カエノハブディティス・エレガンスにおける年齢関連神経変性疾患のモデル化

要約

ここでは、過活性化イオンチャネル誘導性壊死やタンパク質凝集誘発神経毒性を含む、多目的な線虫モデルを利用した広くアクセス可能な方法論を紹介し、年齢関連神経変性疾患の細胞および分子基盤を監視および解剖する。

要約

ヒトの神経変性病理と闘い、その広範な社会経済的影響を管理することは、世界的な優先事項になりつつあります。人間の生活の質と医療システムに対する有害な影響にもかかわらず、人間の神経変性疾患の大半は依然として不治で予防不可能なままです。したがって、このような病気に対する新たな治療介入の開発は、緊急性を迫っている。神経回路および機能の年齢関連の悪化は、低ワーム のカエノハブディティス・エレガンス やヒトと同じくらい多様な生物において進化的に保存され、基礎となる細胞および分子メカニズムの類似性を意味する。 C.エレガンス は非常に可鍛性の高い遺伝モデルであり、よく特徴付けられる神経系、身体の透明性、および老化時の神経活動と品質管理を評価するための遺伝的およびイメージング技術の多様なレパートリーを提供する。ここでは、過活性化イオンチャネル誘発壊死( 例えば、deg-3(d) および mec-4(d))およびタンパク質凝集(例えば、α-シリン酸およびポリグルタミン酸)誘導神経毒性を含むいくつかの汎用性の高い線虫モデルを利用した方法論を紹介し、説明する。これらの動物神経変性モデルと細胞死モジュレーターの遺伝的および薬理学的スクリーンの組み合わせは、神経機能の年齢関連の内訳の前例のない理解をもたらし、人間の健康と生活の質に広く関連する重要な洞察を提供します。

概要

過去20年間、C.エレガンスは壊死細胞死の分子メカニズムを調べるモデル生物として広く使用されてきました。C.エレガンスは、非常によく特徴付け、マッピングされた神経系、透明な身体構造、および老化を通して生体内細胞機能および生存を監視する遺伝的およびイメージング方法の多様なレパートリーを提供する。したがって、神経変性のいくつかのC.エレガンス遺伝モデルは、神経細胞の生存率を評価するために既に開発されている。^,特に、よく説明され、使用される線虫モデルは、タンパク質凝集^{,,,,,44、5、6、7、8、9、105}および熱中ストローク^{,896711、12、}とりわけ増加したタンパク質凝集によって引き起こされる多動¹¹性イオンチャネル誘導性壊死^{12101、2、3}および細胞死を含む。^{3 ,}

致死下の温度への短期的な暴露は、壊死細胞死に対する耐性を与え、線虫および哺乳類ニューロン¹¹の両方におけるその後の熱ストレスによって引き起こされた。興味深いことに、穏やかな高温での線虫の毎日の予備調整は、イオン的不均衡(例えば、mec-4(u231)および/またはdeg-3(u662))およびタンパク質凝集(例えば、α-シヌクレインおよびPolyQ40)11,13のような多様な刺激によって引き起こされる神経変性から^11,13保護する。

ここでは 、C.エレガンス を使用して、興奮性毒性誘発細胞死、パーキンソン病およびハンチントン病などのヒト疾患の確立されたモデルにおける年齢依存性神経変性を監視および評価するための汎用性の高い方法論について説明する。さらに、我々は、神経変性のいくつかのモデルにおける熱プレコンディショニングの神経保護的役割を強調する。これらの技術を遺伝的および/または薬理学的スクリーンと組み合わせることで、新しい細胞死モジュレーターの同定と特性化が生じ、潜在的な治療上の関心を持つ。

プロトコル

1. 多動性イオンチャネルによる壊死細胞死

注:デゲネリンの遺伝子ファミリーにおける機能の利益変異は、とりわけ mec-4 および deg-3 を含む、ワーム³のメカノセンセーションに必要な6つのタッチ受容体ニューロンの壊死細胞死を引き起こす多動性イオンチャネルの生成をもたらす。デゲネリンの異常刺激によって誘発される壊死は、哺乳類における興奮毒性に対するいくつかの機械学的および形態学的類似性を示す。エネルギー代謝とカルシウム恒常性の維持は、壊死中の神経細胞生存に重要な役割を持^{っています 11}.以下の株は、多動性イオンチャネル 、mec-4(u231)X および deg-3(u662)Vによって引き起こされる壊死細胞死を監視するために使用することができる。

1. 壊死の検査のための変異型ワームの維持、同期および調製
   1. 1日目: メック-4(u231) または deg-3(u662) 変異線虫のL4幼虫を線虫成長培地(NGM)にピックする。 表 1)解剖の天体顕微鏡を用いた 大腸菌 (OP50)をまいたプレート。
   2. 播種されたNGMプレートごとに10 L4線虫を配置し、20°Cの標準温度で成長させます。
   3. 5日目:M9バッファー(表1)の1mLでプレートを洗浄し、1.5mLチューブで動物を採取します。
   4. 30 sの10,000 x g で遠心分離機を使用し、上清を除去します。
   5. 漂白液0.5mL(H2O7 mL、5₂N NaOHの1mL、漂白剤2mL)を加えます。
      注:漂白ソリューションは徐々にその効率を失います。したがって、毎日準備する必要があります。
   6. ボルテックスと監視は、ワームが溶解するまで定期的に行います。
      注意:胚の生存率が影響を受けるため、5分以上の期間は漂白しないでください。
   7. 30 sの10,000 x g で遠心分離機を使用し、上清を除去します。
   8. ペレット(卵)を1mLのM9バッファーで2回洗います。
   9. 洗浄後、M9バッファー200μLで卵を再懸濁し、水浴中の34°Cで25分間インキュベートします。
   10. コントロールサンプル(卵)の別のグループを20°Cに維持します。
   11. ピペット100μLのコントロールまたは熱ショック処理卵を、種なしNGMプレートに置きます。各プレートには、少なくとも100〜200個の卵が含まれています。
   12. 卵を孵化するまで20°Cでインキュベートした。
2. 差動干渉コントラスト(DIC;ノマルスキー)顕微鏡
   1. 2%アガロースパッドを準備します。
   2. M9バッファーの1 mLを使用してプレートを洗浄し、1.5 mLチューブでL1幼虫を採取します。
   3. 遠心分離機は10,000 x g で30s。
   4. 上清を取り除き、ペレット(線虫)を保管してください。
   5. 20 mM M9/レバミソールバッファーの100 μLを加え、線虫を麻酔します。
      注:麻酔薬としてアジドナトリウムを避けてください。アジドナトリウムは、最終的に細胞死誘導につながるミトコンドリアの損傷と酸化ストレスを引き起こす
   6. L1ワームを含むM9/レバミゾールバッファーのピペット10 μLを2%アガロースパッドに取り付けます(表1)。
   7. サンプルの上部にカバースリップをそっと置きます。
      注:マニキュアでカバースリップを密封して、イメージングのプロセス全体で湿度を維持します。
   8. 微分干渉コントラスト(DIC;)ノマルスキー)顕微鏡。
   9. 線虫ごとに特徴的な空胞体外観を有する細胞を数えることによって、6つのタッチ受容体ニューロンの神経変性をスコア付けする。

2. タンパク質凝集誘発神経変性

注:以下の株は、タンパク質凝集体誘発神経毒性を調査するために使用することができる:(A)ドーパミン作動性ニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの過剰発現、 UA44: [baIn1; p_dat-1α-syn, p_dat-1GFP] および(B) ヒトポリグルタミンタンパク質 (PolyQ) 汎神経細胞の過剰発現, AM101: rmsIs110[p_rgef-1Q40::YFP] Is^6,,10.

1. 神経変性アッセイ用トランスジェニック線虫の維持・同期・調製
   1. 解剖の実体顕微鏡を使用して 、C.エレガンスの 発達と成長を監視します。
   2. 1日目:新たに種を付けたNGMプレート上の各株の15-20 L4幼虫を摘み取り、移送することにより、トランスジェニック線虫の集団を同期させます。
      注: 各ひずみのプレートを少なくとも 3 枚使用します。
   3. インキュベートし、線虫を20°Cの標準温度で成長させます。
   4. 2日目:34°Cにセットしたインキュベーターでプレートを移し、30分間のプレコンディショニングを行います。次いで、予め調整された線虫を20°Cの標準温度で戻す。
      注:異なる遺伝的背景は、長時間の暴露のために高温に敏感である可能性があります。
   5. (A) ドーパミン作動性ニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの過剰発現を調査する場合、UA44: [baIn1; p_dat-1α-syn, p_dat-1GFP]:9日目に、ドーパミン作動性神経細胞死に対する7日前のトランスジェニック線虫を監視する。 Is
   6. (B) ヒトポリグルタミンタンパク質(PolyQ)汎神経細胞の過剰発現を調べる場合 、AM101:rmsIs110[p_rgef-1Q40::YFP]:5日目に、Q40::YFPを発現する4日間のトランスジェニック動物の頭部領域における神経ポリQ凝集体を測定する。
2. 顕微鏡検査用サンプルの取り付け
   1. 2%アガロースパッドを準備する(表1)。
   2. アガロースパッドの中央に20 mM M9/レバミソールバッファードロップの10 μLを追加します。
   3. それぞれのトランスジェニック線虫を選び、M9/レバミソールドロップで転送します。
      注:1滴あたり20-30線虫を置きます。
   4. サンプルの上部にカバースリップをそっと置きます。
      注:マニキュアでカバースリップを密封して、イメージングのプロセス全体で湿度を維持します。
   5. それぞれのサンプルの顕微鏡検査に進みます。
3. ドーパミン作動性ニューロンにおけるα-シヌクレインおよびサイトゾースGFPを共同発現するトランスジェニック線虫の取得過程とデータ解析
   1. カメラと組み合わせた蛍光顕微鏡(例えば、EVOS FLオート2)を使用してください。
   2. 20倍の倍率でヘッド領域のZスタック画像を検出してキャプチャします。
   3. 最大強度投影画像を保存して収集します。
   4. 取得した画像の解析に進みます。
   5. 以下の細胞特性をスコアリングすることにより、神経変性のトランスジェニックワームを調べ 、(i)dat-1のプロモーター下でGFPを発現するニューロンからの蛍光の喪失、(ii)腫および/または軸索の出血、成長または樹状障害を示すニューロンを調べる。
   6. ソフトウェア パッケージ (Excel など) を使用してデータをインポートおよび分析します。

3. YFPと融合した汎神経細胞質PolyQ40を発現するトランスジェニック線虫の取得過程とデータ解析

1. カメラと組み合わせた蛍光顕微鏡(例えば、EVOS FLオート2)を使用してください。
2. 20倍の倍率でヘッド領域のZスタック画像を検出してキャプチャします。
3. 最大強度投影画像を保存して収集します。
4. フィジーソフトウェアを使用して取得した画像の分析に進みます。
5. フィジープログラム¹⁴で画像を開きます。
6. [画像と色] ドロップダウン メニューから [チャンネルの分割] コマンドを選択します。
   注: 緑色のチャンネルイメージを保持します。
7. フリーハンド選択ツールを使用して、対象の蛍光領域(ROI、例えばヘッド)を手動で設定します。
8. [分析とツール]ドロップダウン メニューから、ROI マネージャの ROIを追加します。
9. [ プロセス ] と [背景を減算] を選択して、背景を 50% に引きます。
10. メニューコマンド 画像 を使用してしきい値を設定および適用する | 調整 | しきい値:実験全体の画像解析全体を通して、同じしきい値を維持し、設定します。
11. ROI マネージャから、対応する ROI を選択します。
12. メニューコマンド「パーティクルの分析と分析」コマンドを使用して、タンパク質凝集体の数を分析します。
13. 取得した画像ごとに手順 3.5 ~ 3.12 を繰り返します。
14. 別の結果ウィンドウから表示値をコピーします。
15. ソフトウェア パッケージを使用して結果を貼り付け/インポートし、分析します。

4. 統計分析の報告

1. 実験条件ごとに少なくとも30線虫を使用してください。3つの生物学的複製を行う。
2. 統計的分析ソフトウェアを使用して、学生 t-検定(2つのグループ間の比較)またはANOVA(複数グループ間の比較)を実施して、p<0.05を有意として統計分析します。

結果

多動性イオンチャネルによる壊死細胞死
ここで示した手順を用いて、mec-4(u231)およびdeg-3u662)変異胚を34°Cで25分間インキュベートするか、または20°Cの標準温度で保った。孵化の際、両群のL1幼虫段階で神経細胞の死体数が決定された。壊死細胞死は、熱ショック予調卵から孵化した線虫において減少する(図1A-1B)。

ディスカッション

ここでは、年齢依存性神経変性を調査するいくつかの汎用性の高いC.エレガンスモデルの成長、同期および顕微鏡検査のための広くアクセス可能な方法論を紹介し、説明する。特に、過活性化イオンチャネル誘導性壊死およびタンパク質凝集誘発神経毒性^{,,1、2、3、4、5、7、9、10、112,3}を用いて、¹年?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)	Zeiss		Axio Vert A1
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
Epifluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific		EVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Tetramisole hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]			Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)