אינדוקציה של פגיעה מלאה בחוט השדרה מסוג טרנס-פעולה בעכברים

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור כריתת למינקטוע מדויקת עבור אינדוקציה של פגיעה יציבה בחוט השדרה מסוג transection במודל העכבר, עם נזק משני מינימלי למחקר פגיעה בחוט השדרה.

Abstract

פגיעה בחוט השדרה (SCI) מובילה במידה רבה לאובדן תפקוד בלתי הפיך וקבוע, הנפוץ ביותר כתוצאה מטראומה. מספר אפשרויות טיפול, כגון שיטות השתלת תאים, נחקרים כדי להתגבר על המוגבלויות מתישה הנובעות SCI. רוב הניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים נערכים במודלים של מכרסמים של SCI. בעוד מודלים חולדה של SCI כבר בשימוש נרחב, מודלים עכבר קיבלו פחות תשומת לב, למרות מודלים עכבר יכול להיות יתרונות משמעותיים על מודלים חולדה. הגודל הקטן של עכברים משווה לעלויות תחזוקה נמוכות יותר של בעלי חיים מאשר לחולדות, והזמינות של דגמי עכבר טרנסגניים רבים היא יתרון עבור סוגים רבים של מחקרים. פגיעה חוזרת ומדויקת בבעלי החיים היא האתגר העיקרי למחקר SCI, אשר מכרסמים קטנים דורש ניתוח דיוק גבוה. מודל הפציעה מסוג transection היה מודל פציעה נפוץ בעשור האחרון למחקר טיפולי מבוסס השתלה, עם זאת שיטה מתוקמנת לזימת פציעה מלאה מסוג transection בעכברים אינה קיימת. פיתחנו פרוטוקול כירורגי לגרימת פציעה מלאה של סוג התרדמות בעכברים C57BL/6 ברמת בית החזה 10 (T10). ההליך משתמש במקדחת קצה קטנה במקום rongeurs כדי להסיר במדויק את ה למינה, לאחר מכן להב דק עם קצה חיתוך מעוגל משמש כדי לגרום לתנופה של חוט השדרה. שיטה זו מובילה לפציעה מסוג transection לשחזור מכרסמים קטנים עם נזק מינימלי לשרירים ולעצם, ולכן ממזערת גורמים מבלבלים, במיוחד כאשר ניתחו תוצאות תפקודיות התנהגותיות.

Introduction

פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא בעיה רפואית מורכבת התוצאה היא שינויים דרסטיים בבריאות ואורח החיים. אין תרופה ל-SCI, והפתופיזיולוגיה של SCI אינה מובנת היטב. מודלים של בעלי חיים SCI, במיוחד דגמי מכרסמים, מציעים כלי יקר ערך לניסויים בטיפולים חדשים, והשתמשו בהם כדי לחקור SCI במשך עשרות שנים. עד כה, מעל 72% של מחקרים פרה-קליני SCI העסיקו מודלים חולדה, לעומת רק 16% שהשתמשו בעכברים¹. למרות חולדות, בשל גודלם גדול יותר ונטייה ליצור חללים דומה SCIs אנושי, היו באופן מסורתי חיות המודל המועדף לחקר גישות טיפוליות חדשניות, עכברים (כולל מודלים רבים של עכבר טרנסגניים) נמצאים כעת בשימוש בתדירות גבוהה יותר כדי ללמוד מנגנונים תאיים ומולקולריים של SCI². דגם העכבר מציע יתרונות נוספים במונחים של טיפול קל יותר, שיעורי רבייה מהירים יותר ועלויות נמוכות יותר מאשר חולדות; עכברים גם להפגין רמה גבוהה של דמיון גנומי עם^{בני אדם 1,2,3}. החיסרון העיקרי של מודל העכבר זוהה כגודל קטן יותר באופן משמעותי היוצר אתגרים עבור התערבויות כירורגיות ליצירה ולטפל בפציעות בחוט השדרה^4,5.

יש פער בספרות הקיימת המדגיש את הצורך בפרוטוקול כירורגי חזק ותו לא כדי לגרום ל-SCI יציב במודל העכבר. לכן, אנו מספקים גישה כירורגית חדשנית ומדויקת בפרוטוקול זה כדי להתגבר על מגבלות אלה. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעמיקות כדי לגרום לפציעה מסוג transection בעכברים, כמו סוג פציעה זה הוכר להיות המתאים ביותר ללמוד שינויים רגנרטיביים ניווניות בעקבות פציעה 6 ,^{כמו גם}neuroplasticity, מעגלים עצביים והנדסת רקמות גישות⁷. בחרנו לגרום לפציעה באזור בית החזה התחתון, מאז SCI רמת בית החזה משמש הנפוץ ביותר בספרות^1.

Protocol

כל ההליכים בוצעו באישור הוועדה לאתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת גריפית' (ESK/04/16 AEC ו-MSC/04/18 AEC) על פי ההנחיות של המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה.

1. הליך התעוות בעלי חיים לניתוח

1. להנהים ולייצב את החיה.
   1. השתמש בעכברים בני 8-10 שבועות C57BL/6. השתמש 5% isoflurane ב 1 L/min חמצן עבור אינדוקציה של הרדמה. לצורך תחזוקה של הרדמה, יש להשתמש ב-1.5%-2% isoflurane ב-1 ל'/דקה חמצן. אשר הרדמה מתאימה על ידי ביסוס חוסר רפלקס כאב בזנב ובכפות האחוריים.
2. לנהל buprenorphine (0.03 מ"ג/ ק"ג משקל גוף) עבור משכך כאבים ו enrofloxacin (10 מ"ג/ ק"ג משקל גוף) עבור כיסוי אנטיביוטיקה, תת עורית על פי משקל הגוף. מלוקסיאם (2 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ניתן לתת עבור משכך כאבים לטווח ארוך במידת הצורך.
3. שמור על טמפרטורת הגוף של החיה יציבה ב 37 °C עם כרית חימום
   1. לגלח את הפרווה האחורית כדי לחשוף את האזור הכירורגי מעל עמוד השדרה הגב. הסר את הפרווה המגולחת מהאזור הכירורגי לפני עיקור אתר החתך. לחטא את האזור המגולח עם ספוגיות כותנה סטריליות ספוגות בנוזל יוד povidone ורוח כירורגית.
4. להדביק את כפות העכבר לאזור כירורגי כדי לייצב את החיה(איור 1A). מניח חלון סגלגל וילונות מעל העכבר (איור 1B).

2. כריתת למינקט

1. בצע חתך אנכי בקו האמצע ברמת החוליות T10 באמצעות אזמל כירורגי.
   1. אתר את התהליך הספיני של חוליות T10 כדי לקבוע את האתר של כריתת למינקט. גוף החוליה טמון מעט גולגולתי עד קצה התהליך הספיני⁸ (ראה איור 2). הקצה מונח בערך בנקודת האמצע של חוליית T11⁸.
   2. הפוך את החתך ~ 2.5 ס"מ ארוך, כך עמוד השדרה של חוליית T10 הוא בערך באמצע אורך החתך.
2. לשקף את העור ולחזור עם מפשקים.
   1. השתמש במקצות ישרים כדי להרים את העור מהפשיה הבסיסית. פעולה זו תיצור מקום למיקום המפשקים; אלה ישאירו את השדה הכירורגי פתוח.
3. לבצע ניתוח בוטה של רקמה תת עורית וfascia לחשוף את התהליכים ספינים.
   1. השתמש בקצה הקהה של האזמל כדי לבצע חתך קטן בקו האמצע ברקמה התת עורית וfascia הבסיסית כדי לחשוף את הקוצים של חוליות T9-T11. השתמש במקצות הקצה העדינים (לא חדים) כדי לבצע ניתוח בוטה ולשקף את הפשיה.
4. לפצל ולהפריד את השרירים para-spinous לחשוף את ה למינציה.
   1. השתמש בקצה הקהה של האזמל כדי לפצל את שרירי תא המטען האחורי ושרירים para-spinous לאורך הקוצים של חוליות T9-T11. השתמש במקצות הקצה הבוטה כדי לבצע ניתוח קהה של השרירים בשכבות ולחשוף את ה למינציה של החוליות. זה אמור למזער כל דימום.
      הערה: אם יש דימום, השתמשו בתמיסת מלח חמה (37°C) השקיה וספוגיות כותנה כדי לשלוט בו ולנקות דם מהשדה הכירורגי.
   2. השתמש באותם מפסים כדי ליצור כיסים קטנים סביב התהליכים הרוחביים של חוליית T10. השתמש מלקחיים מעוקלים כדי לייצב את הגוף החוליות T10 על ידי חיבור הבליטות שלה מתחת לתהליכים הרוחביים, בכיסים שנוצרו(איור 1C).
   3. יש לשטוף היטב את הלמינה T10 בתמיסת מלח חמה ולנגב בעדינות עם ספוגיות כותנה כדי לדמיין בבירור את פני השטח הכנים. ודא כי אין קבצים מצורפים שריר / רצועה להישאר לאורך פני השטח דו-צדדי.
5. השתמש במקדחה עם קצה דק (קוטר 0.55 מ"מ, 7 מ"מ אורך) כדי לשבור את הלמינה דו-צדדית.
   1. השתמש בקצה המקדחה כדי לעקוב אחר נתיב אנכי ממרחב בין-חוליות T9-T10 לחלל הבין-חוליות T10-T11 לאורך הלמינה T10, מבלי להדליק את המקדחה. זאת כדי להבטיח כי קצת המקדחה לא לתפוס כל רקמות(איור 1D).
   2. עכשיו מדליקים את המקדחה, לאט ובזהירות חופרים תעלה אנכית על ה למינה הימנית של חוליית T10. חלק זה של כריתת ה למינקטום אמור ליצור פגם כירורגי מדויק לאורך עובי העצם בקו אנכי ישר. שמור על האחיזה עם המגביות המעוקלות כדי לשמור על יציבות החוליה.
6. ודא כי קצה המקדחה אינו חודר דרך העצם ולפגוע בחוט השדרה. חזור על אותו תהליך בצד שמאל של ה למינה, שמירה על החוליה יציבה עם מפסים מעוקלים. להשיקה עם תמיסת מלח חמה כדי לשטוף את כל שברי העצם הנותרים.
7. הרם והסר את החלק האחורי של הקשת העצבית(איור 1F).
   1. השתמש במקצות הקצה העדינים הזוויתיים כדי לאחוז בתהליך הספיני ולהסיר את כל קטע הגב של הלמינה המופרד על-ידי הקידוח הדו-צדדי. להשכך ולהוות שוב אם יש דימום, כדי לדמיין בבירור את חוט השדרה החשוף מתחת לחלון כריתת ה למינציה(איור 1E).

3. טרנס-פעולה

1. לגרום לפגיעה בחוט השדרה על ידי תפליטה של חבל החשוף עם פרוסה אחת של הלהב.
   1. השתמש בלהב הצר והעגול כדי לחתוך את הכבל במרכז חלון כריתת ה למינקט. ודא לטאטא את המעמקים לרוחב של עמוד השדרה כדי לגרום לפגיעה בהתמרה מלאה(איור 1G).
2. אשר את השלמות של פציעת ההתמרמרות באמצעות מקצות הקצה העדינים הבוטים והסר את כל החיבורים הנותרים באתר הטרנס-שיח'.
3. שלוט בדימום אם יש, לפני סגירת השכבות הכירורגיות.
4. השתמש בתמיסת מלח חמה כדי להשיך ולנקה כל דימום המתרחש מגדמי חבל החוט הים החסומים. השתמש בספוגית כותנה כדי להפעיל לחץ עדין כדי להשיג המוסטאזיס במידת הצורך. תדחדל לא לדחוס את חוט השדרה.

4. סגר וטיפול מיידי לאחר הניתוח

1. מאחדים את השרירים ותפרים בשכבה.
   1. לאחר ההמוסטאזיס מושגת באתר transection, לשחרר את האחיזה מפס מעוקל על חוליות T10. להביא את הקצוות של השרירים הנקטעים יחד לאורך קו האמצע כדי להשיג apposition טוב.
   2. תפר את השרירים בשכבה באמצעות 5-0 polyglactin 910 תפרים נספג. ודא כי העקמומיות הטבעית של עמוד השדרה אינה גורמת למתח בקו התפר או לפתוח את התפרים, חשיפת אתר כריתת למינקט.
2. סגור רקמה תת עורית ועור.
   1. השתמש בתפרי משי 5-0 שאינם קליטים כדי לסגור את חתך העור. ודא כי אין דימום, קרישי דם או פסולת שנותרו מתחת לעור לפני הסגירה. השקיה סופית עם תמיסת מלח חמה עשויה להיות נחוצה בשלב זה.
3. תפסיק את ההרדמה. יש לשמור על החיה במשך 10-30 דקות עד להחלמה. בעל החיים צריך להישאר על משטח החימום למשך זמן זה. לספק ג'ל מים ומזון לח בכלוב.
4. לטיפול לאחר הניתוח, לכלול buprenorphine (פעמיים ביום), enrofloxacin (פעם ביום) עבור היומיים הראשונים מניעה. בנוסף, לרוקן ידנית את שלפוחית השתן לפחות פעמיים ביום, בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בעלי החיים.
   הערה: בעלי החיים בניסוי זה הוערכו פעמיים ביום עבור בריאותם הכללית ורווחתם, שכללה בדיקה לכאב מתמשך (כדי לתת מינונים נוספים של buprenorphine) או זיהום (enrofloxacin נוסף), מצב התזונה והלחות שלהם (לתת נוזלים להזרקה אם מיובש) וכל סימנים של כריתה אוטומטית (לספק טיפול בפצע אם כריתת אונה קלה). מומלץ מאוד כי היבטים אלה של טיפול לאחר הניתוח, לרבות החלטות המתת החסד, יקבעו בהנחיית הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים.

5. הערכת מודל הפציעה

1. ביסוס אובדן התפקוד המוטורי.
   1. להעריך את ההתנהגות המוטורית בעכברים הפצועים 2, 7, 14, 21 ו 28 ימים לאחר הפציעה בשדה פתוח באמצעות סולם עכבר באסו (BMS) כדי לקבוע את אובדן^{הפונקציה 9} (איור 3C-E).
2. אישור היסטולוגי של פציעה
   1. לקצור את חוט השדרה הפצוע עם עמודי החוליות לאחר המתת חסד (נעשה עם פחמן דו חמצני בניסוי זה, כפי שאושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים).
   2. לתקן את הרקמה על ידי צוללת לילה ב 4% paraformaldehyde ולהטעות את העצמות על ידי טיפול עם 20% אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) על פני 3 שבועות, החלפת EDTA טרי כל 48 שעות.
   3. הכן את הקוצים המותאם לחיתוך קריו וחתוך אותם לחלקים בעובי 30 μm.
   4. הר את החלקים על מגלשות זכוכית מצופה ג'לטין עבור התכתמות חיסונית עם נוגדנים נגד GFAP ו Hoechst 33342.
   5. תדמינו את השקופיות במיקרוסקופפלורסנט (איור 3א) ובצעו מדידותשל גודל הפציעה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (לדוגמה, תוכנת ניתוח ניקון - NIS Elements [איור 3B]).

תוצאות

השיטה המתובררת כפי שמתוארת באיור 1, כרוכה בייצוב הולם של העכבר(איור 1A) והדמיהטובה של עמוד השדרה ורקמותמצנחי דם (איור 1B). תהליך קוצני ולמינה ניתן לדמיין בבירור עם ניתוח שרירים מינימלי ואובדןדם (איור 1C,אזור מודגש). קידוח הקצה ים ...

Discussion

שיטה זו גורמת לפציעה מלאה של סוג ההתזזה ברמת החוליות T10 בעכברים, מה שגורם לשיתוק מוחלט של בעל החיים, מתחת לרמת הפציעה. בסך הכל, שיטה זו גורמת לדימום מינימלי, נזק משני זניח ופציעה יציבה, לשחזור. בהשוואה לשיטות שפורסמו בעבר של transection ללא כריתת למינקטוע¹⁰, שיטה זו מציעה את היתרונות ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug