تسجيل متعدد الوحدات خارج الخلية من العصب الشمي من Teleosts

Summary

تسجيل وحدة متعددة خارج الخلية من العصب الشمي هو طريقة حساسة وقوية وقابلة للتكرار لتقييم حساسية الشم في الأسماك البحرية. ويسجل المدخلات الحسية الأولية ومستقل عن الملوحة الخارجية.

Abstract

وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن تحمض المحيطات يؤثر على السلوك الذي يحركه الشم في الأسماك. قد يكون هذا راجعاً جزئياً إلى انخفاض في حساسية الشم في نسبة عالية من ثاني أكسيد الكربون P₂/low pH. لتقييم آثار تحمض المحيطات، أو حساسية الشم في الأسماك البحرية بشكل عام، نقترح أن التسجيل متعدد الوحدات خارج الخلية من العصب الشمي هو الطريقة المفضلة. على الرغم من أن الغازية، وأنها حساسة، قوية، استنساخ ومستقلة عن الملوحة الخارجية (على عكس الكهربائية olfactogram [EOG]، على سبيل المثال). وعلاوة على ذلك، فإنه يسجل المدخلات الحسية الأولية في الجهاز العصبي المركزي، قبل أي معالجة مركزية. نظهر أن هذه الطريقة يمكن أن تظهر انخفاض في حساسية الشم التي هي على حد سواء مؤقتة وتعتمد على الرائحة، وذلك باستخدام مجموعة من الأحماض الأمينية لبناء منحنيات التركيز والاستجابة وحساب عتبات الكشف.

Introduction

الأسماك تعتمد اعتمادا كبيرا على الشم لكثير من جوانب حياتهم بما في ذلك العثور على الغذاء، وتجنب الحيوانات المفترسة، وتقييم الاصحاب المحتملة والهجرة، من بين أمور أخرى^1،2،3. ولذلك، تقييم حساسية الشم في الأسماك (ماذا رائحة؟ ما مدى حساسية هذه المركبات؟) من الضروري أن نفهم هذه العمليات بشكل كامل. وعلاوة على ذلك، فإن الآثار البشرية على البيئة، مثل تحمض المحيطات والتلوث، قد يكون لها آثار عميقة على نظام الشم، حتى على المستويات شبه الفحلة، لأنها بالضرورة على اتصال حميم بالمياه المحيطة⁴. في علم الفيزيولوجيا الكهربائية في الجسم الحي هو النهج التجريبي من خيار لتقييم حساسية الشم في الأسماك. ثلاث تقنيات رئيسية متاحة: تخطيط كهربية olfactogram (EOG)، وكهرباء الدماغ (EEG) المسجلة من لمبة الشم، وتسجيل وحدة متعددة من العصب^{الشمي 5}.

وEOG هو الأكثر استخداما على نطاق واسع من هذه الثلاثة⁶. وهو حقل الحالية المباشرة (DC) المحتملة المسجلة فوق ظهارة الشم ويعتقد أن تكون إمكانات مولد لخص تلك الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs) الاستجابة لرائحة معينة. ومع ذلك، وكما هو مسجل في الماء، وليس داخل الأسماك، فإن سعة الاستجابة لا تعتمد فقط على الإشارة التي تولدها الأسماك، ولكن أيضا على الموصلية للمياه المحيطة بها؛ كلما ارتفعت الموصلية (أو انخفاض المقاومة) ، فإن انخفاض السعة. وهذا قد يعني أن EOG هو وسيلة أقل حساسية في مياه البحر من المياه العذبة⁷.

كما يستخدم على نطاق واسع في التحقيق في الشم في الأسماك EEG المسجلة من لمبة الشم. ومع ذلك ، فإن لمبة الشم هو أول مركز معالجة لحاسة الشم الإدخال⁸؛ هو عال ينظّم داخل [كبيبرولي], وبالتالي الإستجابة يسجّل يعتمد بشدّة على الموقف من التسجيل أقطاب. على سبيل المثال، يتم معالجة المدخلات من ORNs الكشف عن الأحماض الأمينية بواسطة glomeruli في المنطقة الجانبي من المصابيح الشمية، في حين أن من المواد الكيميائية المشتقة من كونتينيك يتم توجيهها إلى منطقة الوسيط^{9،10،11،12}. قد يتم توجيه المدخلات الفيرومية إلى الكبيميرولي المترجمة للغاية داخل لمبة الشم. اعتمادا أيضا على تشريح الأنواع المعنية، قد لا يكون من السهل الوصول إلى موقع التسجيل المثالي لرائحة معينة.

متعدد وحدات تسجيل من العصب الشم يتحايل على المشاكل الرئيسية مع EOG وEEG المذكورة أعلاه. كما أنه يسجل الإجراءات المحتملة تمرير أسفل محاور عصبية من ORNs من ظهارة إلى لمبة، بل هو إشارة الحسية الأولية. وكما هو مسجل داخل الأسماك ، فإن سعة الاستجابة مستقلة عن الملوحة الخارجية. ومع ذلك ، بالطبع لديها بعض العيوب. أولاً، اعتماداً على تشريح الأنواع، مطلوب إجراء عملية جراحية أكثر شمولاً لفضح العصب الشمي من عملية الـ EOG. ثانياً، نظراً لأن الإشارة أصغر من إشارة مكتب الـ EOG، فإنها تتطلب معدات أكثر تطوراً، وبالتالي مكلفة. وقدم وصف عام للنهج التجريبية الأخرى من قبل جون كابريو^5. والهدف من هذه المقالة هو أن توضح كيفية تسجيل الردود خارج الخلية متعددة وحدة من العصب الشمي من قاع البحر (سباروس أوراتا) في الجسم الحي للأحماض الأمينية الروائح كمثال على هذه التقنية، وكيفية تحديد، والتغلب على بعض المشاكل الأكثر شيوعا التي واجهتها في مثل هذه التجربة.

Protocol

تمت صيانة الحيوانات وتجريبها في مرافق تجريبية معتمدة واتبعت التشريعات الوطنية البرتغالية (DL 113/2013) بموجب ترخيص من "المجموعة-1" من قبل المديرية العامة البيطرية ووزارة الزراعة والتنمية الريفية ومصايد الأسماك في البرتغال. وبما أن هذا البروتوكول ينطوي على مناولة الحيوانات، فيجب أن يوافق عليه الجسم المحلي و/أو الوطني الذي ينظم رعاية الحيوانات المستخدمة في التجارب العلمية، بالإضافة إلى أن الباحثين يحتاجون إلى التدريب المناسب والتراخيص اللازمة لتنفيذ مثل هذه الإجراءات.

1- إعداد التحفيز

ملاحظة: معظم الأسماك لديها نظام حاسة الشم عالية الحساسية، وبالتالي يجب توخي الحذر الشديد عند إعداد المحفزات الشم لاستخدامها في التجربة. يجب غسل الأواني الزجاجية المستخدمة لتعويض المحفزات في 5٪ من التبييض (هيبوكلوريت الصوديوم) ، وشطفها جيدًا بمياه الصنبور والمجففة. مباشرة قبل استخدام شطف الأواني الزجاجية جيدا مع مياه البحر (نفس الماء المستخدم لجعل التخفيف التحفيز). الحرص على أن أيا من هذه المياه يأتي في اتصال مع الجلد العاري.

1. جعل 100 مل من 10^-2 م L-الجلوتامين، L-leucine وL-سيرين؛ تخزين 1 مل aliquots من كل في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. في يوم التجربة، قم بالتحضير من هذه الـ aliquots، من 10^{إلى 3} M إلى 10-7 M (في خطوات تخفيف x10) باستخدام كل من التحكم وارتفاع CO^-7 ₂ مياه البحر.
   ملاحظة: L-serine^(10-3 M) سيتم استخدام كتحكم إيجابي، أو القياسية. المياه المستخدمة لتعويض التخفيفات من المحفزات، وتعامل بنفس الطريقة تماما كما المحفزات ولكن دون إضافة أي رائحة، وسوف تستخدم كتحكم سلبي أو فارغة.

2. إعداد التحكم وارتفاع CO₂ المياه

1. إعداد المياه التحكم عن طريق جمع 1 لتر من مياه البحر التي تمت تصفيتها الفحم.
   1. باستخدام مسبار pH ، تحقق من pH ؛ يجب أن يكون حوالي 8.2. إذا لم يكن كذلك، فقاعة مع الهواء في الغلاف الجوي حتى يتم التوصل إلى هذا درجة اله.
   2. باستخدام القلة titrator قياس القلة من الماء.
   3. قياس درجة حرارة الماء والملوحة.
2. إعداد ارتفاع CO₂ المياه عن طريق تصفية 1 لتر من مياه البحر، ثم فقاعة CO₂ حتى يتم التوصل إلى درجة الهزى المطلوب.
   1. باستخدام مسبار pH ، تحقق من pH ؛ يجب أن يكون حوالي 7.7.
   2. باستخدام القلة titrator، وقياس القلة من الماء.
   3. قياس درجة حرارة الماء والملوحة.
3. تحديد_ضغط ثاني أكسيد الكربون في كل من ماء التحكم وارتفاع ثاني أكسيد الكربون₂ باستخدام برنامج مصمم لحساب معلمات ثاني أكسيد الكربون₂ في الماء (مثل برنامج CO2Calc^13).
   1. في نافذة المدخلات تضاف قيم درجة حرارة الماء ودرجة الحرارة والملوحة واللقلوية الكلية (الشكل 1).
   2. حدد الثوابت والوحدات والمقاييس (راجع القيم الموصى بها في الشكل 2).
   3. اضغط على عملية الزر لتحديد ضغط CO_2.
      ملاحظة: يظهر الشكل 3 مثال ورقة نتيجة.

3- إعداد الأسماك

ملاحظة: يستخدم في هذا البروتوكول 200-400 غرام من الزنيس.

1. تخدير الأسماك في مياه البحر الطبيعية المهيّدة التي تحتوي على MS222 (ملح الإيثيل-3-أمينوبنزوات الميثان). عندما الاستجابة لقرصة الذيل قد توقفت، حقن في العضلات الجناح واعاقة العصبية العضوية جالامين ثلاثية الاثيثيويدي (10 ملغ ·كغ^-1 في المالحة الفسيولوجية).
   ملاحظة: يختلف تركيز التخدير المستخدم بين الأنواع؛ لبرنيس من 200−400 غرام، استخدم 200 ملغ· L^-1 المخزنة مع 400 ملغ· L^-1 NaHCO₃.
2. ضع السمك المُهدّد على دعم مُخفف. يعتمد الشكل والحجم الدقيق على الأنواع النموذجية؛ للدنيس (200-400 غرام)، استخدم دعمًا مبطنًا على شكل حرف V، مصنوع في المنزل.
3. ضع أنبوب السيليكون (قطر = 10 مم) في الفم، وربط الأنبوب بمضخة غاطسة في خزان مياه البحر المحتوية على التخدير والمهيّنة، وضخ المياه فوق الخياشيم عند ~ 100 مل·مين^-1·كغ^-1.
   ملاحظة: يعتمد حجم أنبوب السيليكون المستخدم على حجم الأسماك.
4. أدخل دبوس التأريض في عضلة الجناح وتوصيله إلى مرحلة الرأس من مكبر الصوت).
5. تغطية الأسماك بقطعة قماش مبللة (أو منشفة ورقية) مع رئيس فقط يتعرض، وضمان أن الغطاء لا يعيق خروج المياه من الخياشيم.
   ملاحظة: يمكن تغطية العينين بقطع من الورق الرطب/ القماش أو البلاستيك الأسود.
6. ضع أنبوب نظام توصيل التحفيز، أي الأنبوب الزجاجي المتصل بإمدادات من مياه البحر الخلفية، في فتحة الأنف.
   ملاحظة: يمكن استخدام أنابيب الدماتوكريت الدقيقة (الطول = 75 مم، ID = 1.15 مم، OD = 1.55 مم)؛ هذه يمكن أن تسحب إلى نقطة أدق على سحب القطب لاستخدامها مع الأسماك الصغيرة. من المهم التأكد من أن ظهارة الشم تبقى رطبة أثناء الجراحة (الموضحة أدناه).
7. فضح الأعصاب الشمية عن طريق إزالة الجلد والعظام من الجمجمة بين العينين (الأعصاب الشمية عادة تشغيل معا بين العينين) مع المعونة من الأسنان (من الناحية المثالية) أو هواية (على سبيل المثال، Dremel) الحفر أو تلميع الصائغ (مع الأسنان حفر بت) تحت مجهر تشريح (داخل قفص فاراداي).
   1. في اعمام البحر، وإزالة جزء من الجمجمة مباشرة فوق العينين، مع منشار دائري، من مجرد الأمامية إلى العينين إلى مجرد الخلفية لهم. ثم, باستخدام بت الحفر, إزالة العظام بين العينين; الأعصاب الشمية تكمن بين العينين.
8. مرة واحدة وقد تم تطهير العظام كافية, إزالة الدهون والأنسجة الضامة الإفراط في الأعصاب باستخدام ملقط غرامة; الحرص على عدم إتلاف الأعصاب أو ثقب أي الأوعية الدموية.
   ملاحظة: ستساعد الخبرة على تحسين التشريح؛ أصغر تشريح، وأكثر استقرارا إعداد سيكون. ومع ذلك، يجب إزالة الأنسجة الكافية؛ لـ غير مجرّب، عندما تكون المصابيح الشمية مرئية فقط، واضحة قليلاً أكثر بشكل أمامي لفضح جزء من الأعصاب لأنها تنضم إلى المصابيح للسماح لتحديد المواقع الصحيحة من الأقطاب الكهربائية.
9. تنظيف الأقطاب قبل استخدامها عن طريق ربطها بالعمود السالب لمصدر DC 3V (على سبيل المثال، اثنين من بطاريات AA في سلسلة) ووضع الطرف في المالحة الفسيولوجية (أو مياه البحر المخفف 1:3 في المياه العذبة) لمدة 20-30 s؛ وينبغي أن ينظر إلى تيار مستمر من فقاعات صغيرة قادمة من طرف.
10. بمجرد أن يتم كشف الأعصاب الشمية، أدخل أقطاب التسجيل (التي تقام على المتلاعبين الصغيرة) في وضع يعطي استجابة قصوى للمعيار (على سبيل المثال،^10-3 M-L-serine)، وأدنى استجابة للفراغ. استخدام أقطاب التنغستن المغلفة بالباريلين (جدول المواد) متصلة بالمرحلة الرأسية لـ (AC) preamplifier التيار المتناوب.
    ملاحظة: في اعماضة البحر، وعادة ما ينظر إلى أقوى الاستجابات للأحماض الأمينية مع الأقطاب وضعت في الجانب الجانبي من العصب، على مقربة من حيث ينضم لمبة الشم. وهذا قد ينطبق على الأنواع الأخرى، حيث أن التنظيم الكبي للمصباح مشابه بشكل عام بين الأنواع. ومع ذلك، فإن الخبرة هي دائما أفضل المعلمين.

4. التسجيل الكهربائي

ملاحظة: كما هو الحال مع معظم الفيزيولوجيا الكهربائية، يجب أن يتم تسجيل وحدة متعددة داخل قفص فاراداي. ومع ذلك، لا يتطلب التسجيل خارج الخلية عادةً جدولًا مضادًا للاهتزاز؛ ولكن لا يتطلب ذلك وجود جدول مضادة للاهتزازات. معظم الحركة سوف تأتي من الأسماك. ومع ذلك، مطلوب طاولة قوية ومستقرة مع سطح معدني لتأمين القواعد المغناطيسية من المدرجات المتلاعب الصغرى.

1. إنشاء نظام تقديم التحفيز للسماح للتحول السريع من المياه الخلفية النظيفة إلى المياه المحتوية على التحفيز، على سبيل المثال، باستخدام صمام ثلاثي يعمل باللولبي. توصيل المأخذ المشترك إلى الأنبوب الذي يحمل الماء إلى الورود الشمية، ووضع خط واحد في خزان مياه البحر والآخر في محلول الاختبار.
   ملاحظة: عندما يتم تبديل صمام (عن طريق تمرير DC الحالية)، تدفق المياه يتحول من المياه الخلفية إلى التي تحتوي على رائحة. وينبغي إعطاء الحافز لفترة طويلة بما فيه الكفاية لكي يشهد ذروة واضحة في الاستجابة المتكاملة، تليها فترة من الإقامة؛ الوقت المستخدم في البروتوكول الحالي هو 4 s، ولكن قد يكون وقتا أطول من الضروري اعتمادا على الأنواع.
2. توصيل برنامج تشغيل صمام إلى مشغل محول تناظري رقمي (على سبيل المثال، Digidata)؛ عندما يتم تحويل الصمام من الخلفية إلى خط يحتوي على التحفيز ، وهذا سيبدأ تسجيل البيانات. تكوين البرنامج لبدء التسجيل في الحدث الزناد والاستمرار لفترة محددة سلفا (على سبيل المثال، 10 ق).
   ملاحظة: عشر ثوان يجب أن تكون كافية ولكن يمكن أن يكون هذا تقصير أو إطالة، اعتماداً على السؤال التجريبي.
3. تحقق من استقرار التحضير عن طريق الاختبار (تسجيل وقياس سعة الاستجابة المتكاملة) بشكل متكرر مع المعيار ، 10^-3 M -L-serine في هذه الحالة ، والسماح لـ 1 دقيقة بانقضة بين المحفزات المتتالية.
   ملاحظة: اعتماداً إلى حد ما على الأنواع والرائحة، يجب أن يكون للاستجابات سعة داخل 10٪ من بعضها البعض (كقاعدة عامة) ، ويجب أن يكون لها بداية سريعة ، وترتفع إلى أقصى قدر من النشاط ، والعودة إلى خط الأساس بعد غياب التحفيز(الشكل 4).
4. تسجيل استجابات العصب الشمي للأحماض الأمينية في مراقبة مياه البحر (من أدنى إلى أعلى تركيز) والسماح 1 دقيقة لننقض بين المحفزات المتعاقبة.
   ملاحظة: من الممكن أن يكون من الضروري، بالنسبة لبعض الأنواع و/أو بعض الروائح، المزيد من الوقت. ولكن بالنسبة للأحماض الأمينية ودنيس، 1 دقيقة كافية.
5. تسجيل الاستجابة ل 10^-3 M سيرين وماء تحكم حل فارغ.
6. تغيير المياه الخلفية من مياه البحر التحكم إلى ارتفاع CO₂ مياه البحر، عن طريق وضع خط الخلفية في زجاجة مع ارتفاع CO₂ مياه البحر.
   ملاحظة: من المستحسن إدخال أنبوب آخر من الدماتوكريت (أو ما يعادلها) في نهاية خطوط التحفيز والخلفية لتجنب لمس الماء وضمان بقاء نهاية الأنبوب في الماء.
7. قبل اختبار استجابة العصب الشمي للأحماض الأمينية في مياه البحر CO₂ عالية، شرط ظهارة الشم مع ارتفاع CO₂ المياه باتباع ارتفاع CO₂ المياه على ظهارة حاسة الشم لبضع دقائق.
   ملاحظة: أظهرت التجربة أن 5 دقائق كافية بالنسبة للدنيس.
8. تسجيل استجابات العصب الشمي للأحماض الأمينية في مياه البحر CO₂ عالية (من أدنى إلى أعلى تركيز).
9. سجل الاستجابة لمحلول المياه الفارغة CO₂ عالية.
10. تسجيل الاستجابة ل 10^-3 M سيرين وماء تحكم حل فارغ.
    ملاحظة: يجب تصفية الإشارة الخام (نشاط العصب) (تمريرة منخفضة حوالي 2,000−5,000 هرتز، تمريرة عالية 50−300 هرتز) وتمريرها إلى محول تناظري رقمي(جدول المواد). للحصول على قياس كمي أسهل للنشاط العصبي، يمكن أيضا دمج الإشارة الخام باستخدام التكامل راشب(جدول المواد)وتمريرها إلى المحول الرقمي التماثلي، ومن هناك، كل من الإشارات الخام ومتكاملة إلى جهاز كمبيوتر تشغيل البرنامج المناسب (على سبيل المثال، Axoscope).

5 - تحليل البيانات

1. طرح السعة من الاستجابة المتكاملة إلى فارغة (في mV) من اتساع الاستجابات المتكاملة لجميع المحفزات.
2. تطبيع الاستجابات للمحفزات عن طريق تقسيم سعة الاستجابة السابقة إلى المعيار (10^-3 M serine); وهذا يقلل من التباين بين الأسماك وداخلها.
3. حساب عتبات الكشف عن طريق الانحدار الخطي من منحنيات التركيز والاستجابة (على مؤامرة شبه لوغاريتمي)، وفقا للوغارتم الصيغة(N + 1.5) =سجل C + B، حيث C هو تركيز المول ، N هو نطاق الاستجابة تطبيع ، و a و b هي الثوابت^7،14.
   ملاحظة: عتبة الكشف ثم قيمة x حيث y = 0.1761 (أي، سجل 1.5; N = 0)؛ التركيز الذي سوف يظهر فوقه رد (أي يمكن أن تشتمه الأسماك). تثير بعض الروائح منحنيات التركيز والاستجابة السيني عندما ترسم شبه لوغاريتمية (على سبيل المثال، الكالسيوم^15،16؛ في هذه الحالة ، يمكن تركيب البيانات العادية على مؤامرة هيل ثلاثية المعلمة التي ستعطي أقصى سعة استجابة_{وEC 50} (أي ، [odorant] الذي يعطي استجابة نصف قصوى ؛ أيضًا مقياسًا للحساسية).
4. قارن بين عتبات الكشف و/أو السعة القصوى للاستجابة و₅₀ من المحفزات المختبرة في ماء التحكم وتلك التي تم اختبارها في مياه ثاني أكسيد الكربون_{العالية.}

النتائج

استجابة نموذجية للسيطرة الإيجابية (10^-3 M L-serine; الشكل 4ألف) والتحكم السلبي (فارغ؛ الشكل 4ب) المسجلة من العصب الشمي من دنيس البحر هو مبين في الشكل 4. في وجود التحفيز (شريط أفقي أسود؛ في تجويف الشم، في اتصال مع ظهارة الشم)، لاحظ الزيادة السريعة في النشاط (ينعكس في انحراف الإشارة المتكاملة) إلى ذروة في غضون حوالي ثانية واحدة من بداية التحفيز، تليها فترة من الإقامة (في حين أن التحفيز لا يزال موجودا)، والعودة إلى النشاط الأساسي بمجرد انتهاء التحفيز. تعتمد السعة المطلقة للاستجابة بشكل كبير على موضع القطب الكهربائي؛ إذا تم تسجيل استجابة السعة المنخفضة، حاول تغيير مواضع القطب الكهربائي. قد يكون الارتفاع الأبطأ إلى ذروة النشاط بسبب أنبوب تحمل المياه المحتوية على التحفيز إلى ظهارة الشم يجري وضعها بعيدا جدا عن ظهارة; محاولة تحريك الأنف أنبوب أقرب إلى (ولكن لا لمس) ظهارة. لاحظ أن، على النقيض من ذلك، لا تثير فارغة استجابة تذكر أو لا. وقد تشير الاستجابة الإيجابية الهامة (أي زيادة النشاط) إلى الفراغ إلى تلوث المياه المستخدمة في تخفيف المحفزات؛ صنع التخفيف الطازجة مع المياه النظيفة (والأواني الزجاجية) ينبغي حل هذا. وإذا لم يكن الأمر كذلك، فقد يكون من الضروري إجراء تنظيف أكثر شمولاً لنظام المياه (بما في ذلك مرشحات الفحم المنشط). وقد تشير الاستجابة السلبية (أي انخفاض النشاط) إلى حدوث تغير طفيف في معدل التدفق عند تبديل الصمام بسبب انسداد في الصمام مثلاً.

يظهر منحنى تركيز استجابة نموذجي (مرسوم شبه لوغاريتمي) ، في هذه الحالة إلى L-leucine (10^-7 M إلى 10^-3 M) ، في الشكل 5A. لاحظ أن زيادة تركيزات الرائحة تثير زيادات كبيرة بشكل متزايد في النشاط ، وبالتالي ، في اتساع الاستجابات المتكاملة. يظهر رسم البيانات المُطَوَّرة، وتراجعها الخطي المقابل، في الشكل 5B. ويمكن حساب العتبة المقدرة للكشف عن الانبعاثات من قيمة x عندما تكون y = 0.1761 (أي لوغاريتم1.5؛ حيث N = 0). في هذه الحالة، هذه القيمة هي -7.48; أي أن العتبة المحسوبة لـ L-leucine في هذه السمكة هي 10^-7.48 م. كما يمكن تقدير α الأسي من الانحدار الخطي للبيانات المُطَوَّرة على رسم سجل السجل؛ والبيانات 10 في المائة من المعطيات المُتّفق عليها في سجل المعطيات. سجلN = αlog [odorant] + ثابت. عامل γ ثم يعطي الزيادة في تركيز الرائحة اللازمة لزيادة سعة الاستجابة من قبل وحدة سجل واحد; وهذا هو، هو تقدير لاتحاد منحنى التركيز والاستجابة¹⁷. في هذا المثال، α = 0.277 و γ = 3.61؛ α = 3.61؛ α = 3.61؛ α = 3.61؛ α = 3.61؛ α = 3.61. لذلك، لزيادة سعة الاستجابة عشرة أضعاف (أي وحدة سجل واحدة؛ log10 = 1)، يجب زيادة تركيز التحفيز بمقدار 10^3.61أضعاف (4,074 أضعاف).

نموذجي السيني تركيز-منحنى الاستجابة (الشكل 6أ) عندما رسم شبه لوغاريتمكالي، في هذه الحالة إلى L-الجلوتامين، هو مبين في الشكل 6B. وينظر إلى زيادة مماثلة تعتمد على التركيز في سعة الاستجابة; ومع ذلك ، في أعلى تركيزات ، وهذه الزيادة يصبح أقل بحيث تصل سعة الاستجابة إلى حد أقصى (N_{الحد الأقصى).} يسمح هذا البيانات التي يمكن تركيبها على معادلة هيل المعلمة الثلاثة:

وبهذه الطريقة، يمكن حساب₅₀ EC (التركيز المُعَد الذي يتم فيه استحضار استجابة قصوى بنسبة 50٪) وCoal-efficient (مقياس لاتجاه انحدار انحدار الجزء الخطي من منحنى السيني).

الشكل 1: لقطة شاشة للبرنامج تظهر نافذة الإدخال من البرنامج CO2Calc. تم تمييز (المربعات الحمراء) هي الحقول المطلوبة لحساب معلمة الكربونات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: لقطة شاشة للبرنامج تظهر نافذة الإدخال للثوابت والوحدات والمقاييس المناسبة. وتوصى بالقيم المبينة للظروف التي أجريت فيها التجارب الموصوفة؛ قد تتغير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: لقطة شاشة للبرنامج تظهر نافذة النتائج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الردود النموذجية المتعددة الوحدات المسجلة خارج الخلية من العصب الشمي للدنيس في الجسم الحي استجابة لـ 10^-3 M L-serine (A) وفارغة (ب). تظهر الآثار العليا الاستجابات المتكاملة وآثار أقل تظهر إشارة (العصب) الخام. تم تطبيق المحفزات على ظهارة الشم (الحانات الأفقية). لاحظ الزيادة السريعة في النشاط خلال 1 s من التعرض، ذروة النشاط، تليها فترة من الإقامة (في حين كان لا يزال تسليم رائحة إلى ظهارة) والعودة إلى مستويات خط الأساس بمجرد توقف التسليم رائحة. وينظر إلى زيادة ضئيلة أو معدومة في النشاط بعد التحفيز مع الماء تعامل بنفس الطريقة التخفيفات odorant، باستثناء إضافة أي رائحة (فارغة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: منحنى التركيز والاستجابة النموذجي لL-leucine سجلت خارج الخلية من العصب الشمي في الجسم الحي. A)كما تركيز L-leucine تطبيقها على ظهارة الشم (أشرطة أفقية) يزيد من 10-7 M إلى 10-3 M، وينظر إلى زيادة متزامنة في النشاط في العصب.^{-7 -3} تظهر الآثار العليا الاستجابات المتكاملة وآثار أقل تظهر إشارة (العصب) الخام. (B)الانحدار الخطي (R² = 0.97) من البيانات المُتّحَمة شبه لوغاريتمياً لحساب عتبة الكشف كقيمة لللوغارتم [L-leucine] عند السجل(N + 1.5) = 0.1761 (أي، حيث N = 0). في هذا المثال، هذه القيمة هي -7.48; الحد الأدنى المقدر للكشف عن L-leucine في هذه الأسماك هو لذلك 10^-7.48 م. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: منحنى التركيز-الاستجابة النموذجي لL-الجلوتامين المسجل خارج الخلية من العصب الشمي في الجسم الحي. A) كما تركيز L-الجلوتامين المطبق على ظهارة الشم (أشرطة أفقية) يزيد من 10-7 M إلى 10-3 M، وينظر إلى زيادة متزامنة في النشاط في العصب.^{-7 -3} تظهر الآثار العليا الاستجابات المتكاملة وآثار أقل تظهر إشارة (العصب) الخام. (B) مخطط شبه لوغاريتمي من البيانات المُطَوَّرة التي تم تركيبها على معادلة تل ثلاثية البارامترات (R² = 0.99). على سبيل المثال،₅₀ EC المحسوبة = 3.11 μM، و هيل شارك كفاءة = 0.565). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تصف الدراسة الحالية استخدام تسجيل متعدد الوحدات (خارج الخلية) من العصب الشمي للدنيس البحري (S. aurata)، وهو sparid البحرية ذات الأهمية الكبيرة في تربية الأحياء المائية. ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا النهج التجريبي على نطاق واسع على الأسماك الأخرى؛ الجراحة والتنسيب الدقيق للأقطاب تعتمد بشكل واضح على تشريح نظام الشم ، واختيار وتركيز التخدير قد تعتمد على الأنواع قيد الدراسة. على سبيل المثال ، فإن العصب الشمي للسمكة الذهبية (Carassius auratus)قصير ؛ في هذه الحالة، تسجيل EEG من لمبة الشم سيكون أسهل. قد يعتمد اختيار الرائحة أيضًا ، إلى حد ما ، على الأنواع. واستخدمت الدراسة الحالية الأحماض الأمينية. بقدر ما يدرك المؤلفون ، جميع أنواع الأسماك التي تم التحقيق فيها حتى الآن لديها حساسية الشم للأحماض الأمينية^1،18. وقد تورط هذه الحساسية عمليات متنوعة مثل موقع الغذاء، والاتصالات الكيميائية والاعتراف مياه الولادة^{19،20،21،22،23}. ومع ذلك، فإن حساسيات الأنواع المختلفة، بشكل عام، متشابهة إلى حد ما ولا تعتمد على نمط الحياة أو الموئل. كما أنها جزيئات محددة جيداً وهي متاحة بسهولة ورخيصة. وهذه الأسباب تجعلها منبهات الاختبار المثالية للدراسات المتعلقة بنقش الشم في الأسماك، ولا سيما تلك التي تحقق في آثار الاضطرابات البشرية المنشأ (مثل التحمض أو التلوث)، حيث يمكن مقارنة النتائج بسهولة عبر الأنواع²⁴.

اعتمادا على الأنواع المعنية، يمكن أن تظل الاستعدادات للتسجيل متعدد الوحدات مستقرة لعدة ساعات؛ السعة استجابة للمعايير الداخلية^(10-3 M L-سيرين في الدراسة الحالية) لا ينبغي أن تختلف بأكثر من 10٪ بين الاختبارات المتعاقبة. ويمكن أن يكون أي انحراف هام عن هذه القاعدة الأساسية راجعاً إلى ما يلي: '1' حركة الأسماك، وبالتالي إلى إزاحة الأقطاب الكهربائية و/أو أنبوب الأنف؛ و(2) حركة الأسماك؛ و(2) إلى النزوح من الأقطاب الكهربائية و/أو أنبوب الأنف؛ و(2) نقل الأقطاب الكهربائية و/أو أنبوب الأنف؛ (2) حركة الأسماك؛ (2) حركة الأسماك؛ (2) نقل الأقطاب الكهربائية و/أو أنبوب الأنف؛ (2) حركة الأسماك؛ '2' تلوث المياه، مثلاً، من خلال ملامسة أيدي المجرب (خاصة إذا كانت تركيزات أقل من رائحة معينة تعطي استجابات أكبر من التركيزات الأعلى)؛ أو (3) تدهور صحة الإعداد. في حالة (ط)، ينبغي فحص الأسماك بعد أن انتقلت؛ إذا كان الأمر كذلك, إعادة وضعه, وإضافة المزيد من مخدر إلى الماء و / أو إعطاء جرعة أخرى من ثلاثية الغاليمين. السماح 5 دقيقة وإعادة اختبار المعيار. إذا كانت الاستجابة لا تزال أصغر، ثم إعادة وضع الأقطاب الكهربائية و / أو الأنف أنبوب حتى يتم تسجيل استجابة كبيرة بما فيه الكفاية. في حالة (2)، ببساطة طبعة جديدة سلسلة تخفيف جديدة من رائحة، وذلك باستخدام الأواني الزجاجية النظيفة والماء. في حالة (3) ، تحقق من أن تدفق المياه فوق خياشيم السمكة كاف ، وأن الماء يتدفق فوق الخياشيم (أي الخروج عن طريقopeلة ، بدلاً من الفم) ، والماء هوم جيدا. أنواع الأسماك المختلفة لها تفضيلات درجة حرارة مختلفة على نطاق واسع; ضمان أن المختبر) درجة الحرارة (وتلك المياه في اتصال مع الأسماك) هو أقرب إلى درجة الحرارة التي يتم الاحتفاظ بها الأسماك في قدر الإمكان. تأكد أيضاً من عدم شد الأسماك وتجنب نقلها (حتى من خزان إلى آخر) لمدة أسبوع على الأقل قبل التسجيل. الضوضاء الكهربائية، بطبيعة الحال، لعنة الحياة الكهربائية فيزيولوجيا; ومع ذلك، المقالة الحالية ليست وسيلة مناسبة لمناقشة كيفية التغلب على / تقليل هذا. ومع ذلك ، فإن 'دليل أكسون' (متاح بحرية كملف pdf للتنزيل من موقع الشركة المصنعة) هو مصدر للمشورة العملية بشأن تقليل الضوضاء. مرة واحدة يتم استحضار استجابة كبيرة ومستقرة من قبل التحفيز القياسية، وسلسلة تركيز يعطي زيادة تعتمد على التركيز في السعة، مع الحد الأدنى من الاستجابة للفارغة، يمكن أن تبدأ ردود التسجيل لاختبار المحفزات. بعض المؤلفين إعطاء نفس التحفيز ثلاث مرات، وحساب الوسط الحسابي لتحليل البيانات اللاحقة. ومع ذلك، هذه هي النسخ المتماثلات الفنية، وهذا الأسلوب سيزيد من الوقت الذي تستغرقه جلسة تسجيل بواسطة ثلاثة أضعاف. يفضل المؤلفون الحاليون اختبار رائحة معينة مرة واحدة ، ولكن دائمًا جزء من منحنى التركيز والاستجابة. وهذا لا يسمح بحساب عتبة الكشف أو₅₀ من EC (كما هو موضح)، بل يضمن أيضاً اختبار التركيزات القريبة من تلك التي قد تتعرض لها الأسماك في بيئتها الطبيعية (وهذا غير معروف دائماً). وعلاوة على ذلك، فإن أي ردود غير أكثر اتّراداً، بسبب التلوث مثلاً، أسهل في اكتشافها؛ ويمكن بعد ذلك أن تتكرر باستخدام عينة جديدة إذا لزم الأمر.

قد يكون التسجيل متعدد الوحدات من العصب الشمي غازيًا ، ولكنه أكثر حساسية من EOG عند تسجيله في مياه البحر⁷، لأنه مستقل عن الملوحة الخارجية. ولذلك يمكن استخدامه لتقييم حساسية الشم للروائح، مثل الكالسيوم والصوديوم، والتغيرات في تركيزات التي من شأنها أن تؤثر أيضا على الموصلية وبالتالي الفولتية^{المسجلة 15}. كتقدير لعدد من ORNs الاستجابة لرائحة معينة (أي، إمكانات العمل السفر على طول محاور ORN من ظهارة الشم إلى لمبة)، فإنه يمثل إشارة الخام، غير المجهزة (يبدأ المعالجة الأولية لمدخلات الشم في المصابيح). ولذلك، فمن أفضل معلمة لتقييم الآثار المباشرة للملوثات، مثل المعادن الثقيلة، والتغيرات البيئية، مثل رقم هئي، على نظام الشم من EOG أو EEG^24،25. التسجيل من لمبة الشم في مياه البحر مع ارتفاع PCO₂ (وبالتالي انخفاض درجة الH) قد تتأثر الآثار المركزية للثنحاس على المعالجة العصبية; 'GABA_A مستقبلات نظرية' من تحمض المحيطات²⁶، حيث الحد من درجة الحموضة في الماء يسبب إعادة توزيع كل^-- وHCO₃^-- أيون في CSF وما يترتب على ذلك من التحول من تنشيط GABAergic المثبطة (فرط الأقطاب) لالإثارة (depolarizing). وعلاوة على ذلك، من المهم في هذه الدراسات تقييم آثار التحمض أو الملوثات باستخدام تركيزات ذات رائحة مماثلة لتلك التي يحتمل أن تواجهها الأسماك في بيئتها الطبيعية. للأحماض الأمينية, وهذا هو في نانو إلى نطاق micromolar^27,28,,29; قريبة من عتبة الكشف عن هذه المركبات في الأسماك^1،18. تقدير عتبة الكشف عن رائحة معينة يمكن أن تعطي فكرة عن أهمية و / أو دور البيولوجية حساسية الشم. على سبيل المثال ، فإن المصباح البحري (Petromyzon marinus)لديه حساسية عالية من الشم إلى أحماض الصفراء المحددة التي تطلقها اليرقات وصولا الى عتبة 10^-13 م³⁰؛ هذه الحساسية تسمح للبالغين بتحديد مواقع وتحديد أراضي التفريخ المناسبة، وبالتالي تعمل كفيرمون مهاجر على مسافة طويلة. وبالمثل ، فإن لام lamprey الإناث الناضجة لديها حساسية عالية من الشم إلى الحيوانات المنوية (عتبة 10^-14 M) ، وهو بوليامين صدر في milt من قبل الذكور ، والتي تجذبهم بعد ذلك إلى أعشاش الذكور الحيوانات المنوية³¹. الأسماك الأخرى لديها حساسية الشم أيضا للبوليامينات^32,33,34,35, ولكن ليس مع عتبات منخفضة بما فيه الكفاية للكشف لدعم دور فيرومونية مماثلة; بدلا من ذلك، ويقترح تجنب الأسماك المتحللة. ومع ذلك، مع مثل هذه الحساسيات الشمية العالية، فمن الممكن أن نتصور أن انخفاض طفيف في الحساسية (أي زيادة في عتبة)، حتى عندما لا يتم تخفيض سعة الاستجابة بشكل كبير، يمكن أن يسبب مشاكل حادة للأسماك²⁴.

عندما رسم شبه لوغاريتموميلي، يمكن أن تكون منحنيات التركيز والاستجابة للروائح الأسية، الخطية أو السيني^18. في حالة الأحماض الأمينية، مثل هذه المنحنيات تركيز الاستجابة شبه لوغاريتمي إما خطية (أي لوغاريتمي) ، وظائف السيني أو السلطة^7. أن لا يُرى أي تشبع في الاستجابة (أي لا توجد هضبة في منحنى التركيز والاستجابة، حتى في التركيزات فوق البيئية) ربما يرجع ذلك إلى العديد من المستقبلات الملزمة للأحماض الأمينية الفردية، اعتماداً على تركيزها، بدلاً من كل حمض أميني ملزم لمستقبلات محددة؛ كما يزيد تركيز الأحماض الأمينية معينة, المزيد من المستقبلات قادرة على ربطه وبالتالي الاستجابة. ومع ذلك, يمكن للأسماك التمييز بين خليط من الأحماض الأمينية^36,37,38,39; هذا من المحتمل أن يكون نتيجة لأنماط الجمع بين النشاط التي أثارتها في المصابيح الشمية^12,40; محاور من جميع ORNs التعبير عن نفس البروتين مستقبلات إنهاء في نفس glomeruli في المصابيح الشم^41،42، ويمكن واحد من الأحماض الأمينية تنشيط أكثر من glomerulus واحد.

ومع ذلك، قد الروائح محددة للغاية، مثل الفيرومونات، استحضار منحنيات تركيز الحساسية السيني أو شبه السينيانية^43،44. والاستنتاج، على الرغم من عدم اختبار تجريبي، هو أن هذه الاستجابات الشمية هي بسبب مستقبلات محددة للغاية التي تربط جزيء الفيرومون والقليل آخر. لذلك، فوق تركيز معين، يتم احتلال جميع المستقبلات، وسوف تستثير زيادات أخرى أي ردود أخرى في ORNs الأخرى. لذلك، يمكن تركيب هذه البيانات على مؤامرة هيل ثلاثة معلمة، والاستجابة القصوى، EC₅₀ هيل وتكفّل يمكن حساب^15،45،46. وهذا يمكن أن يعطي معلومات قيمة، مثل التقارب الظاهري وعدد مستقبلات ظاهرة، أن منحنيات التركيز والاستجابة الأسي أو الخطية أو الأسية لا يمكن أن تعطي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC pre-amplifier	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL104	Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording.
Digidata	Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA)	1440A	Analogue-digital converter.
EMG Integrator	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL703	Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve.
Faraday cage	Made in-house		To reduce electrical noise.
Filter	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL125/6	Filter module for electrophysiological recording.
Gallamine triethiodide	Sigma-Aldrich (Portugal)	G8134	Neuromuscular blocker
L-glutamine	Sigma-Aldrich (Portugal)	G3126	Amino acid used as odorant
L-leucine	Sigma-Aldrich (Portugal)	L80000	Amino acid used as odorant
L-serine	Sigma-Aldrich (Portugal)	S4500	Amino acid used as odorant
Metalic base-plate	Any		Provides base for micro-manipulators.
Micro-hematocrit tubes	Any		To position water supply to the olfactory epithelium
Micro-manipulators	Narishige International Ltd (London, UK)	M-152	Position electrodes
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich (Portugal)	E10505	Anesthetic
pH probe	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI12302	Probe to measure pH of water.
Refractometer	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI96822	Refractometer to measure water salinity
Sodium chloride	Sigma-Aldrich (Portugal)	746398	For saline solution
Solenoid valves	The Lee Co. (Essex, CT, USA)	LFAA1201618H	For switching between background water and stimuus solutions (no longer available)
Stereo-microscope	Zeiss, Leica, Olympus	Any suitable model.	For dissection and placement of electrodes.
Titrator	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI84531	Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature.
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ	World Precision Instruments (Hitchin, UK)	TM31A10	Extracellular electrodes.
Valve Driver	Made in-house		12 V DC source for operating solenoid valves.
Water pump (submersible)	Any		To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish.