JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم ونصف منهجيات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع باستخدام بعض نماذج الديدان الخيطية متعددة الاستخدامات ، بما في ذلك النخر الناجم عن القناة الأيونية المفرطة التنشيط وتكسية الأعصاب الناتجة عن البروتين ، لرصد وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية للأمراض العصبية المرتبطة بالعمر.

Abstract

أصبحت مكافحة الأمراض العصبية البشرية وإدارة تأثيرها الاجتماعي والاقتصادي المتفشي أولوية عالمية. وعلى الرغم من آثارها الضارة على نوعية حياة الإنسان ونظام الرعاية الصحية، فإن غالبية الاضطرابات العصبية البشرية لا تزال غير قابلة للشفاء ولا يمكن الوقاية منها. ولذلك، فإن تطوير تدخلات علاجية جديدة لمكافحة هذه الأمراض أصبح أمرا ملحا. التدهور المرتبط بالعمر في الدوائر العصبية والوظيفة يتم الحفاظ عليه تطوريا في الكائنات الحية المتنوعة مثل الدودة المنخفضة Caenorhabditis elegans والبشر ، مما يدل على أوجه التشابه في الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية. C. elegans هو نموذج وراثي مرن للغاية، والذي يوفر نظامًا عصبيًا يتميز جيدًا وشفافية الجسم وذخيرة متنوعة من التقنيات الجينية والتصويرية لتقييم نشاط الخلايا العصبية ومراقبة الجودة أثناء الشيخوخة. هنا، نقدم ونصف المنهجيات التي تستخدم بعض نماذج الديدان الخيطية متعددة الاستخدامات، بما في ذلك النخر الناجم عن القناة الأيونية (على سبيل المثال، deg-3(d) و mec-4(d)) وتجميع البروتين (على سبيل المثال، α-syunclein و Poly-glutamate) -الناجم عن السمية العصبية، لرصد وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية للانهيار العصبي المرتبط بالعمر. وسيؤدي الجمع بين هذه النماذج العصبية الحيوانية، إلى جانب الشاشات الوراثية والدوائية لمُعَدِّات موت الخلايا إلى فهم غير مسبوق للانهيار المرتبط بالعمر لوظيفة الخلايا العصبية، وسوف يوفر رؤى حاسمة ذات صلة واسعة بصحة الإنسان ونوعية الحياة.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين، وقد استخدمت على نطاق واسع C. elegans ككائن حي نموذجي للتحقيق في الآليات الجزيئية لوفيات الخلايا النخرية. C. elegans يقدم نظام عصبي بشكل استثنائي يتميز بشكل جيد ورسم الخرائط، وهيكل الجسم شفافة وذخيرة متنوعة من الأساليب الوراثية والتصوير لرصد في وظيفة الخلية الجسم الحي والبقاء على قيد الحياة طوال الشيخوخة. وهكذا، تم بالفعل تطوير العديد من النماذج الجينية C. elegans من التنكس العصبي لتقييم صلاحية الخلايا العصبية. على وجه الخصوص، نماذج النيماتودا الموصوفة جيدا والمستخدمة تشمل النخر الناجم عن قناة الأيونات فرط النشاط1،2،3 وموت الخلايا الناجمة عن زيادة تجميع البروتين4،5،6،7،8،9،10 والسكتة الدماغية الحرارة11،12، من بين أمور أخرى.

التعرض على المدى القصير لدرجات حرارة شبه قاتلة منحت المقاومة ضد موت الخلايا النخرية، الناجمة عن الإجهاد الحراري اللاحقة سواء في الديدان الخيطية والخلايا العصبية الثديية11. ومن المثير للاهتمام أن الشرط المسبق اليومي للنيماتودا في درجة حرارة مرتفعة خفيفة يحمي من التنكس العصبي ، والذي تسببه محفزات متنوعة ، مثل عدم التوازن الأيوني (على سبيل المثال ، mec-4 (u231) و / أو deg-3 (u662)) وتجميع البروتين (على سبيل المثال ، α-synuclein و polyQ40)11،13.

هنا، نحن وصف منهجيات متعددة الاستخدامات باستخدام C. elegans لرصد وتقييم التنكس العصبي المعتمد على العمر في النماذج الراسخة من الأمراض البشرية، مثل موت الخلايا الناجمة عن السمية، ومرض باركنسون وهنتنغتون. وعلاوة على ذلك، فإننا نؤكد على الدور العصبي الحماية من الحرارة المسبقة في عدة نماذج من تنكس الأعصاب. وسيؤدي الجمع بين هذه التقنيات والشاشات الوراثية و/أو العقاقيرية إلى تحديد وتوصيف خواص حفّاضات موت الخلايا الجديدة، مع الاهتمام العلاجي المحتمل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. موت الخلايا النخرية الناجم عن القنوات الأيونية المفرطة

ملاحظة: كسب من وظيفة الطفرات في الأسرة الجينية من degenerins، بما في ذلك mec-4 و deg-3 من بين أمور أخرى، والنتائج في توليد القنوات الأيونية مفرطة النشاط مما يؤدي إلى موت الخلايا النخرية من الخلايا العصبية مستقبلات اللمس الستة المطلوبة لchanchanosensation في الديدان3. النخر الناجم عن التحفيز الشاذ للتخلص من الgenerins يعرض العديد من أوجه التشابه الميكانيكية والمورفولوجية للسمية في الثدييات. الحفاظ على استقلاب الطاقة والكالسيوم التوازن له دور حاسم في البقاء على قيد الحياة العصبية خلال نخر11. ويمكن استخدام السلالات التالية لرصد موت الخلايا النخرية الناجمة عن قنوات أيونات مفرطة النشاط، mec-4 (u231) X و deg-3 (u662)V.

  1. صيانة و تزامن وإعداد الديدان المتحولة لفحص موت الخلايا النخرية
    1. اليوم 1: اختيار L4 يرقات mec-4 (u231) أو deg-3 (u662) نزوات الخيطيات المتحولة على وسائط نمو النعمة (NGM؛ 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 الجدول 1) لوحات بذر مع Escherichia القولونية (OP50) باستخدام منظار مجسم تشريح.
    2. ضع 10 يميات 4 لكل لوحة NGM بذر وتنموها عند درجة الحرارة القياسية 20 درجة مئوية.
    3. اليوم 5: غسل لوحات مع 1 مل من M9 العازلة(الجدول 1)وجمع الحيوانات في أنبوب 1.5 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 30 S وإزالة الفائق.
    5. إضافة 0.5 مل من حل التبييض (7 مل من H2O، 1 مل من 5 N NAOH و 2 مل من التبييض).
      ملاحظة: حل التبييض تفقد تدريجيا كفاءتها; وبالتالي ينبغي إعدادها يوميا.
    6. دوامة ومراقبة دورية حتى الديدان قد حل.
      ملاحظة: تجنب التبييض لفترات أطول من 5 دقائق لأن قدرة الأجنة على البقاء ستتأثر.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 30 S وإزالة الفائق.
    8. غسل مرتين بيليه (البيض) مع 1 مل من M9 العازلة.
    9. بعد الغسيل، resuspend البيض في 200 ميكرولتر من M9 العازلة واحتضان لهم لمدة 25 دقيقة في 34 درجة مئوية في حمام مائي.
    10. الحفاظ على مجموعة منفصلة من عينة التحكم (البيض) عند 20 درجة مئوية.
    11. ماصة 100 μL من السيطرة أو الحرارة صدمة معالجة البيض ووضعها على لوحات NGM غير المصنفة. كل لوحة تحتوي على ما لا يقل عن 100-200 بيضة.
    12. حضن البيض في 20 درجة مئوية حتى الفقس.
  2. تركيب يرقات L1 للفحص باستخدام تباين التداخل التفاضلي (DIC; نومارسكي) المجهري
    1. إعداد 2٪ منصات agarose.
    2. استخدم 1 مل من M9 العازلة لغسل لوحات وجمع اليرقات اليرقات النيماتودا L1 في أنابيب 1.5 مل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 10,000 x غم لمدة 30 s.
    4. إزالة فائقة والحفاظ على بيليه (الديدان الخيطية).
    5. إضافة 100 μL من 20 mM M9/levamisole العازلة ل التخدير nematodes.
      ملاحظة: تجنب أزيد الصوديوم كمخدر. أزايد الصوديوم يؤدي تلف الميتوكوندريا والإجهاد التأديدي مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تحريض موت الخلية
    6. ماشيت 10 ميكرولتر من M9/levamisole العازلة التي تحتوي على الديدان L1 وجبل لهم على منصات agarose 2 ٪(الجدول 1).
    7. ضع غطاء برفق في الجزء العلوي من العينة.
      ملاحظة: ختم الغطاء مع طلاء الأظافر للحفاظ على الرطوبة طوال عملية التصوير.
    8. مراقبة الديدان باستخدام تباين التداخل التفاضلي (DIC; نومارسكي) المجهر.
    9. درجة تنكس عصبي من الخلايا العصبية مستقبلات اللمس الستة عن طريق عد الخلايا مع مظهر مفتورة مميزة لكل نعمة.

2. البروتين الكلي الناجم عن تنكس الأعصاب

ملاحظة: يمكن استخدام السلالات التالية للتحقيق في مجاميع البروتين الناجمة عن السمية العصبية: (A) فرط التعبير عن الإنسان α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامينية، UA44: هو[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] و (B)فرط التعبير عن بروتين البولي لوتامين البشري (PolyQ) عموم الخلايا العصبية, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,,10.

  1. صيانة وتزامن وإعداد الديدان الخيطية المحورة وراثياً من أجل فحص التنكس العصبي
    1. استخدام تشريح stereomicroscope لرصد تطوير C. elegans والنمو.
    2. اليوم 1: مزامنة سكان الديدان الخيطية المعدلة وراثيا عن طريق قطف ونقل 15-20 يرقات L4 من كل سلالة على لوحات NGM الطازجة التي تم تصنيفها OP50.
      ملاحظة: استخدم ثلاث لوحات على الأقل من كل سلالة لكل حالة.
    3. احتضان والسماح للنيماتودا أن تنمو في درجة حرارة قياسية من 20 درجة مئوية.
    4. اليوم الثاني: قم بأداء الشروط المسبقة اليومية لمدة 30 دقيقة عن طريق نقل اللوحات في حاضنة تقع عند 34 درجة مئوية. ثم، والعودة الديدان الخيطية المسبقة مرة أخرى في درجة الحرارة القياسية من 20 درجة مئوية.
      ملاحظة: قد تكون الخلفيات الوراثية المختلفة حساسة لارتفاع درجة الحرارة لفترات طويلة من التعرض.
    5. (A)إذا كان التحقيق overexpression الإنسان α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامينية, UA44: هو[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: في اليوم 9, رصد 7 أيام من العمر النيماتويدات المعدلة وراثيا لوفيات الخلايا العصبية الدوبامين.
    6. (B) إذا كان التحقيق في فرط التعبير عن بروتين بوليغلوتامين الإنسان (PolyQ) عموم الخلايا العصبية, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: في اليوم 5, قياس مجاميع PolyQ العصبية في منطقة الرأس من الحيوانات المعدلة وراثيا 4 أيام من العمر التعبير عن Q40::YFP.
  2. تركيب العينات للفحص المجهري
    1. إعداد منصات agarose 2٪(الجدول 1).
    2. أضف 10 ميكرولتر من 20 mM M9/levamisole العازلة قطرة في وسط لوحة agarose.
    3. اختيار الديدان الخيطية المعدلة وراثيا كل منها ونقلها في قطرة M9/levamisole.
      ملاحظة: ضع 20-30 الديدان الخيطية لكل قطرة.
    4. ضع غطاءً برفق في الجزء العلوي من العينة.
      ملاحظة: ختم الغطاء مع طلاء الأظافر للحفاظ على الرطوبة طوال عملية التصوير.
    5. المضي قدما في الفحص المجهري للعينات المعنية.
  3. عملية الحصول وتحليل البيانات من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا المشاركة في التعبير عن α-synuclein وGFP cytosolic في الخلايا العصبية الدوبامين
    1. استخدام مجهر epifluorescence جنبا إلى جنب مع الكاميرا (على سبيل المثال، EVOS FL السيارات 2).
    2. اكتشاف والتقاط صور تى - المكدس لمنطقة الرأس عند التكبير 20x.
    3. حفظ وجمع الصور الإسقاط أقصى كثافة.
    4. المضي قدما في تحليل الصور المكتسبة.
    5. فحص الديدان المعدلة وراثياً للانكسار العصبي عن طريق تسجيل الخصائص الخلوية التالية، (ط) فقدان الفلوريسنس من الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP تحت المروج لـ dat-1، (ii) الخلايا العصبية التي تظهر سوما و/أو blebbing عصبي، أو نمو أو فقدان التشعب.
    6. استيراد البيانات وتحليلها باستخدام حزمة برامج (مثل Excel).

3. عملية الاستحواذ وتحليل البيانات من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن عموم الخلايا العصبية PolyQ40 تنصهر مع YFP

  1. استخدام مجهر epifluorescence جنبا إلى جنب مع الكاميرا (على سبيل المثال، EVOS FL السيارات 2).
  2. اكتشاف والتقاط صور تى - المكدس لمنطقة الرأس عند التكبير 20x.
  3. حفظ وجمع الصور الإسقاط أقصى كثافة.
  4. المضي قدما في تحليل الصور التي تم الحصول عليها باستخدام برامجيات فيجي.
  5. فتح الصور مع برنامج فيجي14.
  6. حدد تقسيم القنوات الأمر عبر الصورة والألوان القائمة المنسدلة.
    ملاحظة: احتفظ بصورة القناة الخضراء.
  7. استخدم أداة التحديد اليدوي لتعيين منطقة الفلورسنت ذات الأهمية (ROI؛ مثل الرأس).
  8. أضف عائد الاستثمار الخاص في مدير ROI عبر القائمة المنسدلة Analyze و Tools.
  9. طرح الخلفية إلى 50% عن طريق تحديد معالجة و طرح الخلفية.
  10. إعداد وتطبيق قيم العتبة عبر أمر القائمة صورة | ضبط | الحد الأدنى. الاحتفاظ بنفس قيم العتبة وتعيينها خلال تحليل الصور للتجربة بأكملها.
  11. حدد عائد الاستثمار الخاص من مدير عائد الاستثمار.
  12. تحليل عدد المجاميع البروتين باستخدام أمر القائمة تحليل وتحليل الجسيمات.
  13. كرر الخطوات 3.5-3.12 لكل صورة مكتسبة.
  14. نسخ قيم العرض من إطار نتائج منفصلة.
  15. لصق/استيراد النتائج وتحليلها باستخدام حزمة برامج.

4 - تقرير التحليل الإحصائي

  1. استخدام ما لا يقل عن 30 الديدان الخيطية لكل حالة تجريبية. تنفيذ ثلاثة نسخ متماثلة بيولوجية.
  2. استخدام برنامج التحليل الإحصائي إما لإجراء الطالب t-اختبار (مقارنة بين مجموعتين) أو ANOVA (مقارنة بين مجموعات متعددة) للتحليل الإحصائي مع p < 0.05 كما كبيرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

موت الخلايا النخرية الناجمة عن القنوات الأيونية شديدة النشاط
باستخدام الإجراءات المعروضة هنا، تم احتضان الأجنة المتحولة mec-4 (u231) و deg-3u662) لمدة 25 دقيقة عند 34 درجة مئوية أو الاحتفاظ بها عند درجة الحرارة القياسية البالغة 20 درجة مئوية. عند الفقس ، تم تحديد عدد جثث الخلايا ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا ، نقدم ونصف منهجيات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع للنمو ، والتزامن والفحص المجهري لبعض نماذج C. elegans متعددة الاستخدامات التي تحقق في التنكس العصبي المعتمد على العمر. على وجه الخصوص، نحن تقييم وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية من العمر المرتبطة انهيار الخلايا العصبية باستخدام فرط ت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر تشانيوتاكيس م. وكوناكيس ك. لتسجيل الفيديو وتحريره. يتم تمويل شركة K.P. من منحة من المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار والأمانة العامة للبحوث والتكنولوجيا (GSRT). يتم تمويل N.T. من خلال منح من مجلس البحوث الأوروبي (ERC - GA695190 - MANNA) ، وبرامج إطار عمل المفوضية الأوروبية ، ووزارة التعليم اليونانية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarSigma-Aldrich5040
AgaroseBiozym8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)Sigma-AldrichC5080
CholesterolSERVA Electrophoresis17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)ZeissAxio Vert A1
Dissecting stereomicroscopeNikon CorporationSMZ645
Epifluorescence microscopeThermo Fisher ScientificEVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)Sigma-AldrichP5237
image analysis softwareFijihttps://fiji.sc
KH2PO4EMD Millipore1,37,010
K2HPO4EMD Millipore1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software packageMicrosoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4EMD Millipore1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solutionSigma-AldrichN3503
PeptoneBD, Bacto211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)EMD Millipore1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis softwareGraphPad Software Inc., San Diego, USAGraphPad Prism software package
StreptomycinSigma-AldrichS6501
Tetramisole hydrochlorideSigma-AldrichL9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)

References

  1. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
  2. Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
  3. Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
  4. Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  5. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  6. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  7. Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
  8. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  9. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  10. Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
  11. Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
  12. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
  13. Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337(2017).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162 A synuclein Ionstasis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved