Farelerde Tam Traneksiyon Tipi Spinal Kord Yaralanması İndüksiyonu

Özet

Bu protokol, fare modelinde stabil traneksiyon tipi omurilik yaralanmasıinin indüksiyonu için hassas bir laminektominin nasıl oluşturulacak larını, omurilik yaralanması araştırmaları için en az ikincil hasarın nasıl yaratılabildiğini açıklamaktadır.

Özet

Omurilik yaralanması (SCI) büyük ölçüde geri dönüşümsüz ve kalıcı fonksiyon kaybına yol açar, en sık travma sonucu. SCI'den kaynaklanan zayıflatıcı engellerin üstesinden gelmek için hücre nakli yöntemleri gibi çeşitli tedavi seçenekleri araştırılmaktadır. Klinik öncesi hayvan çalışmalarının çoğu SCI'nin kemirgen modellerinde yapılmaktadır. SCI'nin fare modelleri yaygın olarak kullanılırken, fare modelleri fare modelleri fare modellerine göre önemli avantajlara sahip olsa da, fare modelleri daha az dikkat çekilmiştir. Farelerin küçük boyutu sıçanlar için daha düşük hayvan bakım maliyetleri eşittir, ve çok sayıda transgenik fare modellerinin durumu çalışmaların birçok türü için avantajlıdır. Hayvanlarda tekrarlanabilir ve hassas yaralanma indükleyen SCI araştırma için birincil sorundur, hangi küçük kemirgenler yüksek hassasiyetli cerrahi gerektirir. Tradineksiyon tipi yaralanma modeli transplantasyon tabanlı terapötik araştırmalar için son on yılda yaygın olarak kullanılan bir yaralanma modeli olmuştur, ancak farelerde tam bir trasezaryen tipi yaralanma yayılımı için standart bir yöntem bulunmamaktadır. Torasik vertebral düzey 10 (T10) düzeyinde C57BL/6 farelerinde tam bir traneksiyon tipi yaralanmaya neden olmak için cerrahi protokol geliştirdik. Prosedür tam lamina kaldırmak için rongeurs yerine küçük bir ucu matkap kullanır, sonra yuvarlak kesme kenarı ile ince bir bıçak omurilik tradeksi neden kullanılır. Bu yöntem, küçük kemirgenlerde minimal kollateral kas ve kemik hasarı olan reprodüktöbl transection tipi yaralanmalara yol açar ve bu nedenle özellikle davranışsal fonksiyonel sonuçların analiz edildiği şaşırtıcı faktörleri en aza indirir.

Giriş

Omurilik yaralanması (SCI) sağlık ve yaşam tarzı köklü değişikliklere neden karmaşık bir tıbbi sorundur. SCI için bir tedavi yoktur ve SCI patofizyolojisi iyice anlaşılamamıştır. Hayvan SCI modelleri, özellikle kemirgen modelleri, yeni tedaviler deneme için paha biçilmez bir araç sunuyoruz, ve yıllardır SCI keşfetmek için kullanılmıştır. Bugüne kadar, pre-klinik SCI çalışmaların% 72 üzerinde fare modelleri istihdam var, fareler¹kullanmış sadece% 16 ile karşılaştırıldığında. Sıçanlar, daha büyük boyutları ve insan SCI'lerine benzer boşluklar oluşturma eğilimleri nedeniyle, geleneksel olarak yeni tedavi yaklaşımlarını incelemek için tercih edilen model hayvanlar olmalarına rağmen, fareler (birçok transgenik fare modeli de dahil olmak üzere) sci^2'ninhücresel ve moleküler mekanizmalarını incelemek için daha sık kullanılmaktadır. Fare modeli daha kolay kullanım, daha hızlı üreme oranları ve sıçanlara göre daha düşük maliyetler açısından ek faydalar sunar; fareler de insanlar ile genomik benzerlik yüksek derecede^{sergilemek 1,2,3}. Fare modelinin en büyük dezavantajı, omurilik yaralanmalarının oluşturulması ve tedavisi için cerrahi müdahaleler için zorluklar yaratan önemli ölçüde daha küçük boyut olarak tanımlanmıştır^4,5.

Mevcut literatürde fare modelinde kararlı SCI'yi tetiklemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir cerrahi protokole duyulan ihtiyacı vurgulayan bir boşluk vardır. Bu nedenle bu sınırlamaların üstesinden gelmek için bu protokolde yeni ve kesin bir cerrahi yaklaşım salıyoruz. Bu protokol farelerde bir trazeksiyon tipi yaralanma neden derinlemesine kurallar sağlar, Bu yaralanma türü bir yaralanma aşağıdaki rejeneratif ve dejeneratif değişiklikleri incelemek için en uygun olarak kabul edilmiştir⁶, yanı sıra nöroplasti, nöral devre ve doku mühendisliği yaklaşımları⁷. Torasik düzey SCI^literatürdeen sık kullanıldığından, alt torasik bölgede yaralanmayı tetiklemeyi seçtik.

Protokol

Tüm prosedürler Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi yönergeleri altında Griffith Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi 'nin (ESK/04/16 AEC ve MSC/04/18 AEC) onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Ameliyat için hayvan kurulum prosedürü

1. Anestezi ve hayvan stabilize.
   1. 8-10 haftalık dişi C57BL/6 fare kullanın. Anestezi indüksiyonu için 1 L/dk oksijen %5 isofluran kullanın. Anestezinin bakımı için 1 L/dk oksijende %1,5-2 oranında isofluran kullanın. Kuyruk ve arka patilerde ağrı refleksi eksikliği oluşturarak uygun anesteziyi onaylayın.
2. Vücut ağırlığına göre subkutan olarak antibiyotik kapağı için analjezi ve enrofloksasin (10 mg/kg vücut ağırlığı) için buprenorfin (0.03 mg/kg vücut ağırlığı) uygulayın. Meloksikam (2 mg/kg vücut ağırlığı) gerekirse uzun süreli analjezi için verilebilir.
3. Bir ısıtma yastığı ile hayvanın vücut ısısını 37 °C'de sabit tutun
   1. Sırt omuru üzerinde cerrahi alanı ortaya çıkarmak için arka kürk tıraş. Kesi bölgesini sterilize etmeden önce tıraşlı kürkü cerrahi bölgeden çıkarın. Povidone iyot antiseptik sıvı ve cerrahi ruh batırılmış steril pamuk bezleri ile tıraş alanı sterilize.
4. Hayvanı stabilize etmek için farenin patilerini cerrahi alana bantlayın(Şekil 1A). Farenin üzerine oval bir pencere örtüsü yerleştirin (Şekil 1B).

2. Laminektomi

1. Cerrahi bir neşter kullanarak T10 vertebra düzeyinde dikey bir orta hat kesi yapın.
   1. Laminektomi yerini belirlemek için T10 vertebra spinous süreci bulun. Omur gövdesi spinous işleminin ucuna biraz kranial yatıyor⁸ (Bkz. Şekil 2). Ucu yaklaşık T11 vertebra⁸orta noktasında dinlenir.
   2. T10 omurunun omurgasının kesi uzunluğunun yaklaşık ortasında olması için yaklaşık 2,5 cm uzunluğunda bir kesi yapın.
2. Cildi yansıtın ve retraktörlerle geri çekilin.
   1. Altta yatan fasya deri kaldırmak için düz forseps kullanın. Bu, retraktörlerin yerleştirilmesi için alan yaratacaktır; bunlar cerrahi alanı açık tutar.
3. Spinous süreçleri ortaya çıkarmak için deri altı doku ve fasya künt diseksiyonu gerçekleştirin.
   1. T9-T11 omurlarının omurgalarını ortaya çıkarmak için deri altı doku ve altta yatan fasya küçük bir orta hat kesi yapmak için neşter künt kenar kullanın. Künt diseksiyonu gerçekleştirmek ve fasyayı yansıtmak için ince uçlu forceps (keskin olmayan) kullanın.
4. Laminaları ortaya çıkarmak için para-spinous kasları ayırın ve ayırın.
   1. T9-T11 omurlarının omurgaları boyunca dorsal gövde kaslarını ve para-spinous kasları bölmek için neşterin künt ucunu kullanın. Tabakalar halinde kasların künt diseksiyon gerçekleştirmek ve vertebra laminae ortaya çıkarmak için künt ince uç forceps kullanın. Bu herhangi bir kanama yıkacaktır.
      NOT: Kanama varsa, kontrol etmek ve cerrahi alandan kan temizlemek için ısıtılmış tuzlu (37 °C) sulama ve pamuk lu bezler kullanın.
   2. T10 vertebra enine süreçleri etrafında küçük cepler yapmak için aynı terpler kullanın. Oluşturulan ceplerde, enine prosesler altında uçları kanca tarafından T10 vertebral vücut stabilize etmek için kavisli forceps kullanın (Şekil 1C).
   3. T10 laminasını sıcak tuzlu suyla iyice durulayın ve kemikyüzeyini net bir şekilde görselleştirmek için pamuklu bezlerle hafifçe silin. Hiçbir kas / ligament ekleri iki taraflı yüzey boyunca kalmasını sağlamak.
5. Laminayı iki taraflı olarak kırmak için ince uçlu (0,55 mm çapında, 7 mm uzunlukta) bir matkap kullanın.
   1. T9-T10 intervertebral uzaydan T10-T11 intervertebral uzaya kadar her iki T10 laminası boyunca, matkabı açmadan dikey bir yol izlemek için matkabın ucunu kullanın. Bu, matkap ucunun herhangi bir doku yakalamamasını sağlamak içindir(Şekil 1D).
   2. Şimdi matkap açma, yavaş yavaş ve dikkatle T10 vertebra sağ lamina üzerinde dikey bir siper kazmak. Laminektominin bu kısmı, kemiğin kalınlığı boyunca düz dikey bir çizgide hassas bir cerrahi defekt oluşturmalıdır. Omurları stabil tutmak için kavisli forceps ile kavrama koruyun.
6. Matkabın ucunun kemiğe nüfuz etmediğinden ve omuriliğe zarar vermediğinden emin olun. Laminanın sol tarafında aynı işlemi tekrarlayın, eğri forceps ile omur kararlı tutarak. Kalan kemik parçalarını temizlemek için sıcak tuzlu su ile sulandırın.
7. Nöral kemerin arka kısmını kaldırın ve çıkarın(Şekil 1F).
   1. Spinous süreci kavramak ve ikili delme ile ayrılmış laminatüm dorsal segmenti kaldırmak için açılı ince uç forceps kullanın. Herhangi bir kanama varsa tekrar sulamak ve bez, açıkça lamineektomi penceresi altında maruz omurilik görselleştirmek için(Şekil 1E).

3. Travesti

1. Bıçağın tek bir dilimi ile maruz kalan kordonun kesiti ile omurilik yaralanmasına neden olur.
   1. Laminektomi penceresinin ortasında kordonu dilimlemek için dar, yuvarlak kesme kenarlı bıçağı kullanın. Tam bir tragile yaralanması(Şekil 1G)neden omurilik lateral girintileri süpürmek için emin olun.
2. Künt ince uç forceps kullanarak trazeksiyon yaralanmasının tamlığını onaylayın ve transection sitesinde kalan bağlantıları çıkarın.
3. Cerrahi tabakaları kapatmadan önce kanamayı kontrol edin.
4. Transekted kordon kütüklerinden kaynaklanan kanamaları sulamak ve temizlemek için sıcak tuzlu eti kullanın. Gerekirse hemostaz elde etmek için hafif basınç uygulamak için bir pamuklu bez kullanın. Omuriliği sıkıştırmamaya dikkat edin.

4. Kapatma ve hemen ameliyat sonrası bakım

1. Kasları bir araya getirin ve katman halinde dikiş.
   1. Hemostaz transection yerinde elde edildikten sonra, T10 vertebra üzerinde kavisli forceps kavrama bırakın. İyi bir adem elde etmek için orta hat boyunca parçalanmış kasların kenarlarını bir araya getirin.
   2. 5-0 poliglactin 910 emilebilir dikişler kullanarak bir tabaka kasları dikiş. Omurganın doğal eğriliği dikiş hattında herhangi bir gerginlik neden olmadığından emin olun veya dikişleri açmak, laminektomi site açığa.
2. Subkutan dokuyu ve deriyi kapatın.
   1. Cilt kesisini kapatmak için 5-0 emilemez ipek dikişler kullanın. Kapanmadan önce derinin altında kanama, pıhtı veya enkaz kalmadığından emin olun. Bu adımda sıcak tuzlu son bir sulama gerekebilir.
3. Anesteziyi durdurun. Kurtarma kadar 10-30 dakika hayvan gözlemleyin. Hayvan bu süre boyunca ısıtma yastığıüzerinde kalmalıdır. Kafeste su jeli ve sulu yiyecek sağlayın.
4. Postoperatif bakım için, buprenorfin dahil (günde iki kez), enrofloksasin (günde bir kez) ilk iki gün profilaktik için. Ayrıca, elle en az iki kez günlük mesane boş, hayvan etik komitesi nin yönergelerine bağlı.
   NOT: Bu deneydeki hayvanlar, kalıcı ağrı (ek dozlarda buprenorfin vermek için) veya enfeksiyon (ek enrofloksasin), beslenme ve hidrasyon durumları (susuz ise enjekte edilebilir sıvılar vermek) ve ototomi belirtileri (küçük ototomi varsa yara bakımı sağlamak) kontrol dahil genel sağlık ve refah için günde iki kez değerlendirildi. Ötanazi kararları da dahil olmak üzere ameliyat sonrası bakımın bu yönlerinin kurumsal hayvan etik komitesinin rehberliğinde belirlenmesi önemle tavsiye edilir.

5. Yaralanma modelinin değerlendirilmesi

1. Motor fonksiyon kaybının belirlenmesi.
   1. Basso Mouse Scale (BMS) kullanarak açık bir alanda yaralanmadan 2, 7, 14, 21 ve 28 gün sonra oluşan yaralı farelerdeki motor davranışını değerlendirin^ve fonksiyon kaybını belirleyin(Şekil 3C–E).
2. Yaralanmahistolojik onayı
   1. Ötanazi den sonra vertebral kolonları ile yaralı omurilik hasat (bu deneyde karbondioksit ile yapılır, hayvan etik komitesi tarafından onaylandığı gibi).
   2. % 4 paraformaldehit gecede daldırma doku düzeltmek ve 3 hafta boyunca% 20 etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ile tedavi ile kemikleri dekalsite, taze EDTA her 48 saat yerine.
   3. Kaliküle dikenleri kriyo kesitiçin hazırlayın ve 30 μm kalınlığında kesin.
   4. Anti-GFAP antikorları ve Hoechst 33342 ile immüno boyama için jelatin kaplı cam slaytlar üzerine bölümleri monte edin.
   5. Bir floresan mikroskop(Şekil 3A)üzerinde slaytlar görüntü ve görüntü analiz yazılımı (örneğin, Nikon analiz yazılımı - NIS Elements [Şekil 3B]) kullanarak yaralanma boyutu ölçümleri gerçekleştirmek.

Sonuçlar

Şekil 1'debetimlenen yöntem, farenin yeterli stabilizasyonu(Şekil 1A) ve omurga ve paraspinöz dokunun iyi görüntülenmesini(Şekil 1B)içerir. Spinöz proses ve lamina minimal kas diseksiyonu ve kan kaybı ile açıkça görüntülenebilir(Şekil 1C, vurgulanmış bölge). İnce uç delme, dikdörtgenin gösterdiği gibi bir laminektomi penceresi oluşturmak için Şekil 1D'de...

Tartışmalar

Bu yöntem farelerde T10 vertebra düzeyinde tam bir trazeksiyon tipi yaralanmaya neden olur, bu da hayvanın tam paraplejiile sonuçlandığı yaralanma seviyesinin altında. Genel olarak, bu yöntem minimal kanama, ihmal edilebilir ikincil hasar ve stabil, tekrarlanabilir yaralanma ile sonuçlanır. Laminektomi¹⁰olmadan traneksiyon daha önce yayınlanmış yöntemlere göre, Bu yöntem omurga eğriliği manipüle etmeden doğrudan görüntüleme açısından yararları sunuyor, yaralanma bütü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug