Induzione della lesione completa del midollo spinale di tipo transezione nei topi

Riepilogo

Questo protocollo descrive come creare una laminectomia precisa per l'induzione di lesioni stabili del midollo spinale di tipo transezione nel modello del topo, con danni collaterali minimi per la ricerca sulle lesioni del midollo spinale.

Abstract

La lesione del midollo spinale (SCI) porta in gran parte a una perdita irreversibile e permanente della funzione, più comunemente a causa di un trauma. Diverse opzioni di trattamento, come i metodi di trapianto di cellule, sono in fase di ricerca per superare le disabilità debilitanti derivanti dallo SCI. La maggior parte degli studi precli clinici sugli animali sono condotti in modelli di roditori di SCI. Mentre i modelli di ratti SCI sono stati ampiamente utilizzati, i modelli di topi hanno ricevuto meno attenzione, anche se i modelli di topi possono avere vantaggi significativi rispetto ai modelli di ratti. Le piccole dimensioni dei topi equivalgono a costi di manutenzione degli animali inferiori a quelli dei ratti e la disponibilità di numerosi modelli di topi transgenici è vantaggiosa per molti tipi di studi. Indurre lesioni ripetibili e precise negli animali è la sfida principale per la ricerca SCI, che nei piccoli roditori richiede un intervento chirurgico ad alta precisione. Il modello di lesione di tipo trasezione è stato un modello di lesione comunemente usato nell'ultimo decennio per la ricerca terapeutica basata sui trapianti, tuttavia non esiste un metodo standardizzato per indurre una lesione completa del tipo di transezione nei topi. Abbiamo sviluppato un protocollo chirurgico per indurre una lesione completa del tipo di trasezione nei topi C57BL/6 a livello vertebrale toracico 10 (T10). La procedura utilizza un piccolo trapano a punta al posto dei rongeurs per rimuovere con precisione la lamina, dopo di che viene utilizzata una lama sottile con tagliente arrotondato per indurre la transezione del midollo spinale. Questo metodo porta a lesioni riproducibili di tipo trasezione nei piccoli roditori con danni muscolari e ossei collaterali minimi e quindi riduce al minimo i fattori confondenti, in particolare dove vengono analizzati i risultati funzionali comportamentali.

Introduzione

La lesione del midollo spinale (SCI) è un problema medico complesso che si traduce in drastici cambiamenti nella salute e nello stile di vita. Non esiste una cura per SCI e la fisiopatologia di SCI non è compresa a fondo. I modelli Animal SCI, in particolare i modelli di roditori, offrono uno strumento inestimabile per la sperimentazione di nuovi trattamenti e sono stati utilizzati per esplorare SCI per decenni. Ad oggi, oltre il 72% degli studi SCI preclitici ha utilizzato modelli di ratto, rispetto a un solo 16% che ha utilizzato topi¹. Sebbene i ratti, a causa delle loro maggiori dimensioni e della tendenza a formare cavità simili alle SIC umane, siano stati tradizionalmente gli animali modello preferiti per lo studio di nuovi approcci terapeutici, i topi (compresi molti modelli di topi transgenici) sono ora utilizzati più frequentemente per studiare i meccanismi cellulari e molecolari dello SCI². Il modello di topo offre ulteriori vantaggi in termini di una manipolazione più semplice, tassi riproduttivi più rapidi e costi inferiori rispetto ai ratti; i topi mostrano anche un alto grado di somiglianza genomica con^{l'uomo 1,2,3}. Il principale svantaggio del modello di topo è stato identificato come la dimensione significativamente più piccola che crea sfide per gli interventi chirurgici per la creazione e il trattamento delle lesioni del midollo^{spinale 4,5}.

C'è una lacuna nella letteratura esistente che evidenzia la necessità di un protocollo chirurgico robusto e riproducibile per indurre SCI stabile nel modello di mouse. Pertanto, forniamo un approccio chirurgico nuovo e preciso in questo protocollo per superare questi limiti. Questo protocollo fornisce linee guida approfondite per indurre una lesione di tipo transezione nei topi, poiché questo tipo di lesione è stato riconosciuto come il più appropriato per studiare i cambiamenti rigenerativi e degenerativi a seguito di una^{lesione 6,}nonché la neuroplasticità, i circuiti neurali e l'ingegneria tissutale^{si avvicinano a 7}. Abbiamo scelto di indurre la lesione nella regione toracica inferiore, poiché il livello toracico SCI è usato più comunemente nella letteratura¹.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite con l'approvazione del Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC e MSC/04/18 AEC) sotto le linee guida del National Health and Medical Research Council of Australia.

1. Procedura di set-up animale per l'intervento chirurgico

1. Anestetizza e stabilizza l'animale.
   1. Utilizzare topi C57BL/6 femmina di 8-10 settimane. Utilizzare il 5% di isoflurane in 1 L/min di ossigeno per l'induzione dell'anestesia. Per il mantenimento dell'anestesia, utilizzare l'1,5-2% di isoflurane in 1 L/min di ossigeno. Confermare un'anestesia appropriata stabilendo una mancanza di riflesso del dolore nella coda e nelle zampe posteriori.
2. Somministrare buprenorfina (0,03 mg/kg di peso corporeo) per l'analgesia e l'enrofloxacina (10 mg/kg di peso corporeo) per la copertura antibiotica, per via sottocutanea in base al peso corporeo. Meloxicam (2 mg/kg di peso corporeo) può essere somministrato per l'analgesia a lungo termine, se necessario.
3. Mantenere costante la temperatura corporea dell'animale a 37 °C con un riscaldante
   1. Radere la pelliccia posteriore per esporre l'area chirurgica sulla colonna vertebrale dorsale. Rimuovere la pelliccia rasata dall'area chirurgica prima di sterilizzare il sito di incisione. Sterilizzare l'area rasata con tamponi di cotone sterili imbevuti di liquido antisettico di iodio povidone e spirito chirurgico.
4. Rastremare le zampe del topo nell'area chirurgica per stabilizzare l'animale (Figura 1A). Posizionare un drappo della finestra ovale sul mouse (Figura 1B).

2. Laminectomia

1. Effettuare un'incisione verticale della linea mediana a livello vertebrale T10 utilizzando un bisturi chirurgico.
   1. Individuare il processo spinoso della vertebra T10 per determinare il sito della laminectomia. Il corpo della vertebra si trova leggermente cranica alla punta del processo spinoso⁸ (vedi figura 2). La punta poggia approssimativamente al punto centrale della vertebra T11⁸.
   2. Rendere l'incisione lunga ~ 2,5 cm, in modo che la colonna vertebrale della vertebra T10 sia approssimativamente al centro della lunghezza dell'incisione.
2. Riflettere la pelle e ritrarre con i retrattiri.
   1. Utilizzare le forcep dritte per sollevare la pelle dalla fascia sottostante. Ciò creerà spazio per i retrattiri da posizionare; questi manterranno aperto il campo chirurgico.
3. Eseguire la dissezione smussata del tessuto sottocutaneo e della fascia per esporre i processi spinosi.
   1. Usa il bordo smussato del bisturi per fare una piccola incisione della linea mediana nel tessuto sottocutaneo e nella fascia sottostante per esporre le spine delle vertebre T9-T11. Utilizzare le flesse a punta fine (non affilate) per eseguire la dissezione smussata e riflettere la fascia.
4. Dividere e separare i muscoli para-spinosi per esporre le laminae.
   1. Usa la punta smussata del bisturi per dividere i muscoli del tronco dorsale e i muscoli para-spinosi lungo le spine delle vertebre T9-T11. Utilizzare le forcep smussate della punta fine per eseguire la dissezione smussata dei muscoli a strati ed esporre le laminae delle vertebre. Questo dovrebbe ridurre al minimo qualsiasi sanguinamento.
      NOTA: In caso di sanguinamento, utilizzare l'irrigazione salina riscaldata (37 °C) e tamponi di cotone per controllarla e cancellare il sangue dal campo chirurgico.
   2. Usa le stesse forcep per creare piccole tasche intorno ai processi trasversali della vertebra T10. Utilizzare le pinzì curve per stabilizzare il corpo vertebrale T10 agganciando le sue sporgenze sotto i processi trasversali, nelle tasche create (Figura 1C).
   3. Risciacquare accuratamente le lamina T10 con salina calda e pulire delicatamente con tamponi di cotone per visualizzare chiaramente la superficie ossea. Assicurarsi che nessun attacco muscolare / legamento rimanga lungo la superficie bilateralmente.
5. Utilizzare un trapano con punta fine (0,55 mm di diametro, 7 mm di lunghezza) per rompere le lamina a livello bilaterale.
   1. Utilizzate la punta del trapano per tracciare un percorso verticale dallo spazio intervertebrale T9-T10 allo spazio intervertebrale T10-T11 lungo entrambe le lamina T10, senza accendere il trapano. Questo per garantire che la punta di perforazione non catturi alcun tessuto (Figura 1D).
   2. Ora accendendo il trapano, scavare lentamente e con cura una trincea verticale sulla lamina destra della vertebra T10. Questa parte della laminectomia dovrebbe creare un difetto chirurgico preciso per tutto lo spessore dell'osso in linea verticale retta. Mantenere la presa con le pinze curve per mantenere stabile la vertebra.
6. Assicurarsi che la punta del trapano non penetri attraverso l'osso e ferisa il midollo spinale. Ripetere lo stesso processo sul lato sinistro della lamina, mantenendo stabile la vertebra con le forcep curve. Irrigare con soluzione salina calda per lavare via eventuali frammenti ossei rimanenti.
7. Sollevare e rimuovere la parte posteriore dell'arco neurale (Figura 1F).
   1. Utilizzare le pinze angolate a punta fine per afferrare il processo spinoso e rimuovere l'intero segmento dorsale delle lamina separate dalla perforazione bilaterale. Irrigare e tamponare di nuovo in caso di sanguinamento, per visualizzare chiaramente il midollo spinale esposto sotto la finestra della laminectomia (Figura 1E).

3. Transezione

1. Indurre la lesione del midollo spinale per trasezione del cordone esposto con una singola fetta della lama.
   1. Utilizzare la lama stretta e rotonda tagliente per tagliare il cavo al centro della finestra della laminectomia. Assicurarsi di spazzare i recessi laterale della colonna vertebrale per indurre una lesione completa della trasezione (Figura 1G).
2. Confermare la completezza della lesione di trasezione utilizzando le forcep della punta fine smussata e rimuovere eventuali connessioni rimanenti nel sito di trasezione.
3. Controllare l'eventualità del sanguinamento, prima di chiudere gli strati chirurgici.
4. Utilizzare la salina calda per irrigare e cancellare qualsiasi sanguinamento che si verifica dai ceppi del cordone transetto. Utilizzare un batuffolo di cotone per applicare una pressione delicata per ottenere l'emostasi, se necessario. Fare attenzione a non comprimere il midollo spinale.

4. Chiusura e cure post-operatorie immediate

1. Riunisci i muscoli e sutura a strati.
   1. Una volta raggiunta l'emostasi nel sito di trasezione, rilasciare l'impugnatura delle pinze curve sulle vertebre T10. Riunire i bordi dei muscoli sezionati lungo la linea mediana per ottenere una buona apposizione.
   2. Suturare i muscoli in uno strato usando 5-0 poliglactina 910 suture assorbibili. Assicurarsi che la curvatura naturale della colonna vertebrale non causi alcuna tensione sulla linea di sutura o apra le suture, esponendo il sito di laminectomia.
2. Chiudere il tessuto sottocutaneo e la pelle.
   1. Utilizzare 5-0 suture di seta non assorbibili per chiudere l'incisione cutanea. Assicurarsi che non vi siano sanguinamenti, coaguli o detriti che rimangono sotto la pelle prima della chiusura. Un'irrigazione finale con salina calda può essere necessaria in questa fase.
3. Ferma l'anestesia. Osservare l'animale per 10-30 minuti fino al recupero. L'animale dovrebbe rimanere sulla pastiglia riscaldante per questa durata. Fornire gel d'acqua e cibo idratato nella gabbia.
4. Per le cure post-operatorie, includere la buprenorfina (due volte al giorno), l'enrofloxacina (una volta al giorno) per i primi due giorni profilatticamente. Inoltre, svuotare manualmente la vescica almeno due volte al giorno, aderendo alle linee guida del comitato etico animale.
   NOTA: Gli animali in questo esperimento sono stati valutati due volte al giorno per la loro salute generale e il loro benessere, che includeva il controllo del dolore persistente (per somminittare dosi aggiuntive di buprenorfina) o infezione (enrofloxacina aggiuntiva), il loro stato di nutrizione e idratazione (dare liquidi iniettabili se disidratati) e qualsiasi segno di autotomia (fornire cure alle ferite se autotomia minore). Si raccomanda vivamente che questi aspetti dell'assistenza post-operatoria, comprese le decisioni sull'eutanasia, debbano essere determinati con la guida del comitato istituzionale per l'etica animale.

5. Valutazione del modello di lesione

1. Stabilire la perdita della funzione motoria.
   1. Valutare il comportamento motorio sui topi feriti 2, 7, 14, 21 e 28 giorni dopo l'infortunio in un campo aperto utilizzando la scala del topo basso (BMS) per determinare la perdita della^{funzione 9} (Figura 3C–E).
2. Conferma istologica dell'infortunio
   1. Raccogliere il midollo spinale ferito con le colonne vertebrali dopo l'eutanasia (fatto con anidride carbonica in questo esperimento, come approvato dal comitato etico animale).
   2. Fissare il tessuto mediante immersione notturna in paraformaldeide al 4% e decalcificare le ossa mediante trattamento con acido tetraacetico al 20% di etilene diammina (EDTA) per 3 settimane, sostituendo l'EDTA fresco ogni 48 ore.
   3. Preparare le spine decalcificate per la criosezione e tagliarle in sezioni spesse 30 μm.
   4. Montare le sezioni su vetri rivestiti di gelatina per la colorazione immuno con anticorpi anti-GFAP e Hoechst 33342.
   5. Immagini le diapositive su un microscopio fluorescente (Figura 3A) ed esegui misurazioni delle dimensioni delle lesioni utilizzando un software di analisi delle immagini (ad esempio, software di analisi Nikon - ELEMENTI NIS [Figura 3B]).

Risultati

Il metodo risultante, illustrato nella figura 1, comporta un'adeguata stabilizzazione del topo (Figura 1A) e una buona visualizzazione della colonna vertebrale e del tessuto paraspinoso (Figura 1B). Il processo spinoso e le laminae possono essere chiaramente visualizzati con una dissezione muscolare minima e perdita di sangue(Figura 1C,zona evidenziata). La foratura della punta fine viene eseguita come ...

Discussione

Questo metodo induce una lesione completa del tipo di trasezione a livello vertebrale T10 nei topi, che si traduce in una paraplegia completa dell'animale, al di sotto del livello di lesione. Nel complesso, questo metodo si traduce in sanguinamento minimo, danni collaterali trascurabili e una lesione stabile e riproducibile. Rispetto ai metodi di trasezione precedentemente pubblicati senza laminectomia¹⁰, questo metodo offre i vantaggi in termini di visualizzazione diretta senza manipolare la curv...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug