Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine präzise Laminektomie für die Induktion von stabilen Querbandverletzungen im Mausmodell mit minimalen Kollateralschäden für die Rückenmarksverletzungsforschung erstellt wird.

Zusammenfassung

Rückenmarksverletzungen (SCI) führen weitgehend zu irreversiblen und dauerhaften Funktionsverlusten, am häufigsten als Folge eines Traumas. Mehrere Behandlungsmöglichkeiten, wie z. B. Zelltransplantationsmethoden, werden erforscht, um die schwächenden Behinderungen zu überwinden, die sich aus SCI ergeben. Die meisten präklinischen Tierversuche werden in Nagetiermodellen von SCI durchgeführt. Während Rattenmodelle von SCI weit verbreitet sind, haben Mausmodelle weniger Aufmerksamkeit erhalten, obwohl Mausmodelle erhebliche Vorteile gegenüber Rattenmodellen haben können. Die geringe Größe von Mäusen entspricht niedrigeren Tierwartungskosten als bei Ratten, und die Verfügbarkeit zahlreicher transgener Mausmodelle ist für viele Arten von Studien von Vorteil. Die Induzieren von wiederholbaren und präzisen Verletzungen bei den Tieren ist die haupte Herausforderung für die SCI-Forschung, die bei kleinen Nagetieren eine hochpräzise Chirurgie erfordert. Das Transsektions-Verletzungsmodell war in den letzten zehn Jahren ein häufig verwendetes Verletzungsmodell für die transplantationsbasierte therapeutische Forschung, aber eine standardisierte Methode zur Induktion einer vollständigen Transektionsverletzung bei Mäusen existiert nicht. Wir haben ein chirurgisches Protokoll entwickelt, um eine vollständige Transsektionsverletzung bei C57BL/6-Mäusen auf Brustwirbelstufe 10 (T10) zu induzieren. Das Verfahren verwendet einen kleinen Spitzenbohrer anstelle von Rongeurs, um die Lamina präzise zu entfernen, nach der eine dünne Klinge mit abgerundeter Schneidkante verwendet wird, um die Rückenmarkstransektion zu induzieren. Diese Methode führt zu reproduzierbaren Transektionsverletzungen bei kleinen Nagetieren mit minimalen Kollateralmuskel- und Knochenschäden und minimiert daher Störfaktoren, insbesondere dort, wo verhaltensfunktionelle Ergebnisse analysiert werden.

Einleitung

Rückenmarksverletzungen (SCI) sind ein komplexes medizinisches Problem, das zu drastischen Veränderungen in Gesundheit und Lebensstil führt. Es gibt keine Heilung für SCI, und die Pathophysiologie von SCI ist nicht gründlich verstanden. Tier-SCI-Modelle, insbesondere Nagetiermodelle, bieten ein unschätzbares Werkzeug für die Erprobung neuer Behandlungen und werden seit Jahrzehnten zur Erforschung von SCI eingesetzt. Bis heute haben über 72% der präklinischen SCI-Studien Rattenmodelle verwendet, verglichen mit nur 16%, die^Mäuse1 verwendet haben. Obwohl Ratten aufgrund ihrer größeren Größe und der Tendenz, Hohlräume zu bilden, die menschlichen GGB ähneln, traditionell die bevorzugten Modelltiere für die Untersuchung neuartiger therapeutischer Ansätze sind, werden Mäuse (einschließlich vieler transgener Mausmodelle) jetzt häufiger verwendet, um zelluläre und molekulare Mechanismen des SCI²zu untersuchen. Das Mausmodell bietet zusätzliche Vorteile in Bezug auf eine einfachere Handhabung, schnellere Reproduktionsraten und niedrigere Kosten als Ratten; Mäuse weisen auch einen hohen Grad an genomischer Ähnlichkeit mit Menschen^{auf 1,2,3}. Der Hauptnachteil des Mausmodells wurde als die deutlich kleinere Größe identifiziert, die Herausforderungen für chirurgische Eingriffe zur Bildung und Behandlung von Rückenmarksverletzungen^{schafft 4,5}.

Es gibt eine Lücke in der vorhandenen Literatur, die die Notwendigkeit eines robusten und reproduzierbaren chirurgischen Protokolls unterstreicht, um stabile SCI im Mausmodell zu induzieren. Daher bieten wir einen neuartigen und präzisen chirurgischen Ansatz in diesem Protokoll, um diese Einschränkungen zu überwinden. Dieses Protokoll enthält detaillierte Richtlinien, um eine Transektionsverletzung bei Mäusen zu induzieren, da dieser Verletzungstyp als der am besten geeignete für die Untersuchung regenerativer und degenerativer Veränderungen nach einer Verletzung⁶, sowie Neuroplastizität, neuronale Schaltkreise und Gewebe-Engineering-Ansätze⁷anerkannt wurde. Wir haben uns entschieden, die Verletzung in der unteren Brustregion zu induzieren, da Thoraxniveau SCI am häufigsten in der Literatur verwendet wird¹.

Protokoll

Alle Verfahren wurden mit Zustimmung der Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC und MSC/04/18 AEC) nach den Richtlinien des National Health and Medical Research Council of Australia durchgeführt.

1. Tieraufbauverfahren für die Operation

1. Anästhesisieren und stabilisieren Sie das Tier.
   1. Verwenden Sie 8–10 Wochen alte weibliche C57BL/6 Mäuse. Verwenden Sie 5% Isofluran in 1 L/min Sauerstoff zur Induktion der Anästhesie. Zur Aufrechterhaltung der Anästhesie 1,5–2% Isofluran in 1 L/min Sauerstoff verwenden. Bestätigen Sie die entsprechende Anästhesisierung, indem Sie einen Mangel an Schmerzreflex in Schwanz und Hinterpfoten etablieren.
2. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,03 mg/kg Körpergewicht) für Analgesie und Enrofloxacin (10 mg/kg Körpergewicht) zur Antibiotikaabdeckung, subkutan nach Körpergewicht. Meloxicam (2 mg/kg Körpergewicht) kann bei Bedarf bei Langfristiger Analgesie verabreicht werden.
3. Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres bei 37 °C mit einem Heizkissen stabil
   1. Rasieren Sie das Rückenfell, um den chirurgischen Bereich über der Rückenwirbelsäule freizulegen. Entfernen Sie das rasierte Fell aus dem Operationsbereich, bevor Sie die Einschnittstelle sterilisieren. Sterilisieren Sie den rasierten Bereich mit sterilen Wattestäbchen in Povidon Jod antiseptische Flüssigkeit und chirurgischen Geist getränkt.
4. Kleben Sie die Pfoten der Maus an den Operationsbereich, um das Tier zu stabilisieren (Abbildung 1A). Platzieren Sie ein ovales Fenster drapieren über der Maus (Abbildung 1B).

2. Laminektomie

1. Machen Sie einen vertikalen Mittellinienschnitt auf der T10-Wirbelebene mit einem chirurgischen Skalpell.
   1. Suchen Sie den spinösen Prozess des T10-Wirbels, um die Stelle der Laminektomie zu bestimmen. Der Körper des Wirbels liegt leicht kranial bis zur Spitze des Spinnprozesses⁸ (siehe Abbildung 2). Die Spitze ruht ungefähr in der Mitte des T11-Wirbels⁸.
   2. Machen Sie den Schnitt 2,5 cm lang, so dass die Wirbelsäule des T10-Wirbels ungefähr in der Mitte der Länge des Einschnitts ist.
2. Reflektieren Sie die Haut und ziehen Sie mit Retraktoren.
   1. Verwenden Sie die geradeZange, um die Haut von der darunter liegenden Faszie zu heben. Dadurch wird Platz für die Zusendemaschinen geschaffen; diese halten das Operationsfeld offen.
3. Führen Sie eine stumpfe Zerlegung von Subkutangewebe und Faszien durch, um die spinösen Prozesse freizulegen.
   1. Verwenden Sie die stumpfe Kante des Skalpells, um einen kleinen Mittellinienschnitt im Unterhautgewebe und der darunter liegenden Faszien zu machen, um die Stacheln der T9-T11-Wirbel freizulegen. Verwenden Sie die feinen Spitzenzange (nicht scharf), um eine stumpfe Sezierung durchzuführen und die Faszien zu reflektieren.
4. Teilen und trennen Sie die para-spinösen Muskeln, um die Laminae freizulegen.
   1. Verwenden Sie die stumpfe Spitze des Skalpells, um die dorsalen Rumpfmuskeln und para-spinous Muskeln entlang der Stacheln der T9-T11 Wirbel zu teilen. Verwenden Sie die stumpfe feine Spitzenzange, um stumpfe Zerlegung der Muskeln in Schichten durchzuführen und die Laminae der Wirbel freizulegen. Dies sollte alle Blutungen minimieren.
      HINWEIS: Wenn es Blutungen gibt, verwenden Sie erwärmte Saline (37 °C) Bewässerung und Wattestäbchen, um es zu kontrollieren und Blut aus dem chirurgischen Feld zu löschen.
   2. Verwenden Sie die gleichen Zangen, um kleine Taschen um die Querprozesse des T10-Wirbels zu machen. Verwenden Sie die gekrümmten Zangen, um den Wirbelkörper T10 zu stabilisieren, indem Sie seine Zinken unter die Querprozesse in den erstellten Taschen einhaken (Abbildung 1C).
   3. Spülen Sie die T10-Laminae gründlich mit warmer Herzwäsche ab und wischen Sie sie vorsichtig mit Wattestäbchen sauber ab, um die knöcherne Oberfläche deutlich zu visualisieren. Stellen Sie sicher, dass keine Muskel-/Bänderanhaftungen bilateral an der Oberfläche verbleiben.
5. Verwenden Sie einen Bohrer mit einer feinen Spitze (0,55 mm Durchmesser, 7 mm Länge), um die Laminae bilateral zu brechen.
   1. Verwenden Sie die Spitze des Bohrers, um einen vertikalen Pfad vom T9–T10-Intervertebral-Raum zum T10-T11-Bandwirbelraum entlang der T10-Laminae zu verfolgen, ohne den Bohrer einzuschalten. Dadurch soll sichergestellt werden, dass der Bohrer kein Gewebe fängt (Abbildung 1D).
   2. Nun den Bohrer anschalten, langsam und vorsichtig einen vertikalen Graben auf der rechten Lamina des T10-Wirbels graben. Dieser Teil der Laminektomie sollte einen präzisen chirurgischen Defekt über die Dicke des Knochens in einer geraden vertikalen Linie erzeugen. Halten Sie den Griff mit den gekrümmten Zangen, um den Wirbel stabil zu halten.
6. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des Bohrers nicht durch den Knochen eindringt und das Rückenmark verletzt. Wiederholen Sie den gleichen Prozess auf der linken Seite der Lamina, wobei der Wirbel mit den gekrümmten Zangen stabil bleibt. Mit warmer Saline bewässern, um alle verbleibenden Knochenfragmente wegzuwaschen.
7. Heben und entfernen Sie den hinteren Teil des neuronalen Bogens (Abbildung 1F).
   1. Verwenden Sie die abgewinkelten Feinspitzenzangen, um den spinlösen Prozess zu greifen und das gesamte dorsale Segment der Laminae zu entfernen, das durch die bilaterale Bohrung getrennt ist. Bei Blutungen wieder bewässern und abwischen, um das unter dem Laminektomiefenster freiliegende Rückenmark klar zu visualisieren (Abbildung 1E).

3. Transektion

1. Induzieren Sie die Rückenmarksverletzung durch Transsektion der exponierten Schnur mit einer einzigen Scheibe der Klinge.
   1. Verwenden Sie die schmale, runde Schneideklinge, um die Schnur in der Mitte des Laminektomiefensters zu schneiden. Achten Sie darauf, die seitlichen Aussparungen der Wirbelsäule zu fegen, um eine vollständige Transektionsverletzung zu induzieren (Abbildung 1G).
2. Bestätigen Sie die Vollständigkeit der Transektionsverletzung mit den stumpfen Feinspitzenzangen und entfernen Sie alle verbleibenden Verbindungen an der Transektionsstelle.
3. Kontrollieren Sie die Blutung, falls vorhanden, bevor Sie die chirurgischen Schichten schließen.
4. Verwenden Sie die warme Saline, um alle Blutungen, die von den transsektierten Schnurstümpfen auftreten, zu bewässern und zu löschen. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um sanften Druck auszuüben, um bei Bedarf eine Hämostase zu erreichen. Achten Sie darauf, das Rückenmark nicht zu komprimieren.

4. Schließung und sofortige postoperative Betreuung

1. Bringen Sie die Muskeln zusammen und Naht in Schicht.
   1. Sobald die Hämostase an der Transektionsstelle erreicht ist, lassen Sie den gekrümmten Zangengriff an den T10-Wirbeln frei. Bringen Sie die Ränder der sezierten Muskeln entlang der Mittellinie zusammen, um eine gute Apposition zu erreichen.
   2. Bedecken Sie die Muskeln in einer Schicht mit 5-0 Polyglactin 910 resorbierbaren Nähten. Stellen Sie sicher, dass die natürliche Krümmung der Wirbelsäule keine Spannung an der Nahtlinie verursacht oder öffnen Sie die Nähte, wodurch die Laminektomie freisetzt wird.
2. Schließen Sie subkutanes Gewebe und Haut.
   1. Verwenden Sie 5-0 nicht resorbierbare Seidennähte, um den Hautschnitt zu schließen. Stellen Sie sicher, dass vor dem Verschluss keine Blutungen, Gerinnsel oder Ablagerungen unter der Haut verbleiben. Eine abschließende Bewässerung mit warmer Saline kann bei diesem Schritt notwendig sein.
3. Stoppen Sie die Anästhesie. Beobachten Sie das Tier 10–30 min bis zur Genesung. Das Tier sollte für diese Dauer auf dem Heizkissen bleiben. Geben Sie Wassergel und hydratisierte Nahrung im Käfig.
4. Für die postoperative Pflege, enthalten Buprenorphin (zweimal täglich), Enrofloxacin (einmal täglich) für die ersten beiden Tage prophylaktisch. Zusätzlich entleeren Sie die Blase mindestens zweimal täglich manuell und halten sich an die Richtlinien der Tierethikkommission.
   HINWEIS: Die Tiere in diesem Experiment wurden zweimal täglich auf ihre allgemeine Gesundheit und ihr Wohlbefinden untersucht, wozu auch die Überprüfung auf anhaltende Schmerzen (um zusätzliche Dosen Buprenorphin zu geben) oder Infektionen (zusätzliches Enrofloxacin), ihre Ernährung und ihren Hydratationsstatus (injizierbare Flüssigkeiten geben, wenn sie dehydriert sind) und jegliche Anzeichen einer Autotomie (bei geringfügiger Autotomie eine Wundversorgung). Es wird dringend empfohlen, diese Aspekte der postoperativen Pflege, einschließlich der Euthanasieentscheidungen, unter Anleitung der institutionellen Tierethikkommission zu bestimmen.

5. Bewertung des Verletzungsmodells

1. Ermittlung des Verlusts der Motorfunktion.
   1. Bewerten Sie das motorische Verhalten der verletzten Mäuse 2, 7, 14, 21 und 28 Tage nach der Verletzung in einem offenen Feld mit der Basso-Mausskala (BMS), um den Verlust der Funktion⁹ zu bestimmen (Abbildung 3C-E).
2. Histologische Verletzungsbestätigung
   1. Ernten Sie die verletzten Rückenmarkse mit den Wirbelsäulen nach der Euthanasie (mit Kohlendioxid in diesem Experiment durchgeführt, wie von der Tierethikkommission genehmigt).
   2. Fixieren Sie das Gewebe durch nächtliches Eintauchen in 4% Paraformaldehyd und entkalken Sie die Knochen durch Behandlung mit 20% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) über 3 Wochen, ersetzt frische EDTA alle 48 h.
   3. Bereiten Sie die entkalkten Stacheln für die Kryosektion vor und schneiden Sie sie in 30 m dicke Abschnitte.
   4. Montieren Sie die Abschnitte auf gelatinebeschichteten Glasrutschen zur Immunfärbung mit Anti-GFAP-Antikörpern und Hoechst 33342.
   5. Stellen Sie die Dias auf einem Fluoreszenzmikroskop auf (Abbildung 3A) und führen Sie Messungen der Verletzungsgröße mit Bildanalysesoftware durch (z. B. Nikon-Analysesoftware - NIS-Elemente [Abbildung 3B]).

Ergebnisse

Die resultierende Methode, wie in Abbildung 1dargestellt, beinhaltet eine angemessene Stabilisierung der Maus (Abbildung 1A) und eine gute Visualisierung der Wirbelsäule und des paraspinösen Gewebes (Abbildung 1B). Spinöse Prozesse und Laminae können mit minimaler Muskelsektion und Blutverlust klar visualisiert werden(Abbildung 1C, hervorgehobene Zone). Das Feinspitzenbohren wird wie in

Diskussion

Diese Methode induziert eine vollständige Transsektionsverletzung auf T10-Wirbelebene bei Mäusen, was zu einer vollständigen Querschnittslähmung des Tieres unterhalb des Verletzungsniveaus führt. Insgesamt führt diese Methode zu minimalen Blutungen, vernachlässigbaren Kollateralschäden und einer stabilen, reproduzierbaren Verletzung. Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Methoden der Transektion ohne Laminektomie¹⁰bietet diese Methode die Vorteile in Bezug auf die direkte Visualisierung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug