小鼠完全转型脊髓损伤的诱导

摘要

该协议描述了如何创建精确的拉明切除术，在小鼠模型中诱导稳定的转节型脊髓损伤，为脊髓损伤研究提供最小的附带损伤。

摘要

脊髓损伤 （SCI） 在很大程度上导致不可逆转和永久性的功能丧失，最常见的是创伤的结果。正在研究一些治疗方案，如细胞移植方法，以克服SCI引起的使人衰弱的残疾。大多数临床前动物试验是在SCI的啮齿动物模型中进行的。虽然SCI的老鼠模型已经被广泛使用，但老鼠模型受到的关注较少，尽管老鼠模型比老鼠模型有显著的优势。老鼠体积小，比老鼠低动物维护成本，许多转基因小鼠模型的提供对许多类型的研究都有利。诱导动物的可重复和精确伤害是SCI研究的主要挑战，在小型啮齿动物中，需要高精度手术。过去十年来，转切型损伤模型一直是移植治疗研究中常用的损伤模型，但不存在诱导小鼠完全转切型损伤的标准化方法。我们开发了一种手术方案，用于诱导胸椎10级（T10）的C57BL/6小鼠出现完全转切型损伤。该程序使用小尖端钻头代替角膜来精确去除层，之后使用带圆切刃的薄刀片诱导脊髓转液。这种方法导致小啮齿动物的可重复转切型损伤，具有最小的附带肌肉和骨骼损伤，因此最大限度地减少混淆因素，特别是在行为功能结果分析的地方。

引言

脊髓损伤 （SCI） 是一个复杂的医疗问题，导致健康和生活方式的急剧变化。SCI没有治愈的方法，SCI的病理生理学也没有被彻底理解。动物SCI模型，特别是啮齿动物模型，为试验新疗法提供了宝贵的工具，并已被用于探索SCI几十年。迄今为止，超过72%的临床前SCI研究采用了老鼠模型，而只有16%的人使用过^小鼠1。虽然大鼠由于体型较大，而且倾向于形成类似于人类SCI的蛀牙，传统上是研究新疗法的首选模型动物，但老鼠（包括许多转基因小鼠模型）现在正更频繁地用于研究SCI 2的细胞和^分子机制。小鼠模型在比大鼠更容易处理、更快的生殖速率和更低的成本方面提供了额外的好处;小鼠也表现出高度的基因组相似性与人类^1，2，3。小鼠模型的主要缺点是尺寸明显缩小，这给创建和治疗脊髓损伤^的外科手术带来了^挑战。

现有文献中存在差距，突出表明需要一种坚固且可重复的手术方案，以在小鼠模型中诱导稳定的 SCI。因此，我们提供了一种新颖和精确的手术方法，以克服这些限制。该协议提供了深入的指南，以诱导小鼠的转切型损伤，因为这种损伤类型已被确认为最合适的研究再生和退行性的变化后，^伤害6，以及神经可塑性，神经电路和组织工程方法^7。我们选择诱导损伤在较低的胸腔区域，因为胸腔水平SCI是最常用的文献^1。

研究方案

所有程序都是根据澳大利亚国家健康和医学研究理事会的指导方针，经格里菲斯大学动物伦理委员会（ESK/04/16 AEC 和 MSC/04/18 AEC）的批准进行的。

1. 手术的动物设置程序

1. 麻醉和稳定动物。
   1. 使用8~10周大的雌性C57BL/6只小鼠。在 1 L/min 氧气中使用 5% 异氟兰进行麻醉诱导。为了维持麻醉，在1升/分钟氧气中使用1.5~2%异氟。通过确定尾部和后爪缺乏疼痛反射，确认适当的麻醉。
2. 为镇痛和苯丙沙星（10毫克/千克体重）管理丁丙诺啡（0.03毫克/千克体重），用于抗生素覆盖，根据体重进行皮下治疗。Meloxicam（2毫克/千克体重）可给予长期镇痛（如果需要）。
3. 使用加热垫将动物的体温稳定在 37°C
   1. 剃光背部毛皮，露出背脊椎的手术区域。在消毒切口部位之前，先从手术区域取出剃光的毛皮。用浸泡在波维酮碘防腐剂液和手术精神中的无菌棉签消毒剃光区域。
4. 将鼠标的爪子固定到手术区域以稳定动物（图1A）。将椭圆形窗口窗帘放在鼠标上（图 1B）。

2. 拉明切除术

1. 使用手术手术刀在T10椎骨水平上进行垂直中线切口。
   1. 找到T10椎骨的旋转过程，以确定拉明切除术的位点。椎骨的身体稍微颅骨位于旋转过程⁸ 的尖端（见图 2）。尖端大约位于T11椎骨8的中^点。
   2. 使切口长约2.5厘米，使T10椎骨的脊椎大约在切口长度的中间。
2. 用缩回器反射皮肤和缩回。
   1. 使用直钳将皮肤从底层筋膜上提起。这将为缩回器的放置创建空间;这些将保持手术场开放。
3. 对皮下组织和筋膜进行钝解剖，以暴露旋转过程。
   1. 使用手术刀的钝边在皮下组织和下皮筋膜中做一个小中线切口，以暴露T9+T11椎骨的脊椎。使用细尖钳（非锐化）进行钝解剖并反射筋膜。
4. 分割和分离准旋转肌肉，以暴露跛脚。
   1. 使用手术刀的钝尖沿T9+T11椎骨的脊椎分割背部躯干肌肉和准旋转肌肉。使用钝细尖钳对层中的肌肉进行钝解剖，并暴露椎骨的跛脚。这应该尽量减少任何出血。
      注:如果有任何出血，使用加热盐水（37°C）灌溉和棉签来控制它，并清除手术场的血液。
   2. 使用相同的钳子在 T10 椎骨的横向过程周围制作小口袋。使用弯曲钳子在创建的口袋中钩住 T10 椎骨体（图1C）。
   3. 用温暖的盐水彻底冲洗T10层，然后用棉签轻轻擦拭干净，以清楚地可视化骨质表面。确保表面没有肌肉/韧带附件保持双边。
5. 使用具有细尖端（直径 0.55 mm，7 mm 长度）的钻头，以双边作用打破层。
   1. 使用钻头沿 T10 层角追踪从 T9+T10 椎间空间到 T10+T11 椎间空间的垂直路径，而无需打开钻头。这是为了确保钻头不会捕获任何组织（图1D）。
   2. 现在打开钻头，慢慢地小心翼翼地在T10椎骨的右层上挖一条垂直沟。这部分的拉明切除术应创建一个精确的手术缺陷，整个骨骼的厚度在一条直线上。保持弯曲钳子的抓地力，以保持椎骨骼稳定。
6. 确保钻头不会穿透骨骼并损伤脊髓。在层压的左侧重复相同的过程，用弯曲的钳子保持椎骨稳定。用温暖的盐水灌溉，洗去任何剩余的骨头碎片。
7. 提起并移除神经拱门的后部（图1F）。
   1. 使用倾斜的细尖钳抓住旋转过程，并拆下由双边钻孔分隔的层的整个支脚段。如果有任何出血，再次灌溉和拭子，以清楚地可视化暴露在拉明切除术窗口下的脊髓（图1E）。

3. 转位

1. 通过用刀片的一片转露线诱导脊髓损伤。
   1. 使用窄圆切边刀片切开拉明切除术窗口中心的线。确保扫描脊柱的横向凹槽，以诱发完全的转液损伤（图1G）。
2. 使用钝细尖端钳确认转节损伤的完整，并删除转流场址上的任何剩余连接。
3. 在关闭手术层之前，控制出血（如果有）。
4. 使用温暖的盐水灌溉和清除从横贯的脐带桩发生的出血。如果需要，使用棉签施加温和的压力，以达到下性。注意不要压缩脊髓。

4. 关闭和立即进行术后护理

1. 将肌肉聚集在一起，缝合在一层。
   1. 一旦在转节站点上达到异位，释放 T10 椎骨上的弯曲钳子抓地力。将解剖肌肉的边缘沿中线聚集在一起，以达到良好的位置。
   2. 使用 5-0 聚加糖 910 可吸收缝合缝合层中的肌肉。确保脊柱的自然曲率不会引起缝合线的任何张力或打开缝合线，暴露拉明切除术位点。
2. 关闭皮下组织和皮肤。
   1. 使用 5-0 不可吸收的丝线缝合线关闭皮肤切口。在关闭之前，请确保皮肤下没有出血、血块或碎屑。在此步骤中，可能需要用温暖的盐水进行最后的灌溉。
3. 停止麻醉。观察动物10~30分钟，直到恢复。动物应在此持续时间内保持在加热垫上。在笼子里提供水凝胶和水合食品。
4. 对于术后护理，包括丁丙诺啡（每天两次），环境黄沙星（每天一次）在头两天预防。此外，每天至少两次手动排空膀胱，遵守动物伦理委员会的准则。
   注:本实验中的动物每天被评估两次，评估其一般健康和福祉，其中包括检查持续疼痛（给予额外的剂量的丁丙诺啡）或感染（额外的四氟沙星），他们的营养和水化状态（如果脱水时给予可注射的液体）和任何自体切除术的迹象（如果轻微的自体切除术提供伤口护理）。强烈建议在机构动物伦理委员会的指导下确定术后护理的这些方面，包括安乐死决定。

5. 伤害模型的评估

1. 确定电机功能的丧失。
   1. 使用巴索小鼠比例表（BMS）评估受伤小鼠在开放场受伤后2、7、14、21和28天的运动行为，以确定功能⁹ 的丧失（图3C+E）。
2. 组织学上确认的伤害
   1. 安乐死后用椎柱收获受伤的脊髓（经动物伦理委员会批准，在本次实验中用二氧化碳完成）。
   2. 通过隔夜淹没4%半甲醛，并在3周内用20%乙胺四乙酸（EDTA）进行治疗，将骨骼解毒，每48小时更换一次新鲜EDTA，从而修复组织。
   3. 准备脱膜脊柱进行低温切块，并切成30 μm厚的部分。
   4. 在明胶涂层玻璃幻灯片上安装部分，用于使用抗 GFAP 抗体和 Hoechst 33342 进行免疫染色。
   5. 在荧光显微镜上拍摄幻灯片（图3A），并使用图像分析软件（例如，尼康分析软件 - NIS 元素 +图 3B+）测量损伤大小。

结果

图 1中描述的方法涉及小鼠的充分稳定（图 1A）和脊柱和准视组织（图1B） 的可视化。旋转过程和层压可以清楚地可视化与最小的肌肉解剖和失血（图1C，高亮区）。精细尖端钻孔按图 1D所示执行，以创建如矩形所示的拉明切除术窗口。由此产生的拉明切除术窗口是明确的，并允许直接...

讨论

这种方法在小鼠T10椎位诱发完全转切型损伤，导致动物完全截瘫，低于损伤水平。总体而言，此方法可导致最小出血、可忽略不计的附带损害和稳定的可重复伤害。与之前公布的无兰胺切除术^10的转治方法相比，该方法在直接可视化方面提供了好处，无需操纵脊柱的曲率，更好地控制损伤的完成，增强了控制出血和实现止血的能力。这种方法的优点是，该协议可以修改，用于任?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug