דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

Summary

כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות ניצול כמה דגמים נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק וחלבון הנגרמת המושרה נוירורעילות, כדי לפקח ולנתח את בסיס הסלולר והמולקולריים של מחלות ניווניות הקשורים גיל.

Abstract

התמודדות עם הפתודים ניווניות האנושית וניהול ההשפעה הבין-כלכלי הנרחבת שלהם הוא הופך עדיפות גלובלית. על אף ההשפעות ההרסניות שלהם על איכות החיים האנושית ועל מערכת הבריאות, רוב ההפרעות האנושיות הנוירוניווניות עדיין להישאר חשוכת מרפא ולא ניתנת למניעה. לכן, ההתפתחות של התערבויות טיפוליות הרומן נגד מומים כאלה הופכת דחיפות דחופה. ההתדרדרות המשויכת לגיל של מעגלים עצביים ותפקוד הוא שימור בלתי מזוהה באורגניזמים כמגוון התולעים הנחות של האלמרנים ובני האדם, המציין קווי דמיון במנגנון הסלולר והמולקולרי הבסיסי. ג. אלגיה הוא מודל גנטי מחושל מאוד, המציעה מערכת עצבים מאופיינת היטב, שקיפות גוף ורפרטואר מגוון של טכניקות גנטיות ודימות להערכת פעילות עצבית ובקרת איכות במהלך ההזדקנות. כאן, אנו להציג ולתאר מתודולוגיות ניצול כמה דגמי נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק (g., מעלות -3 (ד) ו -mec-4 (d)) ולצבור חלבון (g., α-syunclein ו-פולי גלוטמט)-רעילות המושרה, כדי לפקח ולנתח את התחתון הסלולר והמולקולריים של התמוטטות עצבים הקשורים לגיל. שילוב של אלה מודלים נוירוניוון בעלי חיים, יחד עם מסכים גנטיים ותרופתי למוות תאים מאפטורים יוביל להבנה חסרת תקדים של פירוק הקשורות לגיל של תפקוד עצבי ויספק תובנות קריטיות עם רלוונטיות רחבה לבריאות האדם ואיכות החיים.

Introduction

במהלך שני העשורים האחרונים שימש כאורגניזם מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של מוות תאי נקרוטי. ג. אלגיה מציעה מערכת עצבים מאופיינת וממופה במיוחד, מבנה גוף שקוף ורפרטואר מגוון של שיטות גנטיות ודימות לניטור הפונקציה vivo סלולרית והישרדות במהלך ההזדקנות. לפיכך, מספר מודלים גנטיים של ניוון עצבי כבר פותחו כדי להעריך את הכדאיות העצבית. בפרט, מתוארים היטב ומשומשים מודלים נמטודות כוללים נמק המושרה ערוץ יון^1,2,3 ומוות תא המופעל על ידי צבירת חלבון מוגבר^{4,5,6,7,8,9,10} וחום שבץ^11,12, בין היתר.

חשיפה לטווח קצר לטמפרטורות תת-קטלניות הענקת עמידות נגד מוות בתאי נמק, המופעל על ידי מתח החום הבאים הן בתוך נמטודות ונוירונים מיונקים¹¹. מעניין, מיזוג יומי של נמטודות בטמפרטורה מוגבה מתון מגן מפני נוירוניוון, אשר נגרם על ידי גירויים שונים, כגון חוסר איזון יונית (g., mec-4 (u231) ו/או מעלות -3 (u662)) וצבירת חלבונים (לדוגמה, α-synuclein ו-polyQ40)^11,13.

כאן, אנו מתארים מתודולוגיות רב-תכליתיות באמצעות C. אלגיה כדי לפקח ולהעריך ניוון הגילאים תלויי מודלים של מחלות האדם, כגון הרגש מוות מעורר התאים, פרקינסון ומחלת הנטינגטון. יתר על כן, אנחנו להדגיש את התפקיד הנוירולוגי של מיזוג חום במודלים שונים של ניוון. שילוב של טכניקות אלה יחד עם מסכים גנטיים ו/או תרופתי יגרום לזיהוי ואפיון של מודטורים מוות תאים הרומן, עם ריבית טיפולית פוטנציאלית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. מוות של תאים נקרוסטיים הנגרמת על ידי ערוצי יון היפראקטיבי

הערה: מוטציות הרווח של הפונקציה במשפחת הגנים של degenerins, כולל mec-4 ו-מעלות 3 בין היתר, תוצאות הדור של ערוצי יון היפראקטיבי המפעיל מוות של תאים נקרוטיים של שישה הנוירונים לקולטן מגע הנדרש עבור מכונאי תולעים³. נמק שנגרם על ידי הגירוי החריג של הדגנרנס מציג מספר דומה של מכניסטים ומורפולוגיים לעירור ההתרגשות ביונקים. תחזוקת מטבוליזם האנרגיה והומאוסטזיס סידן יש תפקיד מכריע על הישרדות עצבית במהלך נמק¹¹. הזנים הבאים ניתן להשתמש כדי לפקח על מוות תאים נקרוטיק המופעל על ידי ערוצי יון היפראקטיבי, mec-4 (u231) X ו-מעלות -3 (u662) V.

1. אחזקה, סנכרון והכנת תולעי מוטציה לבדיקת מוות תאי נקרוטי
   1. יום 1: לקטוף L4 הזחלים של mec-4 (u231) או מעלות 3 (u662) מוטציה נמטודות על מדיה צמיחה נמטודות (ngm; שולחן 1) צלחות שנזרע עם es, האנכיה coli (OP50) באמצעות ניתוח stereomicroscope.
   2. מקום 10 L4 נמטודות לכל צלחת ngm שנזרע ולגדול אותם בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c.
   3. יום 5: לשטוף את הצלחות עם 1 מ ל של M9 מאגר (שולחן 1) ולאסוף את החיות בצינור 1.5 mL.
   4. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s ולהסיר את supernatant.
   5. הוספת 0.5 mL של תמיסת הלבנה (7 מ ל של H₂O, 1 מ ל 5 N naoh ו 2 מ"ל של אקונומיקה).
      הערה: הלבנת התמיסה מאבדת בהדרגה את יעילותה; ולכן יש להכין אותו מדי יום.
   6. מערבולת ומוניטור מדי פעם עד התולעים התפרקה.
      הערה: הימנע מהלבנה לתקופות ארוכות מ-5 דקות, מכיוון שיכולת הקיום של העוברים תושפע.
   7. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s ולהסיר את supernatant.
   8. כביסה פעמיים את הגלולה (ביצים) עם 1 mL של M9 מאגר.
   9. לאחר כביסה, להשעות מחדש את הביצים ב-200 μL של מאגר M9 ו מודלים אותם 25 דקות ב 34 ° c באמבט מים.
   10. שמרו על קבוצה נפרדת של מדגם ביצים ברזולוציה של 20 ° c.
   11. פיפטה 100 μL של שליטה או חום ביצים שטופלו ומניחים אותם על לוחות NGM לא הנזרע. כל צלחת מכילה לפחות 100-200 ביצים.
   12. מודפה את הביצים ב -20 ° צלזיוס עד לבקיעה.
2. הרכבה L1 הזחלים לבדיקה באמצעות ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC; נוארמסקי) מיקרוסקופ
   1. הכינו 2% משטחי הצמח.
   2. השתמש 1 mL של M9 מאגר לשטוף את הצלחות ולאסוף הזחלים L1 נמטודות בצינורות 1.5 mL.
   3. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s.
   4. הסר את הסופרנטאנט ושמור את הגלולה (nematodes).
   5. הוסף 100 μL של 20 מ"מ M9/levamisole מאגר כדי לממש את הנמטודות.
      הערה: הימנע נתרן אזיד כהרדמה. נתרן עזידה מפעילה נזק מיטוכונדריאלי ומתח חמצוני מוביל בסופו של דבר למוות תאים אינדוקציה
   6. פיפטה 10 μL של מאגר M9/levamisole המכיל תולעים L1 ולטעון אותם על 2% השני רפידות (טבלה 1).
   7. הנח בעדינות את הכיסויים בחלק העליון של המדגם.
      הערה: אטום את הכיסויים בלק הציפורניים כדי לשמר לחות לאורך כל תהליך ההדמיה.
   8. שימו לב לתולעים באמצעות ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC; Nomarsky) מיקרוסקופ.
   9. ניקוד נוירוניוון של שישה הנוירונים לקולטן מגע על ידי ספירת תאים עם המראה האופייני לחללים האופייניים לכל nematode.

2. חלבון מושרה ניוון מצטבר

הערה: הזנים הבאים ניתן להשתמש כדי לחקור את אגרגטים החלבון המושרה-רעילות נוירוגרם: (א) ביטוי יתר של האדם α-synuclein בנוירונים, UA44: Is[baIn1; p_dat-1α-syn, p_dat-1gfp] ו (ב) הבעות יתר של חלבון polyglutamine האנושי (polyglutamine) פאן-neuronally, AM101: rmsIs110[p_rgef-1Q40:: yfp]^6,10.

1. אחזקה, סנכרון והכנת מחלות טרנסגניים לצורך שיטת ניוון נוירותית
   1. השתמש בניתוח stereomicroscope כדי לפקח על פיתוח וצמיחה של ג. אלגיה .
   2. יום 1: לסנכרן את האוכלוסייה של נמטודות טרנסגניים על ידי איסוף והעברה של 15-20 L4 הזחלים של כל זן על לוחיות טריות OP50-הזריעה.
      הערה: השתמש בשלוש צלחות לפחות בכל אחד מהזנים בכל תנאי.
   3. דגירה ומאפשרים נמטודות לגדול בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c.
   4. יום 2: לבצע התניה יומית במשך 30 דקות על ידי העברת הצלחות בחממה שנקבעה ב-34 ° c. לאחר מכן, החזר את הנמטודות הממוזגים לאחור בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c.
      הערה: רקע גנטי שונה עשוי להיות רגיש לטמפרטורה גבוהה לחשיפה לפרקי זמן ארוכים.
   5. (א) בחקירת ביטוי יתר של α האדם-synuclein בנוירונים הדוגיים, UA44: הוא[baIn1; p_dat-1α-syn, p_dat-1gfp]: ביום 9, צג 7 ימים-העברה הטרנסגניים הישן עבור מוות התאים הנוירוניגיים.
   6. (ב) בחקירת הבעות יתר של חלבון polyglutamine האנושי (polyglutamine) פאן-NEURONALLY, AM101: rmsIs110[p_rgef-1Q40:: yfp]: ביום 5, למדוד אגרגטים עצביים polyglutamine באזור הראש של בעלי 4 ימים בעלי חיים טרנסגניים ביטוי Q40:: yfp.
2. הרכבה של דגימות לבדיקה מיקרוסקופית
   1. הכינו 2% משטחי הצמח (שולחן 1).
   2. הוסף 10 μL של 20 מ"מ M9/מאגר levamisole ירידה במרכז של כרית agarose.
   3. בחר את נמטודות בהתאמה ולהעביר אותם בירידה M9/levamisole.
      הערה: מ20-30 מקום לירידה.
   4. מניחים בעדינות שמיכות בחלק העליון של המדגם.
      הערה: אטום את הכיסויים בלק הציפורניים כדי לשמר לחות לאורך כל תהליך ההדמיה.
   5. המשך לבדיקה מיקרוסקופית של הדגימות המתאימות.
3. תהליך הרכישה וניתוח נתונים של מעבר שיתוף והבעת הביטוי α-synuclein ו ציטוטרוג GFP בנוירונים הדוגיים
   1. השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית בשילוב עם מצלמה (למשל, EVOS FL אוטומטי 2).
   2. לזהות וללכוד תמונות של מחסנית z של אזור הראש בהגדלה של 20x.
   3. שמור ואסוף את התמונות של הקרנת העוצמה המירבית.
   4. המשך לניתוח התמונות שנרכשו.
   5. בדוק את התולעים הטרנסגניים עבור ניוון נוירוגני על ידי הבקיע את המאפיינים הסלולריים הבאים, (i) אובדן של זריחה מן הנוירונים ביטוי GFP תחת היזם של dat-1, (ii) נוירונים מראה סומה ו/או האקסון, outgrowths או אובדן הדנדריטים.
   6. יבא ונתח את הנתונים באמצעות חבילת תוכנה (לדוגמה, Excel).

3. תהליך הרכישה וניתוח נתונים של נמטודות מבטאים את פאן-neuronally PolyQ40 התמזגו עם yfp

1. השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית בשילוב עם מצלמה (למשל, EVOS FL אוטומטי 2).
2. לזהות וללכוד תמונות של מחסנית z של אזור הראש בהגדלה של 20x.
3. שמור ואסוף את התמונות של הקרנת העוצמה המירבית.
4. המשך לניתוח התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת פיג'י.
5. פתח תמונות עם תוכנית פיג'י¹⁴.
6. בחרו בפקודה ' פצל ערוצים ' באמצעות התפריט הנפתח ' תמונה ' ו'צבע '.
   הערה: שמור את תמונת הערוץ הירוק.
7. השתמש בכלי בחירה ביד חופשית כדי להגדיר באופן ידני את אזור הפלורסנט של הריבית (ROI; לדוגמה, ראש).
8. הוסף את התשואה המתאימה ב- Roi Manager באמצעות לנתח וכלים התפריט הנפתח.
9. הפחת את הרקע ל-50% על-ידי בחירה בתהליך וחיסור רקע.
10. הגדר והחל ערכי סף באמצעות תמונת פקודת התפריט | כוונן | הסף. שמור וקבע את אותם ערכי הסף במהלך ניתוח התמונה של הניסוי כולו.
11. בחר את ההחזר המתאים ממנהל הroi.
12. לנתח את מספר אגרגטים החלבון באמצעות פקודת התפריט לנתח ולנתח חלקיקים.
13. חזור על שלבים 3.5-3.12 עבור כל תמונה שנרכשה.
14. העתק את ערכי התצוגה מחלון התוצאות הנפרד.
15. הדבק/יבא ונתח את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה.

4. דו ח ניתוח סטטיסטי

1. השתמש לפחות 30 נמטודות עבור כל מצב ניסיוני. בצע שלוש משכפל ביולוגי.
2. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי לביצוע מבחן t (השוואה בין שתי קבוצות) או ב -ANOVA (השוואה בין קבוצות מרובות) לניתוח סטטיסטי עם p < 0.05 כמשמעותי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מוות בתאי נמק שנגרם על ידי תעלות היפראקטיביות
באמצעות ההליכים המוצגים כאן, mec-4 (u231) ו-מעלות 3u662) עוברי מוטציה היו מודבטים עבור 25 דקות ב 34 ° צ' או שמרו בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 ° c. במהלך הבקיעה נקבע מספר גופות התאים העצביים בL1 הזחל של שתי הקבוצות. נמק מוות התאים הוא פחתה בתו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות עבור צמיחה, סנכרון ובדיקה מיקרוסקופית של כמה מודלים רב-תכליתי מסוג C. אלגיה חקירת ניוון מוחי התלוי בגיל. במיוחד, אנו להעריך ולנתח את התחתון הסלולר והמולקולריים של התמוטטות עצבים הקשורים לגיל באמצעות היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק המושרה חלב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
deg-3(u662)V or deg-3(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
DIC microscope (Nomarsky)	Zeiss		Axio Vert A1
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
Epifluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific		EVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
mec-4(u231)X or mec-4(d)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Maintain animals at 20 °C
Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	01 010 30
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Tetramisole hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]			Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)