Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Özet

Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.

Özet

İnsan nörodejeneratif patolojileri ile mücadele ve yaygın sosyoekonomik etkileri yönetmek küresel bir öncelik haline gelmektedir. İnsan yaşam kalitesi ve sağlık sistemi üzerindeki zararlı etkilerine rağmen, insan nörodejeneratif bozuklukların çoğunluğu hala tedavi edilemez ve engellenemez kalır. Bu nedenle, bu tür hastalıklara karşı yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesi acil bir aciliyet haline gelmektedir. Nöronal devrelerin ve fonksiyonun yaşla ilişkili bozulması, düşük solucan Caenorhabditis elegans ve insanlar gibi çeşitli organizmalarda evrimsel olarak korunur ve altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmalarda benzerlikleri belirtir. C. elegans, yaşlanma sırasında nöronal aktivite ve kalite kontrolünü değerlendirmek için iyi karakterize bir sinir sistemi, vücut şeffaflığı ve genetik ve görüntüleme tekniklerinin çeşitli repertoire'sini sunan son derece biçimlendirilebilir bir genetik modeldir. Burada, hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz (örneğin, deg-3(d) ve mec-4(d)ve protein agregası (örn. α-syunclein ve poli-glutamat) kaynaklı nörotoksisite, yaşla ilgili nöronsal inancının hücresel ve moleküler alt çökmelerini izlemek ve incelemek gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz. Bu hayvan nörodejenerasyon modellerinin bir kombinasyonu, hücre ölümü modülatörleri için genetik ve farmakolojik ekranlar ile birlikte nöronal fonksiyonun yaşa bağlı arıza benzeri görülmemiş bir anlayış yol açacaktır ve insan sağlığı ve yaşam kalitesi için geniş alaka ile kritik anlayışlar sağlayacaktır.

Giriş

Son yirmi yılda, C. elegans yaygın nekrotik hücre ölümünün moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model organizma olarak kullanılmıştır. C. elegans son derece iyi karakterize ve eşlenmiş sinir sistemi, şeffaf vücut yapısı ve genetik ve görüntüleme yöntemleri nin çeşitli repertoire in vivo hücresel fonksiyon ve yaşlanma boyunca sağkalım izlemek için sunuyor. Böylece, nörodejenerasyon çeşitli C. elegans genetik modelleri zaten nöronal canlılık değerlendirmek için geliştirilmiştir. Özellikle, iyi tanımlanmış ve kullanılan nematod modelleri hiperaktif iyon kanal kaynaklı nekroz^{içerir 1,2,3} ve hücre ölümü artan protein toplama tarafından tetiklenen⁴,^{5,,6,,7,99,10} ve sıcak çarpması^11,12, diğerleri arasında.

Nematodlarda ve memeli nöronlarında sonraki bir ısı stresinin tetiklediği nekrotik hücre ölümüne karşı direnç kazandırAn alt öldürücü sıcaklıklara kısa süreli maruz kalma¹¹. İlginçtir ki, nematodların hafif yüksek sıcaklıkta günlük ön koşullandırması, iyonik dengesizlik (örn. mec-4(u231) ve/veya deg-3(u662)ve protein toplama (örn., α-synüklein ve poliQ40)^11,13gibi çeşitli uyaranların neden olduğu nörodejenerasyona karşı korur.

Burada, excitotoksisite tetikli hücre ölümü, Parkinson ve Huntington hastalığı gibi insan hastalıklarının köklü modellerinde yaşa bağlı nörodejenerasyonu izlemek ve değerlendirmek için C. elegans kullanarak çok yönlü metodolojileri tanımlıyoruz. Ayrıca, nörodejenerasyon çeşitli modellerde ısı önkoşullanma nöroprotektif rolü altını çizer. Bu tekniklerin genetik ve/veya farmakolojik ekranlarla bir leşi sonucu, yeni hücre ölümü modülatörlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu potansiyel terapötik ilgi ile sonuçlanacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hiperaktif iyon kanalları tarafından indüklenen nekrotik hücre ölümü

NOT: Mec-4 ve deg-3 dahil olmak üzere degenerinlerin gen ailesindeki fonksiyon kazanım mutasyonları, solucanlarda mekanosansasyon için gerekli olan altı dokunma reseptör nöronunne nekrotik hücre ölümünü tetikleyen hiperaktif iyon kanallarının oluşumuyla sonuçlanır³. Dejenerinlerin anormal uyarılması ile indüklenen nekroz, memelilerde eksitotoksisite ile çeşitli mekanistik ve morfolojik benzerlikler gösterir. Enerji metabolizması ve kalsiyum homeostaz bakımı nekroz sırasında nöronal sağkalım üzerinde önemli bir role sahiptir¹¹. Hiperaktif iyon kanalları, mec-4(u231)X ve deg-3(u662)Vtarafından tetiklenen nekrotik hücre ölümünü izlemek için aşağıdaki suşlar kullanılabilir.

1. Nekrotik hücre ölümünün incelenmesi için mutant solucanların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması
   1. 1. Gün: Nematode Growth Media (NGM) üzerine mec-4(u231) veya deg-3(u662) mutant nematodların L4 larvalarını seçin; Tablo 1) escherichia coli (OP50) ile bir diseksiyon stereomikroskop kullanılarak tohumlanmış plakalar.
   2. Tohumlu NGM plakabaşına 10 L4 nematod yerleştirin ve 20 °C'lik standart sıcaklıkta yetiştirin.
   3. 5. Gün: Plakaları 1 mL M9 tamponuyla yıkayın(Tablo 1) ve hayvanları 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.
   4. 30 s için 10.000 x g santrifüj ve supernatant kaldırın.
   5. 0,5 mL beyazlatma çözeltisi (7 mL H₂O, 1 mL 5 N NaOH ve 2 mL çamaşır suyu) ekleyin.
      NOT: Beyazlatma çözümü yavaş yavaş etkinliğini kaybeder; bu nedenle günlük olarak hazırlanmalıdır.
   6. Girdap ve solucanlar eriyene kadar periyodik olarak izleyin.
      NOT: Embriyoların canlılığı etkileneceği için 5 dakikadan uzun sürebeyaztlandırmadan kaçının.
   7. 30 s için 10.000 x g santrifüj ve supernatant kaldırın.
   8. 1 mL M9 tamponu ile iki kat pelet (yumurta) yıkayın.
   9. Yıkandıktan sonra, 200 μL M9 tampon yumurta yeniden askıya ve bir su banyosunda 34 °C'de 25 dakika kuluçka.
   10. 20 °C'de ayrı bir kontrol numunesi (yumurta) grubu koruyun.
   11. Pipet 100 μL kontrol veya ısı şoku ile işlenmiş yumurtave tohumsuz NGM plakaları üzerine yerleştirin. Her tabakta en az 100-200 yumurta var.
   12. Yumurtaları kuluçkaya yatana kadar 20 °C'de kuluçkaya yatırdı.
2. Diferansiyel girişim kontrastı kullanılarak muayene için L1 larvalarının montajı (DIC; Nomarsky) mikroskopi
   1. % 2 agarose pedleri hazırlayın.
   2. Plakaları yıkamak ve 1,5 mL tüplerde L1 larva nematodları toplamak için 1 mL M9 tampon kullanın.
   3. 30 s için 10.000 x g santrifüj.
   4. Supernatant çıkarın ve pelet (nematodlar) tutun.
   5. Nematodları anestezik için 100 mL 20 mM M9/levamisole tampon ekleyin.
      NOT: Anestezi olarak sodyum azitten kaçının. Sodyum azit mitokondriyal hasarı ve oksidatif stresi tetikler ve sonunda hücre ölümü indüksiyonuna yol açar
   6. L1 solucanları içeren M9/levamisole tampon pipet 10 μL ve % 2 agarose pedleri üzerine monte(Tablo 1).
   7. Numunenin üstüne bir kapak slipini yavaşça yerleştirin.
      NOT: Görüntüleme işlemi boyunca nemi korumak için kapağı oje ile kapatın.
   8. Diferansiyel girişim kontrastı kullanarak solucanları gözlemleyin (DIC; Nomarsky) mikroskopi.
   9. Nematod başına karakteristik vacuolated görünüm ile hücreleri sayarak altı dokunmatik reseptör nöronların puan nörodejenerasyon.

2. Protein agregakaynaklı nörodejenerasyon

NOT: Aşağıdaki suşlar protein agregalarına bağlı nörotoksisitenin araştırılmasında kullanılabilir: (A) dopaminerjik nöronlarda insan α-sinükleinaşırı ekspresyonu, UA44: Is[baIn1; p_dat-1α-syn, p_dat-1GFP] ve (B) insan poliglutamin proteinaşırı ekspresyonu (PolyQ) pan-nöronally, AM101: rmsIs110[p_rgef-1Q40::YFP]^6,10.

1. Nörodejenerasyon teşpini için transgenik nematodların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması
   1. C. elegans gelişimini ve büyümesini izlemek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.
   2. 1. Gün: Taze OP50 tohumlu NGM plakaları üzerinde her bir suş 15-20 L4 larvaları toplayıp aktararak transgenik nematod popülasyonunu senkronize edin.
      NOT: Her koşulda her bir zorlanmadan en az üç plaka kullanın.
   3. Kuluçka ve nematodlar 20 ° C standart sıcaklıkta büyümeye izin.
   4. 2. Gün: 34 °C'de ayarlanmış bir kuluçka makinesinde plakaları transfer ederek 30 dakika boyunca günlük ön koşullandırma gerçekleştirin. Daha sonra, önceden koşullandırılmış nematodları 20 °C'lik standart sıcaklıkta geri getirin.
      NOT: Farklı genetik arka planlar uzun süre maruz kalmak için yüksek sıcaklığa duyarlı olabilir.
   5. (A) Dopaminerjik nöronlarda insan α-sinüklein aşırı ekspresyonu araştırıyorsanız, UA44: Is[baIn1; p_dat-1α-syn, p_dat-1GFP]: Gün 9, dopaminerjik nöronal hücre ölümü için 7 günlük transgenik nematodları izlemek.
   6. (B) İnsan poliglutamin proteininin aşırı ekspresyonu araştırırsanız (PolyQ) pan-nöronally, AM101: rmsIs110[p_rgef-1Q40::YFP]: 5.
2. Mikroskobik inceleme için numunelerin montajı
   1. %2 agarose pedleri hazırlayın (Tablo 1).
   2. Agarose pedin ortasına 10 μL 20 mM M9/levamisole tampon damlası ekleyin.
   3. İlgili transgenik nematodları seçin ve m9/levamisole damlasına aktarın.
      NOT: Damla başına 20-30 nematod yerleştirin.
   4. Numunenin üstüne hafifçe bir kapak kaydırın.
      NOT: Görüntüleme işlemi boyunca nemi korumak için kapağı oje ile kapatın.
   5. İlgili numunelerin mikroskobik incelemesine devam edin.
3. Dopaminerjik nöronlarda α-sinüklein ve sitosolik GFP'yi birlikte ifade eden transgenik nematodların elde etme süreci ve veri analizi
   1. Bir kamera ile birlikte bir epifloresan mikroskobu kullanın (örneğin, EVOS FL Auto 2).
   2. 20x büyütmede kafa bölgesinin z-stack görüntülerini algılayıp yakalayın.
   3. Maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerini kaydedin ve toplayın.
   4. Edinilen görüntülerin analizine devam edin.
   5. Aşağıdaki hücresel özellikleri puanlama tarafından nörodejenerasyon için transgenik solucanlar inceleyin, (i) dat-1organizatörü altında GFP ifade nöronlardan floresan kaybı , (ii) soma ve / veya aksonal blebbing gösteren nöronlar, outgrowths veya dendritik kaybı.
   6. Bir yazılım paketi (örneğin, Excel) kullanarak verileri içe aktarın ve analiz edin.

3. YFP ile kaynaşmış pan-nöronal PolyQ40 ifade transgenik nematodların edinim süreci ve veri analizi

1. Bir kamera ile birlikte bir epifloresan mikroskobu kullanın (örneğin, EVOS FL Auto 2).
2. 20x büyütmede kafa bölgesinin z-stack görüntülerini algılayıp yakalayın.
3. Maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerini kaydedin ve toplayın.
4. Fiji yazılımını kullanarak elde edilen görüntülerin analizine devam edin.
5. Fiji programı¹⁴ile açık görüntüler .
6. Görüntü ve Renk açılır menüsünden Kanalları Böl komutunu seçin.
   NOT: Yeşil kanal görüntüsünü saklayın.
7. Floresan alanı el ile ayarlamak için serbest seçim aracını kullanın (RoI; örneğin, kafa).
8. Çözümle ve Araçlar açılır menüsü nden yatırım getirisi yöneticisine ilgili yg'yi ekleyin.
9. İşlem ve Arka Planı Çıkar'ı seçerek arka planı %50'ye çıkarın.
10. Menü komutu Resim üzerinden eşik değerlerini ayarlama ve uygulama | Ayarla | Eşik. Tüm denemenin görüntü analizi boyunca aynı eşik değerlerini tutun ve ayarlayın.
11. YG Yöneticisi'ndenilgili YG'yi seçin.
12. Menü komutunu kullanarak protein agregalarının sayısını analiz edin Analiz et ve Parçacıkları Analiz Et.
13. Edinilen her görüntü için 3,5-3,12 adımlarını yineleyin.
14. Ayrı Sonuçlar penceresinden ekran değerlerini kopyalayın.
15. Bir yazılım paketi kullanarak sonuçları yapıştırın/içe aktarın ve analiz edin.

4. Rapor istatistiksel analiz

1. Her deneysel durum için en az 30 nematod kullanın. Üç biyolojik kopya gerçekleştirin.
2. P < 0.05 ile istatistiksel analiz için öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden fazla grup arasında karşılaştırma) yapmak için istatistiksel analiz yazılımını kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Hiperaktif iyon kanalları tarafından indüklenen nekrotik hücre ölümü
Burada sunulan prosedürler kullanılarak mec-4(u231) ve deg-3u662 mutant embriyolar ya 34 °C'de 25 dakika kuluçkaya yatırıldı ya da 20 °C'de standart sıcaklıkta tutuldu. Kuluçka sırasında her iki grubun L1 larva evresinde nöronal hücre cesetlerinin sayısı belirlendi. Nekrotik hücre ölümü, ısı şoku ön koşullu yumurtalardan yumurtadan çıkan nematodlarda azalır (?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, yaşa bağlı nörodejenerasyonu araştıran çok yönlü C. elegans modellerinin büyüme, senkronizasyon ve mikroskobik incelemesi için yaygın olarak erişilebilir metodolojiler sokulmaktadır. Özellikle, biz değerlendirmek ve hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite^1,2,,3,,^4,5,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)	Zeiss		Axio Vert A1
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
Epifluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific		EVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Tetramisole hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]			Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)