تحريض كامل من إصابة الحبل الشوكي من نوع الترانصيب في الفئران

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء عملية استئصال لامينكومي دقيقة للتحريض على إصابة الحبل الشوكي المستقرة من نوع الترانسكشن في نموذج الماوس ، مع الحد الأدنى من الأضرار الجانبية لأبحاث إصابة الحبل الشوكي.

Abstract

إصابة الحبل الشوكي (SCI) يؤدي إلى حد كبير إلى فقدان لا رجعة فيه ودائمة من وظيفة, الأكثر شيوعا نتيجة للصدمة. ويجري البحث في العديد من خيارات العلاج، مثل طرق زرع الخلايا، للتغلب على الإعاقات المنهكة الناشئة عن SCI. وتجري معظم التجارب قبل السريرية الحيوانية في نماذج القوارض من SCI. في حين أن نماذج الفئران من SCI قد استخدمت على نطاق واسع ، فقد تلقت نماذج الماوس اهتمامًا أقل ، على الرغم من أن نماذج الماوس يمكن أن يكون لها مزايا كبيرة على نماذج الفئران. ويعادل صغر حجم الفئران تكاليف صيانة الحيوانات أقل من الجرذان، كما أن توافر العديد من نماذج الماوس المعدلة وراثياً مفيد لأنواع عديدة من الدراسات. إن الحث على الإصابة المتكررة والدقيقة في الحيوانات هو التحدي الرئيسي لأبحاث SCI ، والتي تتطلب في القوارض الصغيرة جراحة عالية الدقة. كان نموذج الإصابة من نوع النقل نموذج إصابة شائع الاستخدام على مدى العقد الماضي للأبحاث العلاجية القائمة على الزرع ، ومع ذلك لا توجد طريقة موحدة لحث إصابة كاملة من نوع الترانصيب في الفئران. لقد قمنا بتطوير بروتوكول جراحي لحفز إصابة نوع نقل كامل في الفئران C57BL/6 في المستوى الفقري الصدري 10 (T10). يستخدم الإجراء حفر طرف صغير بدلاً من الارونجروس لإزالة اللامينا بدقة ، وبعد ذلك يتم استخدام شفرة رقيقة مع حافة قطع مستديرة للحث على نقل الحبل الشوكي. هذه الطريقة تؤدي إلى الإصابة من نوع النقل القابلة للتكاثر في القوارض الصغيرة مع الحد الأدنى من الأضرار العضلية والعظمية الجانبية وبالتالي تقلل من العوامل المحيرة ، وتحديدًا حيث يتم تحليل النتائج الوظيفية السلوكية.

Introduction

إصابة الحبل الشوكي (SCI) هي مشكلة طبية معقدة تؤدي إلى تغييرات جذرية في الصحة ونمط الحياة. لا يوجد علاج لـ SCI ، ولا يتم فهم الفيزيولوجيا المرضية لـ SCI تمامًا. نماذج SCI الحيوان، ولا سيما نماذج القوارض، تقدم أداة لا تقدر بثمن لتجربة العلاجات الجديدة، وقد استخدمت لاستكشاف SCI لعقود. حتى الآن، أكثر من 72٪ من الدراسات قبل السريرية SCI استخدمت نماذج الفئران، بالمقارنة مع مجرد 16٪ التي استخدمت الفئران¹. على الرغم من أن الفئران ، بسبب حجمها الأكبر وميلها إلى تشكيل تجاويف أقرب إلى SCIs البشرية ، كانت تقليديا الحيوانات النموذجية المفضلة لدراسة المناهج العلاجية الجديدة ، فإن الفئران (بما في ذلك العديد من النماذج الماوس المعدلة وراثيا) تستخدم الآن بشكل أكثر تواترا لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية من SCI². ويقدم نموذج الماوس فوائد إضافية من حيث سهولة التعامل مع الفئران، ومعدلات إنجاب أسرع، وتكاليف أقل من الفئران؛ الفئران أيضا يحمل درجة عالية من التشابه الجينومي مع البشر^1،2،3. وقد تم تحديد العيب الرئيسي لنموذج الماوس على أنه حجم أصغر بكثير يخلق تحديات للتدخلات الجراحية لخلق وعلاج إصابات الحبل الشوكي^4,5.

هناك فجوة في المؤلفات الموجودة التي تسلط الضوء على الحاجة إلى بروتوكول جراحي قوي ويمكن استنساخه للحث على استقرار SCI في نموذج الماوس. لذلك، نحن نقدم نهجا جراحية جديدة ودقيقة في هذا البروتوكول للتغلب على هذه القيود. يوفر هذا البروتوكول مبادئ توجيهية متعمقة للحث على إصابة من نوع النقل في الفئران ، حيث تم التعرف على هذا النوع من الإصابة ليكون الأنسب لدراسة التغيرات التجديدية والتنكسية بعد الإصابة⁶، وكذلك المرونة العصبية والدوائر العصبية وهندسة الأنسجة⁷. لقد اخترنا للحث على الإصابة في المنطقة الصدرية السفلى، منذ يستخدم SCI المستوى الصدري الأكثر شيوعا في الأدب¹.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات بموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة غريفيث (ESK/04/16 AEC و MSC/04/18 AEC) بموجب المبادئ التوجيهية للمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا.

1. الحيوان انشاء العملية الجراحية

1. تخدير واستقرار الحيوان.
   1. استخدام 8-10 أسابيع من العمر أنثى C57BL/ 6 الفئران. استخدام 5٪ ايزوفلوران في 1 L/min الأكسجين لاستقراء التخدير. للحفاظ على التخدير، استخدم 1.5-2٪ ايزوفلوران في 1 لتر / دقيقة من الأوكسجين. تأكيد التخدير المناسب من خلال إنشاء نقص في عدم انعكاس الألم في الذيل والكفوف الخلفية.
2. إدارة البوبرينورفين (0.03 ملغ / كجم من وزن الجسم) للانسة وenrofloxacin (10 ملغ / كجم من وزن الجسم) لتغطية المضادات الحيوية، تحت الجلد وفقا لوزن الجسم. ميلوكسيكام (2 ملغ / كجم من وزن الجسم) يمكن أن تعطى للتكليس على المدى الطويل إذا لزم الأمر.
3. حافظ على ثبات درجة حرارة جسم الحيوان عند 37 درجة مئوية مع وسادة تدفئة
   1. حلق الفراء الخلفي لفضح المنطقة الجراحية على العمود الفقري الظهري. إزالة الفراء الحليق من منطقة جراحية قبل تعقيم موقع شق. تعقيم المنطقة الحليقة مع مسحات القطن العقيمة المنقوعة في سائل مطهر اليود povidone والروح الجراحية.
4. الشريط الكفوف من الماوس إلى منطقة جراحية لتحقيق الاستقرار في الحيوان (الشكل 1A). وضع إطار البيضاوي الستار على الماوس(الشكل 1B).

2. استئصال لامينك

1. إجراء شق خط الوسط الرأسي في مستوى T10 الفقرية باستخدام مشرط جراحي.
   1. حدد موقع العملية العرضية لفقرة T10 لتحديد موقع استئصال لامينيك. يقع جسم الفقرات قليلاً في الجمجمة على طرف العملية الانساحية⁸ (انظر الشكل 2). تقع التلميح تقريبًا عند نقطة منتصف فقرة T11⁸.
   2. جعل شق ~ 2.5 سم طويلة، بحيث العمود الفقري من الفقرات T10 هو تقريبا في منتصف طول الشق.
2. تعكس الجلد والتراجع مع الداحف.
   1. استخدام ملقط على التوالي لرفع الجلد من اللفافة الكامنة. سيؤدي هذا إلى إنشاء مساحة للسحب ليتم وضعها; هذه سوف تبقي المجال الجراحي مفتوحا.
3. إجراء تشريح حاد من الأنسجة تحت الجلد واللفافة لفضح العمليات العرضية.
   1. استخدام حافة حادة من مشرط لجعل شق خط الوسط الصغيرة في الأنسجة تحت الجلد والزية الكامنة لفضح العمود الفقري من T9-T11 الفقرات. استخدام ملقط تلميح غرامة (غير حادة) لأداء تشريح حادة وتعكس اللفافة.
4. تقسيم وفصل العضلات شبه العرضية لفضح الصفيحة.
   1. استخدم الطرف الحاد للمشرط لتقسيم عضلات الجذع الظهرية والعضلات شبه العرضية على طول العمود الفقري في فقرات T9-T11. استخدام ملقط تلميح غرامة حادة لأداء تشريح صريح من العضلات في طبقات وفضح الصفيحة من الفقرات. هذا ينبغي أن تقلل أي نزيف.
      ملاحظة: إذا كان هناك أي نزيف، استخدم مياه الملحية الدافئة (37 درجة مئوية) الري ومسحات القطن للسيطرة عليه ومسح الدم من المجال الجراحي.
   2. استخدام نفس ملقط لجعل جيوب صغيرة حول العمليات العرضية من T10 فقرة. استخدام ملقط منحني لتحقيق الاستقرار في الجسم الفقري T10 عن طريق ربط شوكات لها تحت العمليات العرضية، في جيوب خلق(الشكل 1C).
   3. شطف بدقة t10 laminae مع المالحة الدافئة ومسح بلطف نظيفة مع مسحات القطن لتصور واضح سطح عظمي. تأكد من عدم وجود العضلات / الرباط المرفقات تبقى على طول السطح ثنائيا.
5. استخدام الحفر مع طرف غرامة (0.55 ملم قطر، 7 مم طول) لكسر الصفيحة ثنائيا.
   1. استخدم طرف الحفر لتتبع مسار عمودي من الفضاء بين الفقرات T9-T10 إلى الفضاء بين الفقرات T10-T11 على طول كل من صفح T10، دون تشغيل الحفر. هذا هو التأكد من أن بت الحفر لا يمسك أي نسيج (الشكل 1D).
   2. الآن تشغيل الحفر على، ببطء وبعناية حفر خندق عمودي على الصفيحة اليمنى من الفقرات T10. هذا الجزء من استئصال لامينك يجب أن يخلق عيب جراحي دقيق في جميع أنحاء سمك العظام في خط عمودي مستقيم. حافظ على قبضة ملقط منحني للحفاظ على الفقرات مستقرة.
6. تأكد من أن غيض من التدريبات لا تخترق العظام وإصابة الحبل الشوكي. كرر نفس العملية على الجانب الأيسر من الصفيحة، مع الحفاظ على الفقرات مستقرة مع ملقط منحني. ري مع المالحة الدافئة لغسل أي شظايا العظام المتبقية.
7. رفع وإزالة الجزء الخلفي من القوس العصبي (الشكل 1F).
   1. استخدام ملقط طرف غرامة الزاوية لقبضة عملية شائكة وإزالة الجزء كله الظهري من الصفيحة مفصولة بالحفر الثنائي. ري ومسحة مرة أخرى إذا كان هناك أي نزيف، تصور بوضوح الحبل الشوكي يتعرض تحت نافذة استئصال لاميني (الشكل 1E).

3. النقل

1. الحث على إصابة الحبل الشوكي عن طريق نقل الحبل المكشوف مع شريحة واحدة من النصل.
   1. استخدم شفرة قطعية مستديرة ضيقة لشرائح الحبل في وسط نافذة استئصال لاميني. ضمان اكتساح الاستراحة الجانبي من العمود الفقري للحث على إصابة كاملة في عملية النقل (الشكل 1G).
2. تأكيد اكتمال إصابة النقل باستخدام ملقط طرف غرامة حادة وإزالة أي اتصالات المتبقية في موقع النقل.
3. السيطرة على النزيف إن وجدت، قبل إغلاق الطبقات الجراحية.
4. استخدم الملح الحار لري و مسح أي نزيف يحدث من جذوع الحبل المقطّع. استخدام مسحة القطن لتطبيق ضغط لطيف لتحقيق الهباس إذا لزم الأمر. الحرص على عدم ضغط الحبل الشوكي.

4 - الإغلاق والرعاية الفورية بعد الجراحة

1. جمع العضلات معا وخياطة في طبقة.
   1. بمجرد تحقيق الهوساسي في موقع النقل، حرر قبضة ملقط منحنية على فقرات T10. جلب حواف العضلات تشريح معا على طول خط الوسط لتحقيق شهية جيدة.
   2. خياطة العضلات في طبقة باستخدام 5-0 البوليجلاكتين 910 خياطة للامتصاص. تأكد من أن الانحناء الطبيعي للعمود الفقري لا يسبب أي توتر عند خط الغرز أو يفتح الغرز ، مما يعرض موقع استئصال لامينك.
2. إغلاق الأنسجة تحت الجلد والجلد.
   1. استخدم 5-0 خياطة حريرية غير قابلة للامتصاص لإغلاق شق الجلد. تأكد من عدم وجود نزيف أو جلطات أو حطام متبقي تحت الجلد قبل الإغلاق. قد يكون من الضروري وجود الري النهائي مع الملح الحار في هذه الخطوة.
3. أوقف التخدير مراقبة الحيوان لمدة 10-30 دقيقة حتى الانتعاش. يجب أن يبقى الحيوان على وسادة التدفئة لهذه المدة. توفير جل الماء والطعام الرطب في القفص.
4. بالنسبة للرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، تشمل البوبرينورفين (مرتين يوميًا) وenrofloxacin (مرة واحدة يوميًا) لأول يومين وقائيًا. بالإضافة إلى ذلك، إفراغ المثانة يدويا على الأقل مرتين يوميا، والالتزام بالمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان.
   ملاحظة: تم تقييم الحيوانات في هذه التجربة مرتين يوميًا لصحتها العامة وعافيتها ، والتي شملت التحقق من الألم المستمر (لإعطاء جرعات إضافية من البوبرينورفين) أو العدوى (إنروفلوكساسين الإضافية) ، وحالتها التغذوية والترطيب (إعطاء السوائل القابلة للحقن إذا كانت جافة) وأي علامات على استئصال الأنف (توفير الرعاية في حالة استئصال الأنف أوتوماتيوم). ويوصى بشدة بأن تُحدد هذه الجوانب من الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، بما في ذلك قرارات القتل الرحيم بتوجيه من اللجنة المؤسسية لأخلاقيات الحيوان.

5- تقييم نموذج الإصابة

1. تأسيس فقدان وظيفة المحرك.
   1. تقييم السلوك الحركي على الفئران المصابة 2 و7 و14 و21 و28 يوماً بعد الإصابة في حقل مفتوح باستخدام مقياس باسو ماوس (BMS) لتحديد فقدان الوظيفة⁹ (الشكل 3C-E).
2. تأكيد الهَلَكِيّة للإصابة
   1. حصاد النخاع الشوكي المصاب مع أعمدة العمود الفقري بعد القتل الرحيم (القيام به مع ثاني أكسيد الكربون في هذه التجربة، كما وافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان).
   2. إصلاح الأنسجة عن طريق الغمر بين عشية وضحاها في 4٪ paraformaldehyde وdealcify العظام عن طريق العلاج مع 20٪ حمض رباعية الاثيلين ديامين (EDTA) على مدى 3 أسابيع، واستبدال EDTA الطازجة كل 48 ساعة.
   3. إعداد العمود الفقري decalcified لجلاء المقطع وقطعها إلى 30 ميكرومتر سميكة المقاطع.
   4. قم بتركيب المقاطع على الشرائح الزجاجية المغلفة بالجيلاتين للتلوين المناعي مع الأجسام المضادة المضادة لـ GFAP وHoechst 33342.
   5. صورة الشرائح على المجهر الفلورسنت (الشكل 3A) وإجراء قياسات لحجم الإصابة باستخدام برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال ، نيكون تحليل البرمجيات -- عناصر NIS [الشكل 3B]).

النتائج

الطريقة الناتجة كما هو مبين في الشكل 1، ينطوي على تثبيت كاف من الماوس (الشكل 1A) والتصور الجيد للعمود الفقري والأنسجة الطفيلية(الشكل 1B). يمكن تصور العملية العرضية والرقي بوضوح مع الحد الأدنى من تشريح العضلات وفقدان الدم(الشكل 1C

Discussion

هذه الطريقة تحفز إصابة كاملة من نوع النقل في مستوى T10 الفقري في الفئران ، مما يؤدي إلى شلل نصفي كامل للحيوان ، أقل من مستوى الإصابة. عموما، هذه الطريقة ينتج عن الحد الأدنى من النزيف، والأضرار الجانبية لا تذكر ومستقرة، وإصابة استنساخ. بالمقارنة مع الأساليب المنشورة سابقا من نقل دون استئصال ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug