Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Resumo

Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íon hiperativado e neurotoxicidade induzida por proteínas, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de doenças neurodegenerativas associadas à idade.

Resumo

Combater patologias neurodegenerativas humanas e gerenciar seu impacto socioeconômico generalizado está se tornando uma prioridade global. Apesar de seus efeitos prejudiciais sobre a qualidade de vida humana e o sistema de saúde, a maioria dos distúrbios neurodegenerativos humanos ainda permanece incurável e inde prevenivel. Portanto, o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas contra tais males está se tornando uma urgência premente. A deterioração dos circuitos e funções neuronais associadas à idade é evolutivamente conservada em organismos tão diversos quanto o humilde verme Caenorhabditis elegans e humanos, significando semelhanças nos mecanismos celulares e moleculares subjacentes. C. elegans é um modelo genético altamente maleável, que oferece um sistema nervoso bem caracterizado, transparência corporal e um repertório diversificado de técnicas genéticas e de imagem para avaliar a atividade neuronal e o controle de qualidade durante o envelhecimento. Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íons hiperativado (por exemplo, deg-3(d) e mec-4(d)) e agregado de proteínas (por exemplo, neurotoxina α-syuncleina e poli-glutamato)-induzidas por neurotoxicidade, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de quebra neuronal relacionada à idade. Uma combinação desses modelos de neurodegeneração animal, juntamente com telas genéticas e farmacológicas para moduladores de morte celular, levará a uma compreensão sem precedentes da discriminação relacionada à idade da função neuronal e fornecerá insights críticos com ampla relevância para a saúde humana e qualidade de vida.

Introdução

Nas últimas duas décadas, C. elegans tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo para investigar os mecanismos moleculares da morte celular necrótica. C. elegans oferece um sistema nervoso excepcionalmente bem caracterizado e mapeado, estrutura corporal transparente e um repertório diversificado de métodos genéticos e de imagem para monitorar a função celular in vivo e a sobrevivência ao longo do envelhecimento. Assim, vários modelos genéticos C. elegans de neurodegeneração já foram desenvolvidos para avaliar a viabilidade neuronal. Em particular, os modelos de nematoides bem descritos e utilizados incluem a necrose hiperativa induzida pelo canal^{de íons 1,,2,3} e morte celular desencadeada pelo aumento da agregação proteica^{4,,5,,6,,7,,8,,9,,10} e insolação^11,,12,entre outros.

A exposição a curto prazo a temperaturas sub-letais conferiu resistência à morte celular necrosada, desencadeada por um estresse térmico subsequente tanto em nematoides quanto em neurônios mamíferos¹¹. Curiosamente, o pré-condicionamento diário de nematoides a uma temperatura elevada leve protege contra a neurodegeneração, que é infligida por diversos estímulos, como desequilíbrio iônico (por exemplo, mec-4(u231) e/ou deg-3(u662)) e agregação de proteínas (por exemplo, α-sinucleína e polyQ40)^11,13.

Aqui, descrevemos metodologias versáteis usando C. elegans para monitorar e avaliar a neurodegeneração dependente da idade em modelos bem estabelecidos de doenças humanas, como morte celular desencadeada por excitotoxicidade, Parkinson e doença de Huntington. Além disso, sublinhamos o papel neuroprotetor do pré-condicionamento térmico em vários modelos de neurodegeneração. Uma combinação dessas técnicas em conjunto com telas genéticas e/ou farmacológicas resultará na identificação e caracterização de novos moduladores de morte celular, com potencial interesse terapêutico.

Protocolo

1. Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos

NOTA: Mutações de ganho de função na família genética de degenerinas, incluindo mec-4 e deg-3, entre outras, resultam na geração de canais de íons hiperativos desencadeando a morte celular necrosada de seis neurônios receptores de toque necessários para mecanosensação em vermes³. A necrose induzida pela estimulação aberrante das degenerinas apresenta várias semelhanças mecanicistas e morfológicas à excitotoxicidade em mamíferos. A manutenção do metabolismo energético e da homeostase de cálcio tem um papel crucial na sobrevivência neuronal durante a necrose¹¹. As seguintes cepas podem ser usadas para monitorar a morte celular necrótica desencadeada por canais de íons hiperativos, mec-4(u231)X e deg-3(u662)V.

1. Manutenção, sincronização e preparação de vermes mutantes para exame da morte celular necrosada
   1. Dia 1: Escolha larvas L4 de nematoides mutantes do MEC-4(u231) ou deg-3(u662) em Nematode Growth Media (NGM; Tabela 1) placas semeadas com Escherichia coli (OP50) usando um estereótipo dissecando.
   2. Coloque 10 nematoides L4 por placa NGM semeada e cresça-os na temperatura padrão de 20 °C.
   3. Dia 5: Lave as placas com 1 mL de tampão M9(Tabela 1) e colete os animais em um tubo de 1,5 mL.
   4. Centrifugar a 10.000 x g por 30 s e remover o supernaspeso.
   5. Adicione 0,5 mL de solução de branqueamento (7 mL de H₂O, 1 mL de 5 N NaOH e 2 mL de alvejante).
      NOTA: A solução de branqueamento gradualmente perde sua eficiência; portanto, deve ser preparado diariamente.
   6. Vórtice e monitore periodicamente até que os vermes se dissolvam.
      NOTA: Evite branqueamento por períodos superiores a 5 minutos porque a viabilidade dos embriões será afetada.
   7. Centrifugar a 10.000 x g por 30 s e remover o supernaspeso.
   8. Lave duas vezes a pelota (ovos) com 1 mL de tampão M9.
   9. Após a lavagem, resuspenha os ovos em 200 μL de tampão M9 e incuba-os por 25 min a 34 °C em um banho de água.
   10. Mantenha um grupo separado de amostra de controle (ovos) a 20 °C.
   11. Pipeta 100 μL de controle ou calor de ovos tratados com choque e colocá-los em placas de NGM não semeadas. Cada prato contém pelo menos 100-200 ovos.
   12. Incubado os ovos a 20 °C até chocar.
2. Montagem de larvas L1 para exame utilizando contraste de interferência diferencial (DIC; Microscopia nomarsky
   1. Prepare 2% de almofadas de agarose.
   2. Use 1 mL de tampão M9 para lavar as placas e coletar nematoides de larvas L1 em tubos de 1,5 mL.
   3. Centrifugar a 10.000 x g por 30 s.
   4. Remova o supernatante e mantenha a pelota (nematoides).
   5. Adicione 100 μL de 20 mM M9/tampão de levamisole para anestesiar os nematoides.
      NOTA: Evite o azida de sódio como anestésico. Azida de sódio desencadeia danos mitocondriais e estresse oxidativo levando eventualmente à indução de morte celular
   6. Pipeta 10 μL de tampão M9/levamisole contendo vermes L1 e montá-los em almofadas de 2% de agarose(Tabela 1).
   7. Coloque suavemente uma mancha de cobertura na parte superior da amostra.
      NOTA: Sele a mancha com esmalte para preservar a umidade durante todo o processo de imagem.
   8. Observe worms usando contraste de interferência diferencial (DIC; Microscopia nomarsky.
   9. Escore a neurodegeneração dos seis neurônios receptores de toque contando células com a aparência vacuolada característica por nematoide.

2. Neurodegeneração induzida por proteínas

NOTA: As seguintes cepas podem ser usadas para investigar neurotoxicidade induzida por agregados proteicos: (A) superexpressão da α-sinucleína humana em neurônios dopaminérgicos, UA44: É[baIn1; p_dat-1α-syn, p_dat-1GFP] e (B) superexpressão da proteína de poliglutamina humana (PolyQ) pan-neuronalmente, AM101: rmsIs110[p_rgef-1Q40:::YFP]^6,10.

1. Manutenção, sincronização e preparação de nematoides transgênicos para ensaio de neurodegeneração
   1. Use um estereómico dissecando para monitorar o desenvolvimento e o crescimento de C. elegans.
   2. Dia 1: Sincronizar a população de nematoides transgênicos colhendo e transferindo 15-20 larvas L4 de cada cepa em placas de GNM recém-criadas OP50.
      NOTA: Utilize pelo menos três placas de cada cepa por condição.
   3. Incubar e deixar os nematoides crescerem à temperatura padrão de 20 °C.
   4. Dia 2: Realize o pré-condicionamento diário por 30 minutos transferindo as placas em uma incubadora fixada a 34 °C. Em seguida, retorne os nematoides pré-condicionados de volta à temperatura padrão de 20 °C.
      NOTA: Diferentes origens genéticas podem ser sensíveis à alta temperatura por longos períodos de exposição.
   5. (A) Se investigar a superexpressão da α-sinucleína humana em neurônios dopaminérgicos, UA44: É[baIn1; p_dat-1α-syn, p_dat-1GFP]: no dia 9, monitore nematoides transgênicos de 7 dias de idade para morte celular neuronal dopaminérgica.
   6. (B) Se investigar a superexpressão da proteína de poliglutamina humana (PolyQ) pan-neuronalmente, AM101: rmsIs110[p_rgef-1Q40::YFP]: no dia 5, meça agregados neuronais de PolyQ na região da cabeça de animais transgênicos de 4 dias de idade expressando Q40::YFP.
2. Montagem das amostras para exame microscópico
   1. Prepare 2% de almofadas de agarose(Tabela 1).
   2. Adicione 10 μL de 20 mM M9/leveisole buffer drop no centro da almofada agarose.
   3. Escolha os respectivos nematoides transgênicos e transfira-os em uma gota M9/levamisole.
      NOTA: Coloque 20-30 nematoides por gota.
   4. Coloque suavemente uma mancha de cobertura na parte superior da amostra.
      NOTA: Sele a mancha com esmalte para preservar a umidade durante todo o processo de imagem.
   5. Proceder ao exame microscópico das respectivas amostras.
3. Processo de aquisição e análise de dados de nematoides transgênicos co-expressando α-sinucleína e GFP citosósica em neurônios dopaminérgicos
   1. Use um microscópio de epifluorescência combinado com uma câmera (por exemplo, EVOS FL Auto 2).
   2. Detecte e capture imagens de pilha de z da região da cabeça a 20x de ampliação.
   3. Salve e colete as imagens de projeção de intensidade máxima.
   4. Prossiga para a análise das imagens adquiridas.
   5. Examine os vermes transgênicos para neurodegeneração, pontuando as seguintes características celulares, (i) perda de fluorescência de neurônios expressando GFP sob o promotor de dat-1, (ii) neurônios mostrando soma e/ou blebbing axonal, outgrowths ou perda dendrítica.
   6. Importe e analise os dados usando um pacote de software (por exemplo, Excel).

3. Processo de aquisição e análise de dados de nematoides transgênicos expressando politagem pan-neuronalmente 40 fundido com YFP

1. Use um microscópio de epifluorescência combinado com uma câmera (por exemplo, EVOS FL Auto 2).
2. Detecte e capture imagens de pilha de z da região da cabeça a 20x de ampliação.
3. Salve e colete as imagens de projeção de intensidade máxima.
4. Prossiga para a análise das imagens adquiridas usando o software Fiji.
5. Abra imagens com o programa Fiji¹⁴.
6. Selecione o comando Canais divididos através do menu suspenso imagem e cor.
   NOTA: Mantenha a imagem do canal verde.
7. Use a ferramenta de seleção à mão livre para definir manualmente a região fluorescente de interesse (ROI; por exemplo, cabeça).
8. Adicione o respectivo ROI no ROI Manager via Menu suspenso Analyze and Tools.
9. Subtraia o plano de fundo para 50% selecionando o plano de fundo do processo e subtraído.
10. Configurar e aplicar valores de limiar através do comando do menu Imagem | Ajuste | Limiar. Mantenha e defina os mesmos valores de limiar durante toda a análise de imagem de todo o experimento.
11. Selecione o respectivo ROI do ROI Manager.
12. Analise o número de agregados proteicos usando o comando do menu Analisar e Analisar partículas.
13. Repita as etapas 3.5-3.12 para cada imagem adquirida.
14. Copie os valores do display da janela Resultados separados.
15. Cole/Importe e analise os resultados usando um pacote de software.

4. Relatório de análise estatística

1. Use pelo menos 30 nematoides para cada condição experimental. Realize três réplicas biológicas.
2. Utilize software de análise estatística para realizar teste t-estudante(comparação entre dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para análise estatística com p < 0,05 como significativo.

Resultados

Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos
Utilizando os procedimentos aqui apresentados, os embriões mutantes mec-4(u231) e deg-3u662 foram incubados por 25 min a 34 °C ou mantidos na temperatura padrão de 20 °C. Ao eclodir, o número de corpos de células neuronais foi determinado no estágio larval L1 de ambos os grupos. A morte celular necrótica é diminuída em nematoides que eclodiram de ovos pré-condicionados de choque térmico(Figura...

Discussão

Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis para crescimento, sincronização e exame microscópico de alguns modelos versáteis de C. elegans que investigam a neurodegeneração dependente da idade. Particularmente, avaliamos e dissecamos os fundamentos celulares e moleculares da quebra neuronal relacionada à idade, utilizando necrose hiperativada induzida pelo canal de íons e neurotoxicidade induzida por^{proteínas 1,,2,<...}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)	Zeiss		Axio Vert A1
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
Epifluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific		EVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Tetramisole hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]			Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)