特勒奥茨的嗅觉神经的细胞外多单元记录

摘要

来自嗅觉神经的细胞外多单元记录是一种敏感、健壮和可重复的方法，用于评估海洋鱼类的嗅觉敏感性。它记录主要的感官输入，独立于外部盐度。

摘要

最近的研究表明，海洋酸化会影响鱼类的嗅觉驱动行为。这可能是由于高P CO_2/低pH水的嗅觉敏感性降低。为了评估海洋酸化或嗅觉敏感性对海洋鱼类的影响，我们建议从嗅觉神经进行细胞外多单元记录是首选方法。虽然具有侵入性，但它具有敏感、坚固、可重复性和独立于外部盐度（例如，与电-生物图 [EOG]不同）。此外，在进行任何集中处理之前，它记录了对 CNS 的主要感官输入。我们表明，这种方法可以显示嗅觉敏感性的降低，既是暂时的，又与气味相关，使用一系列氨基酸来构造浓度-反应曲线并计算检测阈值。

引言

鱼类在生活的许多方面都严重依赖动物，包括寻找食物、避开食肉动物、评估潜在的配偶和迁徙^{,等1、2、3。213}因此，评估鱼的嗅觉敏感性（它们的气味是什么？它们对于这些化合物有多敏感？）充分了解这些过程至关重要。此外，人为影响对环境的影响，如海洋酸化和污染，可能对嗅觉系统产生深远的影响，即使在亚致命水平，因为它必然与周围的水^{亲密接触4。}体内电生理学是评估鱼类嗅觉敏感性的实验方法。有三种主要技术可用:电声像（EOG），脑电图（EEG），从嗅球记录，多单元记录从嗅觉神经⁵。

EOG是这三个6中应用^{最广泛的。}它是一个直接电流（DC）场电位记录在嗅觉上皮之上，被认为是这些嗅觉受体神经元（ORN）对给定气味反应的总结发生器电位。然而，由于它记录在水中，而不是在鱼体内，反应的幅度不仅取决于鱼产生的信号，还取决于周围水的电导率;电导率越高（或电阻越低），振幅越低。这可能意味着EOG在海水中比淡水^{7更不敏感}。

从嗅球记录下来的EEG也广泛用于调查鱼类的嗅觉。然而，嗅球是嗅觉感官输入的一阶处理中心^8;它高度组织成球状，因此记录的响应在很大程度上取决于记录电极的位置。例如，从 ORN 检测氨基酸的输入由嗅球的侧部区域中的 glomeruli 处理，而来自特异性衍生的化学物质的输入则指向中语言区域 9、10、11、12。^9,10,11,12信息素输入可定向到嗅球内高度本地化的球状。也取决于有关物种的解剖结构，给定气味剂的理想记录位置可能不容易到达。

来自嗅觉神经的多单元记录可以规避上述 EOG 和 EEG 的主要问题。因为它记录从上皮到灯泡的 ORN 轴下传递的操作电位，它是一个主要的感官信号。由于它记录在鱼体内，响应的幅度与外部盐度无关。然而，它当然有一些缺点。首先，根据物种的解剖结构，需要更广泛的手术来暴露嗅觉神经比EOG。其次，由于信号比EOG小，它需要稍微复杂一点的设备，因此成本高。约翰·卡普里奥5对其他实验方法进行了^{一般性描述}。本文的目的是概述如何记录从体内海脑嗅神经（Sparus aurata）到氨基酸气味剂的细胞外多单元反应作为该技术的一个例子，以及如何识别和克服在此类实验中遇到的一些更常见的问题。

研究方案

在经过认证的实验设施中进行了动物维护和试验，并遵循葡萄牙国家立法（DL 113/2013），由葡萄牙农业、农村发展和渔业部兽医总局颁发"第1组"许可证。由于该协议涉及动物处理，它必须得到地方和/或国家机构的批准，该机构管理科学实验中使用的动物的福利，此外，研究人员需要有适当的培训和许可证来执行此类程序。

1. 刺激准备

注:大多数鱼都有高度敏感的嗅觉系统，因此在准备实验中使用的嗅觉刺激时必须小心。用于制造刺激的玻璃器皿应用5%的漂白剂（次氯酸钠）清洗，用自来水彻底冲洗并干燥。使用前，立即用海水彻底冲洗玻璃器皿（与用于刺激稀释的水相同）。注意这些水没有接触裸露的皮肤。

1. 制造100 mL的^10-2M L-谷氨酰胺、L-柳辛和L-塞林;在-20°C下储存1 mL等分，直到使用。
2. 在实验当天，利用控制和高_CO2海水，从这些等分，10-3 M^至10-7 M溶液（以x10稀释的步骤）进行准备。^-3
   注:L-塞林^（10-3 M）将用作正控或标准。水用于弥补刺激的稀释，并处理方式完全相同，刺激，但没有添加任何气味，将用作负控制或空白。

2. 控制和高_CO2水的准备

1. 收集1升木炭过滤的海水，准备控制水。
   1. 使用 pH 探头检查 pH 值;它应该在 8.2 左右。如果没有，则用大气气泡，直到达到此 pH。
   2. 使用碱性滴定器测量水的碱度。
   3. 测量水温和盐度。
2. 通过过滤1L海水来准备高_CO2 水，然后冒泡_CO2， 直到达到所需的pH值。
   1. 使用 pH 探头检查 pH 值;它应该在 7.7 左右。
   2. 使用碱性滴定器测量水的碱度。
   3. 测量水温和盐度。
3. 使用设计用于_{计算水中 CO 2}参数的软件（例如_CO2Calc软件^13）确定控制水中和高 CO2 水中的 CO 2 压力。₂
   1. 在输入窗口中添加水pH值、温度、盐度和总碱度（图1）。
   2. 选择常量、单位和比例（参见图 2 中的建议值）。
   3. 按按钮过程 以确定 CO₂ 压力。
      注 :图 3 显示了结果表的示例。

3. 鱼的准备

注:本协议使用200~400克的海布。

1. 在含有MS222（乙基-3-氨基苯甲酸盐甲烷硫化盐）的加气天然海水中对鱼进行麻醉。当对尾部挤压的反应停止时，将神经肌肉阻滞剂三乙酰胺（生理盐水中^10mg=kg-1） 注射到侧翼肌肉中。
   注:麻醉剂的浓度因物种而异;对于 200~400 克的海布里姆，使用 200 毫克。^L-1 缓冲 400 mg+^L-1 纳赫科₃.
2. 将麻醉鱼放在缓冲支撑上。确切的形状和大小取决于模型物种;对于海布（200~400克），使用衬垫V形支撑，在内部制造。
3. 将硅管（直径 = 10 mm）放在口中，将硅管连接到含麻醉剂、加气海水储液罐中的潜水泵，并在 ±100 mL=min^{-1 ±kg-1}的刺上^泵送水泵。
   注:使用的硅管的大小将取决于鱼的大小。
4. 将接地销插入侧翼肌肉，并将其连接到放大器的头部阶段）。
5. 用湿布（或纸巾）盖住鱼，只露出头部，确保覆盖物不会妨碍水从刺中退出。
   注:眼睛可以覆盖湿纸/布片或黑色塑料片。
6. 将刺激输送系统的管子（即连接到背景海水供应的玻璃管）放入鼻孔。
   注:可以使用微血管（长度 = 75 mm，ID = 1.15 mm，OD = 1.55 mm）;这些可以拉到电极拉拔器上的更精细点，用于较小的鱼。在手术过程中确保嗅觉上皮保持湿润非常重要（如下所述）。
7. 在解剖显微镜下（法拉第笼内）下，借助牙科（理想）或爱好（例如，Dremel）钻头或珠宝商的抛光机（带牙科钻头），去除眼睛之间的头骨的皮肤和骨骼（嗅觉神经通常在眼睛之间一起运行）来暴露嗅觉神经。
   1. 在海带中，用圆锯将头骨的一部分从前到眼睛，从后脑切出。然后，使用钻头，取出眼睛之间的骨骼;嗅觉神经位于眼睛之间。
8. 一旦清除足够的骨骼，用细钳去除脂肪和结缔组织，覆盖神经;注意不要损伤神经或刺穿任何血管。
   注:经验将有助于完善解剖;解剖越小，准备越稳定。然而，必须清除足够的组织;对于没有经验的，当嗅觉灯泡只是可见，清除稍微更前，以暴露部分的神经，因为他们加入灯泡，以允许电极的正确定位。
9. 在使用前清洁电极，将电极连接到 3V 直流源的负极（例如，两个 AA 电池系列），并将尖端置于生理盐水中（或在淡水中稀释 1:3）20~30 s;应看到来自尖端的稳定小气泡流。
10. 一旦嗅觉神经暴露，插入记录电极（固定在微操纵器上）的位置，给予对标准的最大响应（例如，10^-3 M L-丝氨酸），并尽可能少地响应空白。使用连接到交流电 （AC） 前体Table of Materials头级的二甲苯涂层钨电极（材料表）。
    注:在海脑中，对氨基酸的最强烈反应通常与放置在神经侧侧的电极一起，靠近它连接嗅觉球的位置。这可能适合其他物种，因为球茎的球状组织在物种中大致相似。然而，经验总是最好的老师。

4. 电生理记录

注:与大多数电生理学一样，多单元记录需要在法拉第笼内进行。但是，细胞外记录通常不需要防振表;大多数运动将来自鱼。然而，需要一个坚固、稳定的表，需要金属表面来固定微型机械支架的磁性底座。

1. 建立一个刺激输送系统，允许从干净的背景水快速切换到含刺激的水，例如，通过使用电磁阀操作的三向阀。将公共出口连接到带水的管子，将一条线放在海水蓄水池中，另一条线在测试溶液中。
   注:当阀门切换时（通过直流电流），水流从背景水切换到含有异味的水。刺激措施的出台时间应足够长，以见综合应对的明显峰值，然后是一段一段的妥协期;当前协议中使用的时间是 4 s，但可能需要较长的时间，具体取决于物种。
2. 将阀门驱动器连接到模拟数字转换器的触发器（例如 Digidata）;当阀从背景切换到包含刺激的管路时，这将开始记录数据。配置软件以在触发事件开始录制，并在预定期间（例如 10 s）继续录制。
   注:十秒应该足够了，但是根据实验问题，这可以缩短或延长。
3. 在这种情况下，通过测试（记录和测量集成响应的振幅）反复检查制备的稳定性，在这种情况下，使用 10^-3 M L-Serine，并允许在连续刺激之间经过 1 分钟。
   注:在一定程度上取决于物种和气味，响应的振幅应在彼此的10%以内（根据经验法则），并且应该有一个快速的开始，上升到最大活性，并在刺激不存在后返回到基线（图4）。
4. 记录控制海水中氨基酸的嗅觉神经反应（从最低浓度到最高浓度），并允许连续刺激之间1分钟。
   注:对于某些物种和/或一些气味剂，可能需要更多的时间。但对于氨基酸和海布里安，1分钟就足够了。
5. 记录对 10^-3 M 衬线的响应和控制水空白溶液。
6. 将背景水从控制海水转变为高_CO2 海水，将背景线放入具有高_CO2 海水的瓶子中。
   注:建议在刺激线和背景线的末端插入另一根造血管（或等值的），以避免接触水，并确保管的末端留在水中。
7. 在测试嗅觉神经对高_{CO2海水中氨基酸的反应之前，} 通过跟随高_CO2 水在嗅觉上皮上几分钟，用_高CO2 水对嗅觉上皮进行条件。
   注:经验表明，对于海布，5分钟就足够了。
8. 记录高_CO2 海水中氨基酸的嗅觉神经反应（从最低浓度到最高浓度）。
9. 记录对高 CO_{2 水空白} 溶液的响应。
10. 记录对 10^-3 M 衬线的响应和控制水空白溶液。
    注:原始信号（神经活性）应进行过滤（低通约2，000~5，000赫兹，高通50~300赫兹），并传递到模拟数字转换器（材料表）。为了更容易量化神经活动，原始信号也可以使用泄漏的集成器（材料表）进行集成，并传递给模拟数字转换器，并从那里将原始信号和集成信号传递给运行相应软件的计算机（例如，Axoscope）。

5. 数据分析

1. 从所有刺激的集成响应的振幅中减去对空白（以 mV） 的集成响应的振幅。
2. 通过除以先前对标准响应的振幅（10^-3 M 衬素）来对刺激的响应进行标准化;这减少了鱼间和鱼内部的变异性。
3. 根据公式日志（N = 1.5） =对数 C = B，其中 C 为摩尔浓度，N为规范化响应振幅a，a和b是常^{数 7，14，,14}通过浓度-响应曲线的线性回归计算检测阈值。
   注: 检测阈值是 x 的值，其中 y = 0.1761（即日志 1.5;N = 0）;反应的浓度（即，鱼可以闻到它的味道）。一些气味在绘制半对数时会引发西格莫德浓度-响应曲线（例如，^{钙15，16;,16}在这种情况下，规范化数据可以安装在三参数 Hill 图中，该图将给出最大响应振幅和 EC_50（即提供半最大响应的 [气味];也可以测量灵敏度）。
4. 比较检测阈值和/或最大响应幅度，以及在控制水中测试的 EC₅₀ 刺激值和高 CO₂ 水中测试的刺激阈值。

结果

对正控制的典型响应（10^-3 M L-塞林; 图4A）和负控（空白; 图4B） 从海布的嗅觉神经记录在图4 中。在刺激（黑色水平杆;在嗅觉腔中，与嗅觉上皮接触）存在的情况下，注意活动迅速增加（反映在综合信号的向上偏转）在刺激开始约一秒内达到峰值，然后是一段时间的均等（刺激仍然存在），一旦刺激结束，将恢复基线活动。响应的绝对振幅高度依赖于电极位置;如果记录低振幅响应，请尝试更改电极位置。上升到峰值活动的速度较慢，可能是由于管子将含有刺激的水携带到嗅觉上皮，而该管子被放置在离上皮太远的地方;尝试将鼻管移近（但不得接触）上皮。请注意，相比之下，空白会引起很少或没有响应。对空白有显著的积极反应（即活性增加）可能表明用于稀释刺激的水受到污染;用清水（和玻璃器皿）进行新鲜的稀释应该解决这个问题。如果没有，可能需要对水系统（包括活性炭过滤器）进行更彻底的清洁。负响应（即活动减少）可能表示当阀门由于阀门堵塞而切换时，流量略有变化。

图 5 A 显示了典型的浓度-响应曲线（按半对数绘制），本例中为 L-leucine（10^-7 M 至^10-3 Figure 5M）。请注意，气味浓度的增加会引起活动量的越来越大，因此，在综合反应的振幅中。规范化数据的绘图及其相应的线性回归如图5B 所示。当 y = 0.1761（即 log1.5;其中 N = 0）时，可以从 x 的值计算估计的检测阈值。 x在这种情况下，此值为 -7.48;也就是说，这种鱼中L-leucine的计算阈值为^10-7.48 M。指数 = 同样可以从日志图上规范化数据的线性回归进行估计;日志N = =log = 气味 = 常数。然后，该因子 = 提供增加一个对数单元响应幅度所需的气味浓度;也就是说，它是浓度-响应曲线17的陡度^的估计值。在此示例中，= = 0.277 和 = = 3.61;因此，要将响应幅度增加十倍（即一个日志单元;日志10 = 1），刺激浓度需要增加 10^3.61倍（4，074 倍）。

图 6 B 所示，在半A对数图绘制时（本例中为 L-谷氨酰胺）为典型的西格莫德浓度-响应曲线（图6A）。类似的浓度依赖性增加的响应幅度被看到;然而，在较高的浓度下，这种增加变得不那么，使响应振幅达到最大值（N_最大值）。这允许将数据拟合到三个参数希尔方程:

这样，_{可以计算EC 50（} 引起50%最大响应的异味浓度）和希尔共同效率（测量西莫体曲线线性部分的斜率）。

图 1:显示程序 CO2Calc 输入窗口的软件屏幕截图。 突出显示（红框）是碳酸盐参数计算所需的字段。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:显示相应常量、单位和比例的输入窗口的软件屏幕截图。 对于进行所述实验的条件，建议显示值;他们可能会改变。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:显示结果窗口的软件屏幕截图。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:典型的多单位反应记录从体内海布雷姆的嗅觉神经对^10-3 M L-丝氨酸（A）和空白（B）的反应。 上部轨迹显示集成响应，下线显示原始（神经）信号。刺激应用于嗅觉上皮（水平杆）。请注意，在暴露期间，活动迅速增加，活动高峰期，然后是一段住宿期（而气味仍被送到上皮），一旦气味的输送停止，将恢复基线水平。在以与气味稀释剂相同的方式处理水后，在刺激下，除了添加任何气味剂（空白）外，活性很少或没有增加。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:L-leucine的典型浓度反应曲线从体内嗅觉神经中以细胞外体记录。 （A） 当应用于嗅觉上皮（水平棒）的L-leucine浓度从^10-7 M^{增加至10-3} M时，神经中的活动随之增加。上部轨迹显示集成响应，下线显示原始（神经）信号。（B） 线性回归 （R² = 0.97） 的规范化数据绘制半对数，以计算检测阈值为日志（N = 1.5） = 0.1761 （即 N = 0） 时对数值的值。在此示例中，此值为 -7.48;因此，该鱼中L-leucine的检测估计阈值为^10-7.48 M。请点击这里查看这个数字的较大版本。

图6:L-谷氨酰胺的典型浓度反应曲线从体内嗅觉神经中记录细胞外。 （A） 当应用于嗅觉上皮（水平棒）的L-谷氨酰胺浓度从^10-7 M^{增加至10-3} M时，神经中的活动随之增加。上部轨迹显示集成响应，下线显示原始（神经）信号。（B） 拟合三参数希尔方程（R 2 =^{0.99）的规范化} 数据的半对数图。对于此示例，计算的 EC₅₀ = 3.11 μM，和 Hill 共同效率 = 0.565）。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

目前的研究描述了使用多单位（细胞外）记录从嗅觉神经的海布雷姆（S.aurata），在水产养殖中非常重要的海洋痉挛。然而，这种实验方法可以广泛地应用于其他鱼类;电极的手术和精确放置显然取决于嗅觉系统的解剖结构，麻醉剂的选择和浓度可能取决于所研究的物种。例如，金鱼的嗅觉神经（卡拉西乌斯光环） 是短的;在这种情况下，从嗅觉灯泡录制 EEG 会更容易。异味剂的选择也可能在某种程度上取决于该物种。目前的研究使用了氨基酸。据作者所知，迄今为止调查的所有鱼类物种对氨基酸^{1，18都有嗅觉敏感性}。这种敏感性被牵连到不同的过程，如食物位置，化学通信和识别出生水19，20，21，22，23。^{19,20,21,22,23}然而，从广义上讲，不同物种的敏感性相当相似，不依赖于生活方式或栖息地。它们也是定义良好的分子，价格低廉，易于获得。这些原因使得它们成为研究鱼类的奥夫行动的理想测试刺激因素，特别是那些研究人为干扰（如酸化或污染）影响的人为干扰影响，在²⁴个物种中很容易比较结果。

根据有关物种的不同，多单元记录的准备可以保持稳定几个小时;对内部标准（当前研究中为 10^-3 M L-serine）的响应幅度在连续测试之间不应超过 10%。任何重大偏离这一经验法则的原因可能是:（一） 鱼的移动，因此电极和/或鼻管的位移;（二） 鱼的运动，因此，电极和/或鼻管的位移;（三） 鱼的移动，因此，鱼的电位。（六） 鱼的移位。（六）鱼的移位。（六） 鱼的移位。（六）鱼的移位。（六）鱼的移位。（六）鱼的移率（二） 水污染，例如接触实验者的手（特别是如果给定气味的浓度较低，反应大于浓度高）;或（三） 准备的健康状况恶化）。万一（一）应检查鱼是否移动;如果是这样，重新定位它，并添加更多的麻醉剂到水中和/或给另一剂胆胺三乙酰胺。请用 5 分钟重新测试标准。如果响应仍然较小，则重新定位电极和/或鼻管，直到记录到足够大的响应。万一（ii），只需使用干净的玻璃器皿和水，重拍一系列新的稀释剂。在万一的情况下（iii），检查鱼刺的水流是否充足，水是否流过鱼刺（即通过手术器，而不是嘴流出），水是否良好。不同的鱼种有广泛的温度偏好;确保实验室温度（以及与鱼接触的水的温度）尽可能接近鱼的温度。也确保鱼没有压力，并避免在记录前至少一周（甚至从一个水箱移动到另一个水箱）。当然，电噪声是电生理学家生命的一种小菜;然而，本文不是讨论如何克服/减少这一点的适当媒介。然而，《Axon 指南》（可免费作为 pdf 从制造商网站下载）是有关噪音最小化的实用建议来源。一旦标准刺激引起大而稳定的响应，浓度序列的振幅就具有浓度相关性，对空白的反应最小，就可以开始对测试刺激做出记录反应。一些作者给出相同的刺激三次，并计算算法均值，以便进行后续数据分析。但是，这些是技术复制，此方法将增加录制会话需要三倍的时间。当前作者喜欢测试给定的异味剂一次，但始终是浓度-响应曲线的一部分。这不仅允许计算检测阈值或EC_50（ 如所述），而且确保接近鱼类在其自然环境中体验的浓度得到测试（这并不总是已知的）。此外，任何异常值响应，例如，由于污染，更容易发现;然后，如有必要，可以使用新鲜制作的样品重复这些样品。

来自嗅觉神经的多单位记录可能是侵入性的，但它比在海水⁷中记录的EOG更敏感，因为它与外部盐度无关。因此，它可以用来评估嗅觉对气味剂，如钙和钠的敏感性，其浓度的变化也会影响电导率，因此电压记录^为15。作为对给定气味反应的 ORN 数量的估计（即，从嗅觉上皮到灯泡沿 ORN 轴线传输的动作电位），它表示一个原始的、未处理的信号（嗅觉输入的初始处理从灯泡开始）。因此，与EOG或EEG^24、25，评估污染物（如重金属）和环境变化（如pH值）对嗅觉系统的^{直接影响，}是一^{个更好的参数}。在具有高P CO_2（因此低pH）的海水中从嗅球记录可能会受到pH对神经处理的中央效应的影响;海洋酸化的_{"GABA A}受体^{理论"，即}水pH值的降低导致CSF中^Cl-和_HCO3-^-离子的再分配，以及随之而来的GABAergic活化从抑制（超极化）向兴奋性（去极化）的转变。此外，在这类研究中，必须使用与鱼类在其自然环境中可能遇到的类似气味浓度的酸化或污染物来评估其影响。对于氨基酸，这是在纳米到微摩尔范围^{27，28，29;,2927,}接近在鱼^{1，18中检测这些化合物的阈值}。估计给定气味的检测阈值可以给出嗅觉敏感性的重要性和/或生物作用。例如，海灯（Petromyzon Marinus）对幼虫释放的特定胆汁酸具有高嗅觉敏感性，最低阈值为^10-13 M^30;这种敏感性使成年人能够找到和识别合适的产卵地，因此在远距离上充当迁徙信息素。同样，成熟的雌性海灯对精氨酸（阈值^10-14M）有很高的嗅觉敏感性，这是雄性在密耳中释放的多胺，然后吸引它们到精子雄性^31的巢。其他鱼类对多胺^{32、33、34、35,34,35}也有嗅觉敏感性，但检测阈值不够低，无法支持类似的信息素作用;^32,相反，建议避免腐烂的鱼。然而，在嗅觉敏感度如此之高的情况下，可以设想，敏感度略有下降（即阈值增加），即使响应幅度没有显著降低，也可能给^{鱼类带来严重问题}。

当绘制的半对数时，与气味剂的浓度-响应曲线可以是指数、线性或西莫^{体 18}。就氨基酸而言，这种半对数浓度-响应曲线是线性的（即对数曲线）、西莫体曲线或功率函数⁷。反应没有饱和（即浓度-反应曲线没有高原，即使在超环境浓度下）可能是由于几个受体与单个氨基酸结合，取决于其浓度，而不是每个氨基酸与特定受体结合;随着给定氨基酸浓度的增加，更多的受体能够结合它，从而作出反应。然而，鱼可以区分氨基酸的混合物36，37，38，39;^36,37,38,39这可能是由于在嗅球^12，40,中唤起的组合^活动模式;所有表示相同受体蛋白的 OR 的轴子在嗅球^41、42中终止^在同42一球蛋白处，一个氨基酸可以激活多个球状体。

然而，高度特异性的异味剂，如信息素，可能会引起西格莫德或准西格莫德浓度反应曲线^{43，44。43,}推论，虽然没有经验测试，是这些嗅觉反应是由于高度特异性的受体结合信息素分子和很少其他。因此，在给定浓度之上，所有受体被占用，进一步增加将引发其他 ORN 的进一步反应。因此，这些数据可以安装在三参数希尔地块上，最大响应，EC₅₀和希尔共同效率可以计算15，45，46。^15,45,46这可以提供有价值的信息，如明显的亲和力和明显的受体数，线性或指数浓度反应曲线不能提供。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC pre-amplifier	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL104	Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording.
Digidata	Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA)	1440A	Analogue-digital converter.
EMG Integrator	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL703	Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve.
Faraday cage	Made in-house		To reduce electrical noise.
Filter	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL125/6	Filter module for electrophysiological recording.
Gallamine triethiodide	Sigma-Aldrich (Portugal)	G8134	Neuromuscular blocker
L-glutamine	Sigma-Aldrich (Portugal)	G3126	Amino acid used as odorant
L-leucine	Sigma-Aldrich (Portugal)	L80000	Amino acid used as odorant
L-serine	Sigma-Aldrich (Portugal)	S4500	Amino acid used as odorant
Metalic base-plate	Any		Provides base for micro-manipulators.
Micro-hematocrit tubes	Any		To position water supply to the olfactory epithelium
Micro-manipulators	Narishige International Ltd (London, UK)	M-152	Position electrodes
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich (Portugal)	E10505	Anesthetic
pH probe	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI12302	Probe to measure pH of water.
Refractometer	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI96822	Refractometer to measure water salinity
Sodium chloride	Sigma-Aldrich (Portugal)	746398	For saline solution
Solenoid valves	The Lee Co. (Essex, CT, USA)	LFAA1201618H	For switching between background water and stimuus solutions (no longer available)
Stereo-microscope	Zeiss, Leica, Olympus	Any suitable model.	For dissection and placement of electrodes.
Titrator	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI84531	Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature.
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ	World Precision Instruments (Hitchin, UK)	TM31A10	Extracellular electrodes.
Valve Driver	Made in-house		12 V DC source for operating solenoid valves.
Water pump (submersible)	Any		To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish.