建模年龄相关的神经退行性疾病在 卡诺哈布迪蒂斯埃利根

摘要

在这里，我们介绍和描述广泛的方法，利用一些多功能线虫模型，包括高活性离子通道诱导坏死和蛋白质聚合诱导神经毒性，以监测和解剖年龄相关的神经退行性疾病的细胞和分子基础。

摘要

对抗人类神经退行性疾病并管理其普遍的社会经济影响正成为全球优先事项。尽管它们对人的生命质量和保健系统有有害影响，但大多数人类神经退行性疾病仍然无法治愈和不可预防。因此，针对此类疾病开发新的治疗干预措施正成为当务之急。神经元回路和功能的年龄相关恶化在像低蠕虫卡诺哈布迪炎和人类等不同生物体中进化地得到Caenorhabditis elegans保存，这表示在底层细胞和分子机制上具有相似性。C. elegans是一种高度可塑性的基因模型，它提供了良好的神经系统、身体透明度以及多种遗传和成像技术，用于评估衰老期间的神经元活动和质量控制。在这里，我们介绍和描述利用一些多功能线虫模型的方法，包括高活性离子通道诱导坏死（例如，deg-3（d）和mec-4（d）和蛋白质聚合（例如，α-syunclein和多聚谷氨酸）诱导神经毒性，以监测和解剖与年龄相关的神经元分解的细胞和分子基础。这些动物神经退化模型，加上细胞死亡调节剂的遗传和药理学屏幕，将导致对神经元功能与年龄相关的分解的前所未有的理解，并提供与人类健康和生活质量具有广泛相关性的关键见解。

引言

在过去的二十年里，C.elegans被广泛用作研究坏死细胞死亡的分子机制的模型有机体。C. elegans提供特别良好的特征和映射的神经系统、透明的身体结构和多种遗传和成像方法，以监测体内细胞功能和整个衰老过程中的生存。因此，已经开发了几个C.elegans神经退化的遗传模型来评估神经元的生存能力。特别是，描述良好的线虫模型包括多活性离子通道诱发坏死^{1,1，2，3,3}和细胞死亡触发增加蛋白质聚集^{4，5，6，7，8，9，105,6,7,8,9,10}和中暑⁴11，12，等等。^11,12

短期暴露在亚致命温度下，对坏死细胞死亡产生抵抗力，由线虫和哺乳动物神经元11的后续热应^激触发。有趣的是，线虫在温和的高温下每天预置，可防止神经退化，而神经退化是由多种刺激引起的，例如离子不平衡（例如，mec-4（u231）和/或deg-3（u662）和蛋白质聚集（例如，α-合成素和聚Q40）11，13。^11,13

在这里，我们描述了使用 C.elegans来 监测和评估人类疾病成熟模型中依赖年龄的神经退化的通用方法，如兴奋性触发细胞死亡、帕金森氏症和亨廷顿舞蹈症。此外，我们强调热预置在几种神经退化模型中的神经保护作用。这些技术与遗传和/或药理学筛选相结合，将识别和鉴定新型细胞死亡调节剂，具有潜在的治疗兴趣。

研究方案

1. 由超活性离子通道引起的坏死细胞死亡

注:在退化素的基因家族，包括mec-4 和 deg-3 等，功能增益突变导致产生多活性离子通道，触发蠕虫³中机械化所需的六个接触受体神经元的坏死细胞死亡。退化素的异常刺激引起的坏死与哺乳动物的兴奋毒性有若干机械和形态相似性。维持能量代谢和钙平衡对坏死11期间神经元的生存^{起着至关重要的作用}。以下菌株可用于监测由超活性离子通道，mec-4（u231）X和deg-3（u662）V触发的坏血细胞死亡。

1. 维持、同步和制备突变蠕虫，以检查坏死细胞死亡
   1. 第1天:在线虫生长介质上选取M.4（u231）或deg-3（u662）突变线虫的L4幼虫（NGM;表1）使用解剖立体显微镜用大肠杆菌 （OP50） 播种的板。
   2. 每个种子NGM板放置10个L4线虫，并在20°C的标准温度下生长。
   3. 第5天:用1 mL的M9缓冲液清洗盘子（表1），用1.5mL管收集动物。
   4. 以 10，000 x g 的 30 s 离心并取出上一代。
   5. 加入 0.5 mL 漂白溶液（7 mL 的 H₂O、1 mL 的 5 N NaOH 和 2 mL 的漂白剂）。
      注:漂白溶液逐渐失去效率;因此，它应该每天准备。
   6. 漩涡和定期监测，直到蠕虫溶解。
      注:避免漂白时间超过5分钟，因为胚胎的生存能力将受到影响。
   7. 以 10，000 x g 的 30 s 离心并取出上一代。
   8. 用 1 mL 的 M9 缓冲液清洗两倍的颗粒（鸡蛋）。
   9. 洗涤后，在200μL的M9缓冲液中重新煎蛋，并在34°C的水浴中孵育25分钟。
   10. 在 20°C 下保持一组单独的控制样品（鸡蛋）。
   11. 移液 100 μL 控制或热冲击处理鸡蛋，并把它们放在非种子NGM板。每个盘子至少含有100-200个鸡蛋。
   12. 在20°C下孵化卵子，直到孵化。
2. 使用差分干涉对比度安装 L1 幼虫以进行检查（DIC;诺马斯基）显微镜
   1. 准备2%的加糖垫。
   2. 使用 1 mL 的 M9 缓冲液清洗板，并在 1.5 mL 管中收集 L1 幼虫线虫。
   3. 30 s 的离心机为 10，000 x g。
   4. 拆下上一液并保留颗粒（线虫）。
   5. 加入 100 μL 的 20 mM M9/levamisole 缓冲液，对线虫进行麻醉。
      注:避免作为麻醉剂使用亚齐德钠。阿齐德钠触发线粒体损伤和氧化应激，最终导致细胞死亡诱导
   6. 含有L1蠕虫的M9/levamisole缓冲液10μL，并安装在2%的气垫上（表1）。
   7. 轻轻地将盖玻片放在样品顶部。
      注:用指甲油密封盖玻片，在整个成像过程中保持湿度。
   8. 使用差分干扰对比度观察蠕虫（DIC;诺马斯基）显微镜。
   9. 通过计算具有每个线虫特有的 vacud 外观的细胞，对六个接触受体神经元的神经退化进行评分。

2. 蛋白质聚合诱导神经退化

注:以下菌株可用于研究蛋白质聚合引起的神经毒性:（A） 多巴胺神经元中人类β-合成素的过表达， UA44: Is是 [baIn1; p_dat-1]- syn， p_dat-1Gfp] 和 （B） 过度表达人类多聚葡萄糖胺蛋白 （PolyQ） 泛神经， AM101: rmsIs110[p_rgef-1Q40:YFP] 6^，10。⁶

1. 神经退化测定转基因线虫的维护、同步和制备
   1. 使用解剖立体显微镜来监测 C.elegans的 发育和生长。
   2. 第1天:通过采摘和转移15-20个L4幼虫在新鲜OP50种子的NGM盘上，同步转基因线虫的种群。
      注:每个条件至少使用三个应变板。
   3. 孵育，让线虫在20°C的标准温度下生长。
   4. 第2天:在34°C的培养箱中转移板，每天进行30分钟的预置。然后，将预置线虫返回20°C的标准温度。
      注:不同的遗传背景可能长期对高温敏感。
   5. （A） 如果调查多巴胺神经元中人类[-合成素）的过度表达，UA44:是[baIn1;p_{dat-1+-syn，pdat-1}GFP]:在第9天，监测7天大的转基因线虫多巴胺神经细胞死亡。
   6. （B） 如果调查人类多糖胺蛋白（PolyQ）泛神经元的表达过度，AM101:rmsIs110 [p_rgef-1Q40::YFP]:在第5天，测量4天大转基因动物头部区域的神经元聚氨酯聚集物，表达Q40:YFP。
2. 安装样品进行显微检查
   1. 准备2%的加糖垫（表1）。
   2. 在阿加罗斯垫的中心加入 10 μL 的 20 mM M9/levamisole 缓冲液滴。
   3. 挑选各自的转基因线虫，并在M9/levamisole滴中转移它们。
      注:每滴放置20-30个线虫。
   4. 轻轻地在样品顶部放置盖玻片。
      注:用指甲油密封盖玻片，在整个成像过程中保持湿度。
   5. 继续对各自的样品进行微观检查。
3. 多巴胺神经元中转基因线虫共表达β-合成素和细胞细胞细胞性GP的采集过程和数据分析
   1. 使用与相机结合的荧光显微镜（例如，EVOS FL Auto 2）。
   2. 以 20 倍的放大倍率检测和捕获头部区域的 z 堆栈图像。
   3. 保存并收集最大强度投影图像。
   4. 继续分析获取的图像。
   5. 通过评分以下细胞特征检查转基因蠕虫的神经退化，（i） 在 dat-1 的启动下，从表达 GFP的神经元中失去荧光，（ii） 神经元显示索玛和/或斧头出血、生长或树突损失。
   6. 使用软件包（例如 Excel）导入和分析数据。

3. 转基因线虫的采集过程和数据分析，表达泛神经聚Q40与YFP融合

1. 使用与相机结合的荧光显微镜（例如，EVOS FL Auto 2）。
2. 以 20 倍的放大倍率检测和捕获头部区域的 z 堆栈图像。
3. 保存并收集最大强度投影图像。
4. 继续使用斐济软件分析采集的图像。
5. 打开图像与斐济程序¹⁴.
6. 通过"图像和颜色"下拉菜单选择"拆分通道"命令。
   注:保留绿色通道图像。
7. 使用 徒手选择 工具手动设置感兴趣的荧光区域（ROI;例如头部）。
8. 通过分析和工具下拉菜单在 ROI 管理器中添加相应的 ROI。
9. 通过选择"过程"和"减去背景"将背景减去 50%。
10. 通过菜单命令"图像" 设置和应用阈 值 | 调整 | 阈值。在整个实验的图像分析中保持并设置相同的阈值。
11. 从 ROI 管理器中选择相应的 ROI。
12. 使用菜单命令"分析和分析粒子"分析蛋白质聚集体的数量。
13. 对每个采集的图像重复步骤 3.5-3.12。
14. 从单独的"结果"窗口复制显示值。
15. 使用软件包粘贴/导入和分析结果。

4. 报告统计分析

1. 每个实验条件至少使用 30 个线虫。执行三个生物复制。
2. 使用统计分析软件进行学生 t-测试（两组之间的比较）或 ANOVA（多个组之间的比较）进行统计分析，p < 0.05 为重要。

结果

过度活跃的离子通道引起的坏死细胞死亡
使用此处介绍的程序，mec-4（u231）和deg-3u662）突变胚胎要么在34°C下孵育25分钟，要么保持在20°C的标准温度下。孵化后，在两组动物的L1幼虫阶段确定神经元细胞尸体的数量。从热冲击预置卵子中孵化的线虫中，坏死细胞死亡减少（图1A-1B）。

蛋白质聚合诱导神经退...

讨论

在这里，我们介绍和描述广泛访问的方法，增长，同步和微观检查一些多功能的C.elegans模型研究年龄依赖性神经退化。特别是，我们使用高活性离子通道诱发坏死和蛋白质聚集诱导^,神经毒性^{,,,,1、2、3、4、5、7、9、10、11,2}来评估和剖^析与年龄相关的神经元崩溃的^7,

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)	Zeiss		Axio Vert A1
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
Epifluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific		EVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Tetramisole hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]			Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)