primaires non étiquetés provenant de différentes espèces hôtes. Cependant, la combinaison appropriée de différents anticorps d’espèces n’est pas toujours disponible. Ici, nous décrivons une méthode d’utilisation des anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte (par exemple, dans ce cas, les deux anticorps sont du lapin) pour l’immunofluorescence multiplex sur les sections surrénales de souris formalin-fixes (FFPE). Cette méthode utilise la même procédure et les réactifs utilisés dans l’étape de récupération d’antigène pour dépouiller l’activité du complexe d’anticorps primaire précédemment taché. Des glissières ont été souillées avec le premier anticorps primaire utilisant un protocole d’immunostaining général suivi d’une étape de liaison avec un anticorps secondaire biotinylated. Ensuite, une méthode de développement de signal avidin-biotine-peroxidase a été utilisée avec le fluorophore-tyramide comme substrat. L’immunoactivité du premier complexe primaire d’anticorps a été dépouillée par immersion dans une solution de citrate de sodium bouillante au micro-ondes pendant 8 min. Le dépôt insoluble de fluorophore-tyramide est resté sur l’échantillon, ce qui a permis à la glissière d’être tachée avec d’autres anticorps primaires. Bien que cette méthode élimine la plupart des faux signaux positifs, un certain fond de la réactivité croisée des anticorps peut rester. Si les échantillons sont enrichis en biotine endogène, un anticorps secondaire conjugué par peroxidase peut être utilisé pour remplacer l’anticorps secondaire biotinylated pour éviter le faux positif de la biotine endogène récupérée.

Introduction

Dans l’immunostaining multiplex, la coloration directe utilisant des anticorps primaires conjugués peut fournir des résultats informatifs. Sans utiliser d’anticorps secondaires, la méthode de coloration directe présente un faible risque de faux signaux de colocalisation provenant de la réactivité croisée des anticorps. Cependant, les reporters conjugués (fluorophore, enzymes) ou la biotine sur l’anticorps primaire limitent son utilisation future. Alternativement, l’immunostaining indirect fournit habituellement des signaux plus forts en utilisant un anticorps primaire non conjugué avec un anticorps secondaire étiqueté. Idéalement, les anticorps primaires non conjugués utilisés dans l’immunostaining multiplex devraient provenir de différentes espèces hôtes pour éviter la réactivité croisée des anticorps. Cependant, la combinaison appropriée d’anticorps primaires provenant de différentes espèces hôtes n’est pas toujours disponible.

Plusieurs méthodes ont été établies pour éliminer le risque que l’anticorps secondaire réagisse avec un anticorps primaire indésirable. Une méthode courante est l’utilisation d’un anticorps monomeric F(ab) pour bloquer les épitopes de liaison restants sur le premier complexe d’anticorps primaires avant de coloration avec le deuxième anticorps primaire¹. Le décapage des anticorps, qui est similaire à la bande et à la résondance d’une feuille de tache occidentale, enlève le complexe d’anticorps précédemment taché sans dépouiller le dépôt de molécules de reporter détectables telles que le tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB)² et le dépôt fluorescent de tyramide^3. Avec cette méthode, les molécules de reporter dans différentes couleurs peuvent montrer un résultat multiplexe sur la même diapositive. La coloration multiplexe est également réalisable par l’élimination complète des couches précédemment déposées d’anticorps et l’alignement des images acquises ultérieurement à partir d’autres anticorps^4,5. Ces méthodes donnent toutes des résultats fiables, bien que chaque méthode ait ses limites et nécessite soit des procédures compliquées, soit un système d’imagerie spécial.

Le protocole actuel montre l’application d’une méthode de décapage des anticorps avec l’utilisation de tampons couramment disponibles. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer des taches immunofluorescentes multiplex sur des sections surrénales de souris intégrées à la paraffine (FFPE) avec deux anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte.

Protocole

1. Staining avec le premier anticorps

1. Décire et réhydrater les glissières FFPE avec 5 min allouées à chacune des étapes suivantes : xylène ou réactifs équivalents 3x, 100 % éthanol 2x, 95 % éthanol 1x, 70 % éthanol 1x, 50 % éthanol 1x et eau distillée 2x.
   REMARQUE : Les glissières doivent rester humides à partir de cette étape de réhydratation jusqu’à l’accumulation dans l’étape finale.
2. Pour la récupération facultative de l’antigène, placez les lames dans 275 ml de solution de citrate de sodium bouillante (10 mm, pH et 6,0) pendant 8 min. Pour maintenir la solution bouillante, placez les lames à plat sur le fond d’une boîte de tuyauterie de 14 x 9,5 x 9 cm³ (W x L x H) avec un couvercle et micro-ondes la solution sur 70 % de puissance dans un four à micro-ondes de 700 W pendant 8 min. Retirez ensuite la boîte de tip du four à micro-ondes, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à température ambiante (RT) pendant au moins 20 min.
3. Transférer les diapositives dans un pot de Coplin contenant de la PBST (saline tamponnée de phosphate avec 0,1 % de polysorbate 20/80). Laver avec pBST pendant 5 min 3x. Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape suivante, entreposez les diapositives à cette étape avec pBST dans un bocal Coplin à RT pendant quelques heures ou à 4 oC pendant 1-2 jours si ce n’est pas immédiatement passer à l’étape suivante.
4. Pour préparer la solution de blocage, utilisez le sérum normal de l’espèce hôte de l’anticorps secondaire comme réactif de blocage. D’autres réactifs de blocage commerciaux peuvent également être utilisés. Si vous utilisez le sérum normal utilisé pour l’étude présentée dans cette étude, ajoutez 100 L de sérum d’âne normal à 4,9 mL de PBST. La solution de blocage peut être stockée à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu’à 3 jours.
5. Pour bloquer, secouez la PBST des diapositives et recouvrez-les rapidement d’une solution de blocage suffisante. Incuber les toboggans à RT dans une chambre humidifiée pendant 30 min.
6. Préparer la solution d’anticorps primaire (500 l pour deux diapositives) en utilisant la solution de blocage pour diluer l’anticorps primaire à la concentration désirée. La solution doit être stockée sur la glace jusqu’à l’utilisation.
   1. Pour 3'HSD, ajouter 2 'L de 3'HSD dans 498 'L de solution de blocage.
   2. Pour TH, ajouter 0,5 L d’anticorps TH dans 499 'L de solution de blocage.
   3. Pour la caténine, ajouter 1 'L d’anticorps de caténine dans 499 'L de solution de blocage.
   4. Pour 20'HSD, ajoutez 1 'L d’anticorps de 20'HSD dans 499 'L de solution de blocage.
   5. Pour CYP2F2, ajouter 2 'L d’anticorps CYP2F2 dans 498 'L de solution de blocage.
7. Incuber avec l’anticorps primaire en secouant la solution de blocage des diapositives, et rapidement les couvrir avec une solution d’anticorps primaire suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant la nuit à 4 oC. Pendant l’incubation, les diapositives peuvent être recouvertes d’un petit morceau de film de paraffine pour éviter le dessèchement.
8. Le lendemain matin laver les diapositives avec PBST pour 5 min 3x.
9. Préparer la solution d’anticorps secondaire (500 l pour deux diapositives) en utilisant la solution de blocage pour diluer l’anticorps secondaire biotinylated à la concentration désirée (p. ex., 1 l d’anticorps antisouris à ânes ou d’anticorps anti-lapin à ânes en 499 l de blocage solution). La solution doit être stockée sur la glace jusqu’à l’utilisation.
10. Incuber avec le deuxième anticorps en secouant la PBST des diapositives et en les recouvrant rapidement d’une solution d’anticorps secondaire suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant 1 h à RT.
    REMARQUE : Si la biotine endogène est une préoccupation, utilisez un anticorps secondaire peroxidase-conjugué au lieu de l’anticorps secondaire biotinylated. Passez à l’étape 1.14 si vous utilisez un anticorps secondaire conjugué à la peroxidase à l’étape 1.10.
11. Laver les toboggans avec pBST pendant 5 min 3x.
12. Préparer la solution de streptavidine conjuguée au raifort peroxidase (SA-HRP) (500 l pour deux diapositives) en ajoutant 0,5 L de SA-HRP en 499 L de PBS. La concentration finale est de 1 g/mL.
13. Incuber avec la solution SA-HRP. Secouez la PBST des diapositives et recouvrez rapidement les diapositives d’une solution SA-HRP suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant 0,5 h à RT.
14. Laver les toboggans avec pBST pendant 5 min 3x.
15. Préparer la solution fluorophore-tyramide en diluant le fluorophore-tyramide avec son tampon de dilution selon les instructions du fabricant (p. ex., 5 l de fluorophore-tyramide en 496 l de tampon de dilution).
16. Effectuer le développement du signal avec fluorophore-tyramide en secouant la PBST des diapositives et en couvrant rapidement les diapositives avec une solution suffisamment fluorophore-tyramide. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 1 min à RT. Le temps d’incubation peut être ajusté pour obtenir l’intensité de fluorescence désirée. Arrêtez la réaction en transférant les diapositives dans un bocal Coplin contenant de la PBST. Laver les toboggans avec pBST pendant 3 min 2x.
17. Les signaux peuvent être rapidement vérifiés sous un microscope à fluorescence pour confirmer le résultat à ce stade. Si les résilles ne sont pas utilisées, appliquez une goutte de glycérol :PBS (1:1) sur chaque section pour garder les échantillons humides. Laver les toboggans avec pBST pendant 3 min 2x. Les glissières peuvent être stockées en PBST à 4 oC pendant quelques jours avant de passer à l’étape suivante.

2. Dépouiller le premier anticorps

1. Placez les lames dans 275 ml de solution de citrate de sodium bouillante (10 mm, pH et 6,0) pendant au moins 8 min. Maintenez la solution à ébullition en plaçant les lames à plat sur le fond d’une boîte à tuyaux de 14 x 9,5 x 9 cm³ (W x X H) avec couvercle et micro-ondes de la solution sur une puissance de 700 W pendant 8 min. Si un temps de décapage plus long est préférable, il peut être nécessaire de compléter le tampon à l’aide d’une solution de citrate de sodium bouillante pour garder les diapositives immergées dans la solution tampon en tout temps. Retirez la boîte de tip du four à micro-ondes, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à RT pendant au moins 20 min.
2. Transférer les diapositives dans un bocal Coplin contenant de la PBST. Laver avec pBST pendant 5 min 3x. Si l’étape suivante, si elle n’est pas effectuée immédiatement, entreposez les diapositives dans un bocal Coplin avec PBST à RT pendant quelques heures ou à 4 oC pendant 1-2 jours.

3. Tache avec le deuxième anticorps

1. Commencez par l’étape de blocage et suivez les mêmes procédures dans l’étape 1.5 à l’étape 1.14. Aux étapes de développement du signal (étape 1,15 et étape 1,16), utilisez le fluorophore-tyramide dans un spectre de fluorescence différent.
   REMARQUE : Les diapositives peuvent être dépouillées à l’aide de cette méthode plusieurs fois pour permettre la coloration multiplexe. Le dernier anticorps n’a pas besoin de fluorophore-tyramide comme le journaliste. Un anticorps secondaire conjugué au fluorophore pourrait être utilisé pour montrer les signaux du dernier anticorps primaire.
2. Incuber les toboggans avec 2 g/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou la solution Hoechst pendant 1 min à RT si la coloration du compteur nucléaire est nécessaire. Ensuite, lavez les diapositives avec PBST pendant 3 min 2x.

4. Imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence pour détecter les signaux

1. Montez un bordereau avec une goutte de milieu de montage adapté à l’immunofluorescence.
2. Pour l’imagerie, utilisez un microscope à fluorescence pour détecter les signaux de chaque canal de fluorescence. Commencez par le canal de coloration nucléaire (DAPI) et la lentille 4x pour localiser le tissu sur la diapositive.
3. Passez à l’objectif 10x pour l’imagerie. Ajuster le temps d’exposition (300 ms) et l’intensité des sources lumineuses (intensité de 80 %). Ajustez ces réglages si le signal est trop lumineux ou trop foncé. Prenez des photos de chaque canal sans déplacer la scène. Un recentrage peut être nécessaire pour chaque canal. Fusionnez les images de chaque canal à l’aide du logiciel du microscope ou de l’ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

Résultats

Les résultats ont été obtenus à partir d’échantillons traités avec toutes les étapes décrites, y compris l’étape de récupération d’antigène 1.2. Tous les anticorps secondaires utilisés ici ont été biotinylated. Fluorophore-tyramide a été utilisé pour développer des signaux à partir des premiers et deuxièmes anticorps primaires. Des images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un cube FITC (pour la fluorescence verte), d?...

Discussion

Multiplex immunostaining est utile pour examiner la colocalisation cellulaire de deux ou plusieurs antigènes. Cette technique largement utilisée donne des résultats convaincants de colocalisation lorsque les anticorps primaires sont conjugués avec différents journalistes (coloration directe). Cependant, la coloration directe fournit habituellement des signaux plus faibles par rapport à la coloration indirecte, ce qui implique des anticorps secondaires conjugués pour détecter les anticorps primaires. Dans la color...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Biotinylated donkey anti-mouse	JacksonImmuno	715-066-151	1:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbit	JacksonImmuno	711-066-152	1:500 dilution
DAPI	BioLegend	422801	2 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin	JacksonImmuno	016-030-084	1:1,000 dilution
Microwave oven, 700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	1:250 dilution
Mouse anti-TH	Santa Cruz	SC-25269	1:1,000 dilution
Normal donkey serum	JacksonImmuno	017-000-121	2% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSD	Kerafast	EB4002	1:500 dilution
Rabbit anti-3βHSD	TransGenic	KO607	1:250 dilution
Rabbit anti-TH	NOVUS	NB300-109	1:1,000 dilution
Rabbit anti-β-catenin	Abcam	ab32572	1:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)	JacksonImmuno	016-303-084	1:1,000 dilution
TSA Cy3 Tyramide	PerkinElmer	SAT704B001EA	1:100 dilution
TSA Fluorescein Tyramide	PerkinElmer	SAT701001EA	1:100 dilution