Моделирование Возраст-ассоциированных нейродегенеративных заболеваний в Caenorhabditis elegans

Резюме

Здесь мы вводим и описываем широко доступные методологии с использованием некоторых универсальных моделей нематод, включая гиперактивированный ионный канал индуцированного некрозания и белоковой нейротоксичности, для мониторинга и вскрытия клеточных и молекулярных основ возрастных нейродегенеративных заболеваний.

Аннотация

Борьба с нейродегенеративными патологиями человека и управление их всепроникающим социально-экономическим воздействием становится глобальным приоритетом. Несмотря на их пагубное воздействие на качество жизни человека и систему здравоохранения, большинство нейродегенеративных расстройств человека по-прежнему остаются неизлечимыми и не предотвратимыми. Поэтому разработка новых терапевтических вмешательств против таких недугов становится актуальной. Возрастное ухудшение нейронных цепей и функций эволюционно сохраняется в организмах, столь же разнообразных, как скромный червь Caenorhabditis elegans и людей, означающих сходство в основных клеточных и молекулярных механизмов. C. elegans является очень податливой генетической моделью, которая предлагает хорошо охарактеризованную нервную систему, прозрачность тела и разнообразный репертуар генетических и визуальных методов для оценки нейронной активности и контроля качества во время старения. Здесь мы вводим и описываем методологии, используя некоторые универсальные модели нематод, в том числе гиперактивированный ионный ионный некроз (например, deg-3 (d) и mec-4 (d)) и белковый агрегат (например, протеиновый разбивка и поли-глутамат) Сочетание этих моделей нейродегенерации животных, а также генетические и фармакологические экраны для модуляторов смерти клеток приведет к беспрецедентному пониманию возрастного распада нейронов и обеспечит критическое понимание с широким значением для здоровья человека и качества жизни.

Введение

За последние два десятилетия C. elegans широко использовался в качестве модельного организма для исследования молекулярных механизмов смерти некротических клеток. C. elegans предлагает исключительно хорошо охарактеризованную и отображенную нервную систему, прозрачную структуру тела и разнообразный репертуар генетических и визуальных методов для мониторинга клеточной функции in vivo и выживания на протяжении всего старения. Таким образом, несколько C. elegans генетические модели нейродегенерации уже были разработаны для оценки жизнеспособности нейронов. В частности, хорошо описанные и используемые модели нематод включают гиперактивный ионный канал индуцированного некрозания^1,,2,3 и гибель клеток, вызванную повышенной агрегацией белка^{,4,5,6,7,8,,9,,10} и тепловой удар^11,12, среди других.

Краткосрочное воздействие сублетальных температур придавало сопротивление против смерти некротических клеток, вызванное последующим тепловым стрессом как в нематодах, так и в нейронах млекопитающих^11. Интересно, что ежедневное предурочича нематод при мягкой повышенной температуре защищает от нейродегенерации, которая наносится различными стимулами, такими как ионный дисбаланс (например, mec-4 (u231) и/или deg-3 (u662)) и агрегация белка (например,^,1311-

Здесь мы описываем универсальные методологии с использованием C. elegans для мониторинга и оценки возрастной нейродегенерации в устоявшихся моделях заболеваний человека, таких как эксцитотоксичность с вызванной гибелью клеток, болезнь Паркинсона и Гентингтона. Кроме того, мы подчеркиваем нейропротекторную роль тепловых предпосылок в нескольких моделях нейродегенерации. Сочетание этих методов вместе с генетическими и / или фармакологических экранов приведет к выявлению и характеристике новых модуляторов смерти клеток, с потенциальным терапевтическим интересом.

протокол

1. Некротическая смерть клеток, вызванная гиперактивными ионационными каналами

ПРИМЕЧАНИЕ: Прибыль функции мутаций в генном семействе дегенеров, в том числе mec-4 и deg-3 среди других, приводит к генерации гиперактивных ионных каналов запуска некротических клеток смерти шести нейронов сенсорных рецепторов, необходимых для механосенсации у червей³. Некроз, вызванный аномальной стимуляцией дегенеров, показывает несколько механистических и морфологических сходств с эксцитотоксиностью у млекопитающих. Поддержание энергетического метаболизма и гомеостаза кальция играет решающую роль на выживание нейронов во время некроза^11. Следующие штаммы могут быть использованы для мониторинга смерти некротических клеток, вызванных гиперактивными иононационными каналами, mec-4 (u231)X и deg-3 (u662)V.

1. Обслуживание, синхронизация и подготовка червей-мутантов для исследования некротической клеточной смерти
   1. День 1: Выберите L4 личинок mec-4 (u231) или deg-3 (u662) мутантных нематод на Nematode Growth Media (NGM; Таблица 1) пластины, посеянные кишечной палочкой (OP50) с помощью рассекая стереомикроскопа.
   2. Поместите 10 нематод L4 на посевную пластину NGM и выращивайте их при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
   3. День 5: Вымойте пластины с 1 mL буфера M9(Таблица 1) и собирать животных в 1,5 мл трубки.
   4. Центрифуга на 10000 х г на 30 с и удалить супернатант.
   5. Добавьте 0,5 мл отбеливающего раствора (7 мл H₂O, 1 мл 5 N NaOH и 2 мл отбеливателя).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отбеливание решение постепенно теряют свою эффективность; следовательно, она должна быть подготовлена ежедневно.
   6. Вихрь и периодически контролировать, пока черви не растворяются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте отбеливания в течение периодов более 5 минут, потому что жизнеспособность эмбрионов будет затронута.
   7. Центрифуга на 10000 х г на 30 с и удалить супернатант.
   8. Вымойте дважды гранулы (яйца) с 1 мл буфера M9.
   9. После мытья, повторно яйца в 200 мл буфера M9 и инкубировать их в течение 25 мин при 34 градусов по Цельсию в водяной бане.
   10. Поддерживайте отдельную группу контрольного образца (яйца) при 20 градусах Цельсия.
   11. Pipette 100 l контроля или теплового шока обработанных яйца и поместить их на несеяные пластины NGM. Каждая тарелка содержит не менее 100-200 яиц.
   12. Инкубируется яйца при 20 градусов по Цельсию до вылупления.
2. Монтаж личинок L1 для исследования с использованием контраста дифференциальных помех (DIC; Nomarsky) микроскопия
   1. Подготовьте 2% агарозных подушечек.
   2. Используйте 1 мл буфера M9 для мытья пластин и сбора нематод личинок L1 в 1,5 мл труб.
   3. Центрифуга на 10000 х г на 30 с.
   4. Удалить супернатант и сохранить гранулы (нематоды).
   5. Добавьте 100 мл буфера 20 мМ М9/левамизола для обезболивания нематод.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте азида натрия в качестве анестезии. Азид натрия вызывает митохондриальное повреждение и окислительный стресс, что в конечном итоге приводит к индукции клеточной смерти
   6. Pipette 10 л M9/levamisole буфер, содержащий L1 червей и смонтировать их на 2% агарозы колодки (Таблица 1).
   7. Аккуратно поместите крышку поверх образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Печать крышки с лаком для ногтей для сохранения влажности на протяжении всего процесса визуализации.
   8. Наблюдать за червями с помощью контраста дифференциальных помех (DIC; Номарская) микроскопия.
   9. Оценка нейродегенерации шести нейронов сенсорных рецепторов путем подсчета клеток с характерным vacuolated внешний вид на нематод.

2. Белок агрегат-индуцированной нейродегенерации

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие штаммы могут быть использованы для исследования белковых агрегатов индуцированной нейротоксичности: ()переэкспрессия человека - синуклеин в дофаминергических нейронов, UA44: Является ли«baIn1; p_dat-1»-syn,p_dat-1GFP и(B)переэкспрессией человеческого белка полиглутамина (Поли) пан-нейронально, AM101: rmsIs110_{»p rgef-1}»40:YFP »^6,10.

1. Обслуживание, синхронизация и подготовка трансгенных нематод для анализа нейродегенерации
   1. Используйте вскрывающий стереомикроскоп для мониторинга развития и роста C. elegans.
   2. День 1: Синхронизация популяции трансгенных нематод путем сбора и передачи 15-20 L4 личинок каждой нагрузки на свежевысащенные ПЛАСТИНы NGM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте по крайней мере три пластины каждого штамма на состояние.
   3. Инкубировать и дать нематодам расти при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
   4. День 2: Выполните ежедневные предварительные условия в течение 30 минут, переведя пластины в инкубатор, установленный при 34 градусов по Цельсию. Затем верните предусловные нематоды обратно при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные генетические фоны могут быть чувствительны к высокой температуре в течение длительного периода воздействия.
   5. (A) Если исследовать переэкспрессию человека- синуклеин в дофаминергических нейронов, UA44: Является ли"baIn1; p_dat-1"-syn, p_dat-1GFP: на 9-й день, мониторинг 7-дневных трансгенных нематод для дофаминергической смерти нейрональных клеток.
   6. (B) Если исследовать переэкспрессию человеческого белка полиглутамина (Поли) пан-нейронально, AM101: rmsIs110_{(p rgef-1::YFP):}на 5-й день, измерьте нейрональные агрегаты Поли в области головы 4-дневного трансгенного животных, выражающих 40::YFP.
2. Монтаж образцов для микроскопического исследования
   1. Подготовка 2% агароз колодки (Таблица 1).
   2. Добавьте 10 мл 20 мМ ММ М9/левамизоле буферного падения в центре агарозной площадки.
   3. Выберите соответствующие трансгенные нематоды и перенесите их в падение M9/levamisole.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Место 20-30 нематод на каплю.
   4. Поместите аккуратно крышку на верхней части образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Печать крышки с лаком для ногтей для сохранения влажности на протяжении всего процесса визуализации.
   5. Приступить к микроскопическому исследованию соответствующих образцов.
3. Процесс приобретения и анализ данных трансгенных нематод, со-выражающих синуклеин и цитозоликический GFP в дофаминергических нейронах
   1. Используйте эпифлюоресценциальный микроскоп в сочетании с камерой (например, EVOS FL Auto 2).
   2. Обнаружение и захват z-стек изображения головного области на 20x увеличение.
   3. Сохранить и собрать изображения проекции максимальной интенсивности.
   4. Приступить к анализу приобретенных изображений.
   5. Изучите трансгенных червей для нейродегенерации, забив следующие клеточные характеристики, (i) потеря флуоресценции от нейронов, выражающих GFP под промоутером DAT-1, (ii) нейронов, показывающих сома и / или аксональный blebbing, наросты или дендритные потери.
   6. Импортируйте и анализируем данные с помощью пакета программного обеспечения (например, Excel).

3. Процесс приобретения и анализ данных трансгенных нематод, выражающих пан-нейронально Поли-40, слитые с YFP

1. Используйте эпифлюоресценциальный микроскоп в сочетании с камерой (например, EVOS FL Auto 2).
2. Обнаружение и захват z-стек изображения головного области на 20x увеличение.
3. Сохранить и собрать изображения проекции максимальной интенсивности.
4. Приступить к анализу приобретенных изображений с помощью программного обеспечения Фиджи.
5. Открытые изображения с фиджийской программой¹⁴.
6. Выберите команду Сплит Каналс с помощью меню «Изображение и цвет» .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите изображение зеленого канала.
7. Используйте инструмент выбора от руки, чтобы вручную установить флуоресцентную область интереса (ROI; например, головка).
8. Добавьте соответствующую рентабельность инвестиций в roi Manager через меню Analyze and Tools.
9. Вычесть фон до 50%, выбрав процесс и вычесть фон.
10. Настройка и применение пороговых значений с помощью командного изображения меню Отрегулируйте Порог. Храните и установите одинаковые пороговые значения на протяжении всего анализа изображений всего эксперимента.
11. Выберите соответствующую рентабельность инвестиций от менеджера ROI.
12. Проанализируйте количество белковых агрегатов с помощью команды меню Анализ и анализ частиц.
13. Повторите шаги 3.5-3.12 для каждого приобретенного изображения.
14. Копирование значений дисплея из отдельного окна Результаты.
15. Вставьте/импортируйте и анализируйте результаты с помощью пакета программного обеспечения.

4. Отчетный статистический анализ

1. Используйте не менее 30 нематод для каждого экспериментального состояния. Выполните три биологических репликации.
2. Используйте программное обеспечение для статистического анализа либо для проведения студенческого т-теста(сравнение между двумя группами) или ANOVA (сравнение между несколькими группами) для статистического анализа с р-лт; 0,05 как значительный.

Результаты

Некротическая клеточная смерть, вызванная гиперактивными иононационными каналами
Используя представленные здесь процедуры, эмбрионы-мутанты мек-4 (u231) и deg-3u662) были либо инкубированы в течение 25 мин при температуре 34 градусов по Цельсию, либо хранились при стандарт...

Обсуждение

Здесь мы вводим и описываем широко доступные методологии роста, синхронизации и микроскопического исследования некоторых универсальных моделей C. elegans, исследующих возрастную нейродегенерацию. В частности, мы оцениваем и вскрываем клеточные и молекулярные основы возрастного нер...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)	Zeiss		Axio Vert A1
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
Epifluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific		EVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Tetramisole hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]			Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)