JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Aynı konak türün primer antikorları kullanılarak multipleks immünboyama için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Burada, formalin-sabit parafin gömülü fare adrenal bölümlerinde multipleks immünboyama sırasında antikor çapraz reaktivitesini engellemek için mikrodalga aracılı antikor sıyırma ve florofor-tiramid kullanımını açıklıyoruz.

Özet

Immunostaining yaygın olarak belirli bir proteinin hücresel ifade deseni göstermek için biyomedikal araştırmalarda kullanılır. Multipleks immünboyama birden fazla primer antikor kullanarak etiketleme sağlar. Antikor çapraz reaktivitesini en aza indirmek için, dolaylı boyama kullanarak multipleks immünboyama farklı konak türlerinden etiketsiz birincil antikorlar gerektirir. Ancak, farklı tür antikorlarının uygun kombinasyonu her zaman mevcut değildir. Burada, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) fare adrenal kesitlerinde multipleks immünofluoresans için aynı konak türlerden (örneğin, bu durumda her iki antikor da tavşandan) etiketlenmemiş birincil antikorların kullanılması nın bir yöntemini tanımlıyoruz. Bu yöntem, daha önce lekelenmiş primer antikor kompleksinin aktivitesini siliklemek için antijen alma adımında kullanılan aynı prosedürü ve reaktifleri kullanır. Slaytlar genel bir immünboyama protokolü kullanılarak ilk primer antikor ile boyandı ve ardından biyotinylated sekonder antikor ile bağlayıcı bir adım atıldı. Daha sonra, bir avidin-biotin-peroksidaz sinyal geliştirme yöntemi substrat olarak florofor-tiramid ile kullanılmıştır. İlk primer antikor kompleksinin immünaktivitesi mikrodalgada kaynayan sodyum sitrat çözeltisi ile 8 dakika boyunca daldırma yoluyla çıkarıldı. Çözünmez florofor-tiramid birikimi, slayt diğer primer antikorlar ile lekeli izin örnek üzerinde kaldı. Bu yöntem çoğu yanlış pozitif sinyalleri ortadan kaldırsa da, antikor çapraz reaktivite bazı arka plan kalabilir. Örnekler endojen biotin ile zenginleştirilmiş ise, bir peroksidaz konjuge sekonder antikor kurtarılan endojen biotin yanlış pozitif önlemek için biyotinylated ikincil antikor yerine kullanılabilir.

Giriş

Multipleks immünboyama, konjuge primer antikorlar kullanılarak doğrudan boyama bilgilendirici sonuçlar sağlayabilir. Sekonder antikorlar kullanmadan, doğrudan boyama yöntemi antikor çapraz reaktivite yanlış kolokalizasyon sinyalleri düşük bir risk vardır. Ancak, konjuge muhabirler (florofor, enzimler) veya primer antikor üzerinde biotin gelecekteki kullanımını sınırlamak. Alternatif olarak, dolaylı immünboyama genellikle etiketli ikincil antikor ile konjuge olmayan bir primer antikor kullanarak güçlü sinyaller sağlar. İdeal olarak, multipleks immünboyama kullanılan konjuge olmayan primer antikorlar antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı konak türlerden gelmelidir. Ancak, farklı konak türlerden birincil antikorların uygun kombinasyonu her zaman mevcut değildir.

İstenmeyen bir primer antikorile tepki gösteren sekonder antikor riskini ortadan kaldırmak için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Yaygın yöntemlerden biri, ikinci primer antikor1ile boyama dan önce ilk primer antikor kompleksinde kalan bağlayıcı epitopları engellemek için F(ab) monomerik antikor kullanımıdır. Batı leke tabakasının şerit ve reprobuna benzeyen antikor sıyırma, 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB)2 ve floresan tiramidbirikimi3 gibi saptanabilir muhabir moleküllerin birikimini sıyırma olmadan daha önce lekeli antikor kompleksini kaldırır. Bu yöntemle, farklı renklerdeki muhabir moleküller aynı slaytta çok katlı bir sonuç gösterebilir. Multipleks boyama da antikorların daha önce birikmiş katmanları nın tamamen kaldırılması ve diğer antikorlardan sonradan edinilen görüntülerin hizalanması ile elde edilebilir4,5. Her yöntemin kendi sınırlamaları olmasına ve karmaşık prosedürler veya özel bir görüntüleme sistemi gerektirmesine rağmen, bu yöntemlerin tümü güvenilir sonuçlar verir.

Bu protokol, yaygın olarak kullanılan arabelleklerin kullanımı yla birlikte bir antikor sıyırma yönteminin uygulanmasını gösterir. Bu protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) fare adrenal kesitlerinde aynı konak türden iki etiketsiz birincil antikor içeren çok katlı immünoresan boyama yapmak için kullanılabilir.

Protokol

1. İlk Antikor ile Boyama

  1. Aşağıdaki adımların her birine ayrılan 5 dk ile dewax ve rehydrate FFPE slaytlar: ksilen veya eşdeğer reaktifler 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x, ve distile su 2x.
    NOT: Slaytlar bu rehidrasyon adımından başlayarak son adıma kadar nemli kalmalıdır.
  2. İsteğe bağlı antijen alımı için slaytları 8 dk kaynar sodyum sitrat çözeltisinin (10 mM, pH = 6,0) 275 mL'sine yerleştirin. Çözeltinin kaynamasını sağlamak için, slaytları 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) pipet ucu kutusunun altına düz bir şekilde yerleştirin ve çözeltiyi 8 dk boyunca 700 W mikrodalga fırında %70 güçte pişirin. Daha sonra pipet ucu kutusunu mikrodalga fırından çıkarın, kapağı açın ve çözeltinin oda sıcaklığında (RT) en az 20 dakika soğumasını bekleyin.
  3. Slaytları PBST içeren bir Coplin kavanozuna aktarın (fosfat tamponlu salin %0.1 polisorbat 20/80). 5 dk 3x PBST ile yıkayın. Hemen bir sonraki adıma geçmezseniz, pbst ile bu adımda slaytları rt'de bir Coplin kavanozunda birkaç saat veya 4 °C'de 1-2 gün boyunca saklayın.
  4. Engelleme çözeltisini hazırlamak için sekonder antikor türünün normal serumunu bloke reaktifi olarak kullanın. Diğer ticari engelleme reaktifleri de kullanılabilir. Bu çalışmada sunulan çalışmada kullanılan normal serum kullanıyorsanız, PBST 4.9 mL için normal eşek serumu 100 μL ekleyin. Engelleme çözeltisi 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.
  5. Engelleme için, slaytlardan PBST'yi silkeleyin ve hızlı bir şekilde yeterli engelleme çözümüyle kaplayın. 30 dakika boyunca nemli bir odada RT slaytlar kuluçka.
  6. Birincil antikor çözeltisini istenilen konsantrasyona seyreltmek için bloklama çözeltisini kullanarak birincil antikor çözeltisini (iki slayt için 500°L) hazırlayın. Çözelti kullanıma kadar buzda saklanmalıdır.
    1. 3βHSD için, 498 μL engelleme çözeltisine 2 μL 3βHSD ekleyin.
    2. TH için, 499 μL bloklama çözeltisine 0,5 μL TH antikor ekleyin.
    3. β-catenin için, 499 μL bloklama çözeltisine 1 μL β-catenin antikor ekleyin.
    4. 20αHSD için, 499 μL engelleme çözeltisine 1 μL 20αHSD antikor ekleyin.
    5. CYP2F2 için, 498 μL engelleme çözeltisine 2 μL CYP2F2 antikor ekleyin.
  7. Slaytlardan bloke solüsyonu sallayarak ve hızlı bir şekilde yeterli birincil antikor çözeltisi ile kaplayarak birincil antikor ile kuluçka. Slaytları bir gece boyunca 4 °C'de nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında slaytlar kurumasını önlemek için küçük bir parça parafin film ile kaplanabilir.
  8. Ertesi sabah 5 dk 3x için PBST ile slaytlar yıkayın.
  9. Biyotinylated ikincil antikoru istenilen konsantrasyona seyreltmek için blokaj solüsyonu kullanarak ikincil antikor çözeltisini (iki slayt için 500°L) hazırlayın (örn. 1 μL eşek anti-fare antikorveya eşek anti-tavşan antikorunu 499 μL'lik blokaj içine çözüm). Çözelti kullanıma kadar buzda saklanmalıdır.
  10. Slaytlardan PBST kapalı sallayarak ve hızlı bir şekilde yeterli ikincil antikor çözeltisi ile kaplayarak ikinci antikor ile kuluçka. Slaytları nemli bir odada 1 saat boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Endojen biotin bir sorun ise, biyotinylated sekonder antikor yerine peroksidaz konjuge sekonder antikor kullanın. Adım 1.10'da peroksidaz konjuge ikincil antikor kullanıyorsanız adım 1.14'e geçin.
  11. 5 dk 3x için PBST ile slaytlar yıkayın.
  12. 499 μL PBS'ye 0,5 μL SA-HRP ekleyerek horseradish peroksidaz konjuge streptavidin (SA-HRP) çözeltisini (iki slayt için 500 μL) hazırlayın. Son konsantrasyon 1 μg/mL'dir.
  13. SA-HRP çözeltisi ile kuluçka. Slaytlardan PBST'yi salla ve slaytları hızlı bir şekilde yeterli SA-HRP çözümüyle kaplayın. Slaytları nemli bir odada 0,5 saat boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
  14. 5 dk 3x için PBST ile slaytlar yıkayın.
  15. Florofor-tiramid çözeltisini, üreticinin talimatlarına göre seyreltme tamponu yla seyrelterek florofor-tiramid çözeltisini hazırlayın (örn. 5 μL florofor-tiramid 496 μL seyreltme tamponuna).
  16. PBST'yi slaytlardan sallayarak ve slaytları yeterli florofor-tiramid solüsyonu ile hızla kaplayarak florofor-tiramid ile sinyal gelişimini gerçekleştirin. RT'de 1 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada kuluçka. Kuluçka süresi istenilen floresan yoğunluğuelde etmek için ayarlanabilir. Slaytları PBST içeren coplin kavanozuna aktararak reaksiyonu durdurun. 3 dk 2x PBST ile slaytlar yıkayın.
  17. Sinyaller, bu aşamada sonucu doğrulamak için floresan mikroskop altında hızlı bir şekilde kontrol edilebilir. Kapak lar kullanılıyorsa, numuneleri nemli tutmak için her bir bölüme bir damla gliserol: PBS (1: 1) uygulayırın. 3 dk 2x PBST ile slaytlar yıkayın. Slaytlar bir sonraki adıma geçmeden önce 4 °C'de birkaç gün PBST'de saklanabilir.

2. İlk Antikor Şerit

  1. Slaytları 275 mL kaynar sodyum sitrat çözeltisine (10 mM, pH = 6,0) en az 8 dk. Slaytları 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x X x H) pipet ucu kutusunun altına düz yerleştirerek kaynamaya tutun ve çözeltiyi 700 W mikrodalga fırında %70 güçte 8 dk.'ya yerleştirin. Daha uzun bir sıyırma süresi tercih edilirse, slaytları her zaman tampon çözeltisine daldırılmış tutmak için kaynayan sodyum sitrat çözeltisi kullanarak tampondan üst üste alınması gerekebilir. Pipet ucu kutusunu mikrodalga fırından çıkarın, kapağı açın ve çözeltinin EN az 20 dakika boyunca RT'de soğumasını bekleyin.
  2. Slaytları PBST içeren bir Coplin kavanozuna aktarın. 5 dk 3x PBST ile yıkayın. Bir sonraki adım hemen yapılmazsa, slaytları RT'de PBST ile coplin kavanozda birkaç saat veya 4 °C'de 1-2 gün saklayın.

3. İkinci Antikor ile Leke

  1. Engelleme adımından başlayın ve 1.5 adımdan 1.14'e kadar aynı yordamları izleyin. Sinyal geliştirme adımlarında (adım 1.15 ve adım 1.16), farklı bir floresan spektrumda florofor-tiramid kullanın.
    NOT: Slaytlar multipleks boyama izin vermek için bu yöntem kullanılarak birkaç kez sökülebilir. Son antikor muhabir olarak florofor-tiramid gerektirmez. Florofor konjuge sekonder antikor, son primer antikordan gelen sinyalleri göstermek için kullanılabilir.
  2. Nükleer sayaç boyama gerekiyorsa 2 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) veya 1 dk RT için Hoechst çözeltisi ile inkübat slaytlar. Daha sonra pbst ile 3 dk 2x için slaytlar yıkayın.

4. Sinyalleri Tespit Etmek Için Floresan Mikroskobu Kullanarak Görüntüleme

  1. İmmünofloresans için uygun montaj ortamı bir damla ile bir coverslip monte.
  2. Görüntüleme için, her floresan kanalının sinyallerini algılamak için bir floresan mikroskobu kullanın. Slayttaki dokuyu bulmak için nükleer boyama (DAPI) kanalı ve 4x lens ile başlayın.
  3. Görüntüleme için 10x lens'e geçin. Pozlama süresini (300 ms) ve ışık kaynağı yoğunluğunu (%80 yoğunluk) ayarlayın. Sinyal çok parlak veya çok koyuysa bu ayarları ayarlayın. Sahneyi hareket ettirmeden her kanalın fotoğraflarını çek. Her kanal için yeniden odaklama gerekebilir. Mikroskobun yazılımını veya ImageJ'i (imagej.nih.gov/ij/) kullanarak her kanaldaki görüntüleri birleştirin.

Sonuçlar

Sonuçlar, antijen alma adımı 1.2 de dahil olmak üzere açıklanan tüm adımlarla tedavi edilen örneklerden elde edildi. Burada kullanılan tüm sekonder antikorlar biyotinylated edildi. Florofor-tiramid birinci ve ikinci primer antikorlardan gelen sinyalleri geliştirmek için kullanıldı. Görüntüler, FITC küpü (yeşil floresan için), TxRED küpü (Cy3 için) ve DAPI küpü (DAPI için) ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak çekildi.

Tartışmalar

Multipleks immünboyama iki veya daha fazla antijenin hücresel kolokalizasyonunu incelemek için yararlıdır. Yaygın olarak kullanılan bu teknik, primer antikorlar farklı muhabirlerle konjuge edildiğinde (doğrudan boyama) ikna edici kolokalizasyon sonuçları verir. Ancak, doğrudan boyama genellikle birincil antikorları tespit etmek için konjuge ikincil antikorlar içeren dolaylı boyama ile karşılaştırıldığında zayıf sinyaller sağlar. Dolaylı boyamada, yüksek kaliteli multipleks immünboyama sonucu...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH R00 HD00 HD032636 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
Biotinylated donkey anti-mouseJacksonImmuno715-066-1511:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbitJacksonImmuno711-066-1521:500 dilution
DAPIBioLegend4228012 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscopeECHORevolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidinJacksonImmuno016-030-0841:1,000 dilution
Microwave oven, 700 WGeneral ElectricJEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2Santa CruzSC-3745401:250 dilution
Mouse anti-THSanta CruzSC-252691:1,000 dilution
Normal donkey serumJacksonImmuno017-000-1212% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSDKerafastEB40021:500 dilution
Rabbit anti-3βHSDTransGenicKO6071:250 dilution
Rabbit anti-THNOVUSNB300-1091:1,000 dilution
Rabbit anti-β-cateninAbcamab325721:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-0841:1,000 dilution
TSA Cy3 TyramidePerkinElmerSAT704B001EA1:100 dilution
TSA Fluorescein TyramidePerkinElmerSAT701001EA1:100 dilution

Referanslar

  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
  3. Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
  4. Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
  5. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
  8. Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
  9. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  10. Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
  11. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  12. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  13. Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
  14. Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imbiyolojisiSay 156multipleks imm nboyamaimm noresanstiramidmikrowavingantijen almaantikor s y rma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır