Induction d’une lésion complète de la moelle épinière de type transection chez la souris

Résumé

Ce protocole décrit comment créer une laminectomie précise pour l’induction de lésions stables de la moelle épinière de type transection dans le modèle de souris, avec des dommages collatéraux minimes pour la recherche sur les lésions médullaires.

Résumé

Les lésions médullaires (SCI) entraînent en grande partie une perte irréversible et permanente de la fonction, le plus souvent à la suite d’un traumatisme. Plusieurs options de traitement, telles que les méthodes de transplantation cellulaire, font l’objet de recherches pour surmonter les incapacités débilitantes découlant de la SCI. La plupart des essais précliniques sur les animaux sont menés dans des modèles de rongeurs de SCI. Tandis que les modèles de rat de SCI ont été largement utilisés, les modèles de souris ont reçu moins d’attention, même si les modèles de souris peuvent avoir des avantages significatifs au-dessus des modèles de rat. La petite taille des souris équivaut à des coûts d’entretien des animaux inférieurs à ceux des rats, et la disponibilité de nombreux modèles de souris transgéniques est avantageuse pour de nombreux types d’études. Induire des blessures reproductibles et précises chez les animaux est le principal défi pour la recherche sci, qui chez les petits rongeurs nécessite une chirurgie de haute précision. Le modèle de blessure de type transection a été un modèle de blessure couramment utilisé au cours de la dernière décennie pour la recherche thérapeutique basée sur la transplantation, mais une méthode normalisée pour induire une lésion complète de type transection chez la souris n’existe pas. Nous avons développé un protocole chirurgical pour induire une blessure complète de type transection chez les souris C57BL/6 au niveau vertébral thoracique 10 (T10). La procédure utilise une petite perceuse à pointe au lieu de rongeurs pour enlever avec précision le lamina, après quoi une fine lame avec bord de coupe arrondi est utilisé pour induire la transection de la moelle épinière. Cette méthode conduit à des blessures reproductibles de type transection chez les petits rongeurs avec un minimum de dommages collatéraux musculaires et osseux et minimise donc les facteurs confusionnels, en particulier lorsque les résultats fonctionnels comportementaux sont analysés.

Introduction

Les lésions médullaires (SCI) sont un problème médical complexe qui entraîne des changements radicaux dans la santé et le mode de vie. Il n’y a aucun remède pour SCI, et la pathophysiologie de SCI n’est pas complètement comprise. Les modèles SCI animaux, en particulier les modèles de rongeurs, offrent un outil précieux pour l’essai de nouveaux traitements, et ont été utilisés pour explorer sci depuis des décennies. À ce jour, plus de 72 % des études précliniques de sci ont employé des modèles de rats, comparativement à seulement 16 % qui ont utilisé des souris¹. Bien que les rats, en raison de leur taille plus grande et de leur tendance à former des cavités semblables aux ISC humaines, aient toujours été les animaux modèles préférés pour étudier de nouvelles approches thérapeutiques, les souris (y compris de nombreux modèles transgéniques de souris) sont maintenant utilisées plus fréquemment pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la SCI^2. Le modèle de souris offre des avantages supplémentaires en termes de manipulation plus facile, des taux de reproduction plus rapides et des coûts inférieurs à ceux des rats; souris présentent également un degré élevé de similitude génomique avec les^{humains 1,2,3}. L’inconvénient majeur du modèle de souris a été identifié comme étant la taille significativement plus petite qui crée des défis pour les interventions chirurgicales pour la création et le traitement des lésions^{médullaires 4,5}.

Il y a une lacune dans la littérature existante qui accentue la nécessité d’un protocole chirurgical robuste et reproductible pour induire la SCI stable dans le modèle de souris. Par conséquent, nous fournissons une approche chirurgicale nouvelle et précise dans ce protocole pour surmonter ces limitations. Ce protocole fournit des lignes directrices approfondies pour induire une blessure de type transection chez la souris, car ce type de blessure a été reconnu comme étant le plus approprié pour étudier les changements régénératifs et dégénératifs à la suite d’une^{blessure 6}, ainsi que la neuroplasticité, les circuits neuronaux et l’ingénierie tissulaire^{approche 7}. Nous avons choisi d’induire la blessure dans la région thoracique inférieure, puisque le niveau thoracique SCI est employé le plus généralement dans la littérature^1.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées avec l’approbation du Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC et MSC/04/18 AEC) selon les lignes directrices du National Health and Medical Research Council of Australia.

1. Procédure de mise en place d’animaux pour la chirurgie

1. Anesthésier et stabiliser l’animal.
   1. Utilisez des souris C57BL/6 femelles âgées de 8 à 10 semaines. Utilisez 5% d’isoflurane dans 1 L/min d’oxygène pour l’induction de l’anesthésie. Pour le maintien de l’anesthésie, utiliser 1,5-2% d’isoflurane dans 1 L/min d’oxygène. Confirmer l’anesthésie appropriée en établissant un manque de réflexe de douleur dans la queue et les pattes postérieures.
2. Administrer la buprénorphine (0,03 mg/kg de poids corporel) pour l’analgésie et l’enrofloxacine (poids corporel de 10 mg/kg) pour la couverture antibiotique, sous-cutanée en fonction du poids corporel. Meloxicam (poids corporel de 2 mg/kg) peut être administré pour une analgésie à long terme si nécessaire.
3. Maintenir la température corporelle de l’animal stable à 37 °C avec un coussin chauffant
   1. Raser la fourrure arrière pour exposer la zone chirurgicale au-dessus de la colonne dorsale. Retirer la fourrure rasée de la zone chirurgicale avant de stériliser le site d’incision. Stériliser la zone rasée avec des cotons-tiges stériles trempés dans du liquide antiseptique à l’iode povidone et de l’esprit chirurgical.
4. Tapez les pattes de la souris à la zone chirurgicale pour stabiliser l’animal (Figure 1A). Placez une fenêtre ovale drapée sur la souris( Figure 1B).

2. Laminectomie

1. Faire une incision verticale à mi-ligne au niveau vertébral T10 à l’aide d’un scalpel chirurgical.
   1. Localiser le processus épineux de la vertèbre T10 pour déterminer le site de laminectomie. Le corps de la vertèbre se trouve légèrement crânien jusqu’à la pointe du processus^{épineux 8} (voir la figure 2). La pointe repose approximativement au point médian de la vertèbre T11^8.
   2. Faire l’incision ~ 2,5 cm de long, de sorte que la colonne vertébrale de la vertèbre T10 est approximativement au milieu de la longueur de l’incision.
2. Réfléchissez la peau et rétractez-vous avec des rétractateurs.
   1. Utilisez les forceps droits pour soulever la peau du fascia sous-jacent. Cela créera de l’espace pour les rétractateurs à placer; ceux-ci garderont le champ chirurgical ouvert.
3. Effectuez la dissection émoussée du tissu sous-cutané et du fascia pour exposer les processus épineux.
   1. Utilisez le bord contondant du scalpel pour faire une petite incision médiane dans le tissu sous-cutané et le fascia sous-jacent pour exposer les épines des vertèbres T9-T11. Utilisez les forceps fines de pointe (non pointus) pour effectuer la dissection émoussée et refléter le fascia.
4. Fendre et séparer les muscles para-spinous pour exposer les laminaires.
   1. Utilisez la pointe émoussée du scalpel pour fendre les muscles du tronc dorsal et les muscles para-épineux le long des épines des vertèbres T9-T11. Utilisez les forceps à pointe fine émoussée pour effectuer une dissection émoussée des muscles en couches et exposer la laminée des vertèbres. Cela devrait minimiser tout saignement.
      REMARQUE : En cas de saignement, utilisez l’irrigation saline réchauffée (37 °C) et les cotons-tiges pour le contrôler et dégager le sang du champ chirurgical.
   2. Utilisez les mêmes forceps pour faire de petites poches autour des processus transversaux de la vertèbre T10. Utilisez les forceps incurvés pour stabiliser le corps vertébral T10 en accrochant ses dents sous les processus transversaux, dans les poches créées (Figure 1C).
   3. Rincez soigneusement la laminée T10 avec de la solution saline chaude et essuyez-la doucement avec des cotons-tiges pour visualiser clairement la surface osseuse. Assurez-vous qu’aucun attachement musculaire/ligamentaire ne reste le long de la surface bilatéralement.
5. Utilisez une perceuse avec une pointe fine (0,55 mm de diamètre, longueur de 7 mm) pour briser la laminé bilatéralement.
   1. Utilisez la pointe de la perceuse pour tracer une trajectoire verticale de l’espace intervertébral T9-T10 à l’espace intervertébral T10-T11 le long de la laminae T10, sans allumer la perceuse. Il s’agit de s’assurer que le foret n’attrape aucun tissu( Figure 1D).
   2. Maintenant, allumer la perceuse, creuser lentement et soigneusement une tranchée verticale sur le lamina droit de la vertèbre T10. Cette partie de la laminectomie devrait créer un défaut chirurgical précis tout au long de l’épaisseur de l’os dans une ligne verticale droite. Maintenez l’adhérence avec les forceps incurvés pour maintenir la vertèbre stable.
6. Assurez-vous que la pointe de la perceuse ne pénètre pas dans l’os et ne blesse pas la moelle épinière. Répétez le même processus sur le côté gauche du lamina, en gardant la vertèbre stable avec les forceps incurvés. Irriguer avec de la solution saline chaude pour laver les fragments d’os restants.
7. Soulevez et retirez la partie postérieure de l’arc neural( Figure 1F).
   1. Utilisez les forceps d’extrémité fine inclinés pour saisir le processus épineux et enlever tout le segment dorsal des laminaires séparés par le forage bilatéral. Irriguer et écouvillonner à nouveau s’il y a des saignements, pour visualiser clairement la moelle épinière exposée sous la fenêtre laminectomie (Figure 1E).

3. Transection

1. Induire les lésions de la moelle épinière par transection de la cordon exposée avec une seule tranche de la lame.
   1. Utilisez la lame étroite et ronde tranchante pour trancher le cordon au centre de la fenêtre de laminectomie. Assurez-vous de balayer les cavités latérales de la colonne vertébrale pour induire une lésion complète de transection (figure 1G).
2. Confirmer l’exhaustivité de la blessure par transection à l’aide des forceps d’extrémité fine contondants et enlever les connexions restantes au site de transection.
3. Contrôler le saignement le cas échéant, avant de fermer les couches chirurgicales.
4. Utilisez la solution saline chaude pour irriguer et effacer tout saignement qui se produit à partir des souches de cordon transectées. Utilisez un coton-tige pour appliquer une pression douce pour atteindre l’hémostase si nécessaire. Prenez soin de ne pas compresser la moelle épinière.

4. Fermeture et soins postopératoires immédiats

1. Rassemblez les muscles et suturez en couche.
   1. Une fois que l’hémostase est atteinte au site de transection, relâchez l’adhérence incurvée des forceps sur les vertèbres T10. Rassemblez les bords des muscles disséqués le long de la ligne médiane pour obtenir une bonne apposition.
   2. Suture des muscles en une couche à l’aide de sutures absorbables 5-0 polyglactine 910. Assurez-vous que la courbure naturelle de la colonne vertébrale ne provoque aucune tension à la ligne de suture ou d’ouvrir les sutures, exposant le site de laminectomie.
2. Fermer les tissus et la peau sous-cutanés.
   1. Utilisez 5-0 sutures de soie non absorbables pour fermer l’incision cutanée. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement, de caillots ou de débris sous la peau avant la fermeture. Une irrigation finale avec salin chaud peut être nécessaire à cette étape.
3. Arrêtez l’anesthésie. Observez l’animal pendant 10 à 30 minutes jusqu’à la récupération. L’animal doit rester sur le coussin chauffant pendant cette durée. Fournir du gel d’eau et de la nourriture hydratée dans la cage.
4. Pour les soins postopératoires, inclure la buprénorphine (deux fois par jour), l’enrofloxacine (une fois par jour) pendant les deux premiers jours prophylactiquement. De plus, videz manuellement la vessie au moins deux fois par jour, en respectant les lignes directrices du comité d’éthique animale.
   REMARQUE : Les animaux de cette expérience ont été évalués deux fois par jour pour leur santé et leur bien-être généraux, notamment pour vérifier la persistance de la douleur (pour donner des doses additionnées de buprénorphine) ou l’infection (enrofloxacine supplémentaire), leur état nutritionnel et hydratant (donner des liquides injectables s’ils sont déshydratés) et tout signe d’autotomie (fournir des soins des plaies en cas d’autotomie mineure). Il est fortement recommandé que ces aspects des soins postopératoires, y compris les décisions relatives à l’euthanasie, soient déterminés avec les conseils du comité institutionnel d’éthique animale.

5. Évaluation du modèle de blessures

1. Établir la perte de fonction motrice.
   1. Évaluer le comportement moteur des souris blessées 2, 7, 14, 21 et 28 jours après la blessure en plein champ à l’aide de l’échelle de souris Basso (BMS) pour déterminer la perte de^{la fonction 9} (Figure 3C-E).
2. Confirmation histologique des blessures
   1. Récolter les moelles épinières blessées avec les colonnes vertébrales après l’euthanasie (fait avec du dioxyde de carbone dans cette expérience, tel qu’approuvé par le comité d’éthique animale).
   2. Fixer le tissu par submersion pendant la nuit dans 4% de paraformaldéhyde et décalcifier les os par un traitement avec 20% d’acide tétraacétique à l’éthylène diamine (EDTA) sur 3 semaines, en remplaçant l’EDTA frais toutes les 48 h.
   3. Préparer les épines décalcifiées pour le cryo-section et les couper en sections de 30 μm d’épaisseur.
   4. Montez les sections sur des glissières en verre recouvertes de gélatine pour l’immuno-coloration avec des anticorps anti-GFAP et Hoechst 33342.
   5. Imagez les diapositives sur un microscope fluorescent (figure 3A) et effectuez des mesures de la taille des blessures à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (p. ex., logiciel d’analyse Nikon - Éléments NIS [Figure 3B]).

Résultats

La méthode qui en résulte, comme le montre la figure 1,implique une stabilisation adéquate de la souris (figure 1A) et une bonne visualisation de la colonne vertébrale et du tissu paraspinous (Figure 1B). Le processus épineux et la laminae peuvent être clairement visualisés avec la dissection musculaire minimale et la perte de sang (figure 1C,zone mise en évidence). Le perçage à pointe fine es...

Discussion

Cette méthode induit une lésion complète de type transection au niveau vertébral T10 chez la souris, ce qui entraîne une paraplégie complète de l’animal, en dessous du niveau de blessure. Dans l’ensemble, cette méthode entraîne un saignement minimal, des dommages collatéraux négligeables et une blessure stable et reproductible. Par rapport aux méthodes précédemment publiées de transection sans laminectomie¹⁰, cette méthode offre les avantages en termes de visualisation directe ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug