JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من البروتوكول هو مقارنة ظروف طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) المختلفة لتقييم كيفية تأثير الطلاء التفاضلي على معدل نمو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). على وجه الخصوص ، نهدف إلى تهيئة الظروف للحصول على النمو الأمثل لثقافات iPSC.

Abstract

تركز هذه الدراسة على فهم كيف يمكن أن تؤثر زراعة iPSCs على ركائز طلاء ECM المختلفة على التقاء الخلايا. تم إنشاء بروتوكول لتقييم التقاء iPSC في الوقت الفعلي دون الحاجة إلى عد الخلايا في تعليق خلية واحدة لتجنب أي اضطراب في النمو. تم استخدام نظام تحليل الصور عالي المحتوى لتقييم التقاء iPCS على 4 ECMs مختلفة بمرور الوقت بطريقة آلية. تم استخدام إعدادات تحليل مختلفة لتقييم التقاء الخلايا من iPSCs الملتصقة ولم يلاحظ سوى اختلاف طفيف (في 24 و 48 ساعة مع laminin) سواء تم تطبيق قناع 60 أو 80 أو 100٪. نظهر أيضا أن laminin يؤدي إلى أفضل التقاء مقارنة ب Matrigel و vitronectin و fibronectin.

Introduction

يتم الحصول على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من الخلايا الجسدية ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا. غالبا ما يتم استخدامها كنظام لنمذجة التسبب في المرض أو إجراء فحص المخدرات ، كما أنها توفر إمكانية استخدامها في سياق الطب الشخصي. نظرا لأن iPSCs لديها إمكانات كبيرة ، فمن المهم توصيفها بالكامل لاستخدامها كنظام نموذجي موثوق. لقد أظهرنا سابقا أهمية زراعة iPSCs في بيئة نقص الأكسجين حيث تعتمد هذه الخلايا على تحلل السكر ويمكن أن تتسبب البيئة الهوائية في اختلال الأكسدةوالاختزال 1. كما أن iPSCs معرضة أيضا لظروف الاستزراع الأخرى ، لا سيما البيئة خارج الخلية. يعد تحسين ظروف الاستزراع قضية رئيسية للحفاظ على صحتهم وتكاثرهم. ستؤدي ثقافة iPSC الصحية إلى خلايا متمايزة صحية تكون عموما نقطة النهاية للنموذج المستخدم لفهم السمات الجزيئية والخلوية والوظيفية لاضطرابات بشرية أو عمليات خلوية محددة.

في هذه الدراسة ، تم استخدام بروتوكول بسيط لاختبار التقاء iPSCs باستخدام ظروف طلاء مختلفة في آبار منفصلة. تتطلب iPSCs طبقة مغذية من الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEF) من أجل الالتصاق بشكل صحيح ، لكن التعايش بين iPSCs و MEF يجعل من الصعب إجراء تحليل مثل الحمض النووي الريبي أو استخراج البروتين نظرا لوجود مجموعتين من الخلايا. من أجل تجنب طبقة التغذية ، تم استخدام بروتينات مختلفة تنتمي إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) لإعادة إنشاء مكانة الخلية الطبيعية والحصول على ثقافة iPSC خالية من التغذية. على وجه الخصوص ، Matrigel عبارة عن مستحضر غشاء قاعدي قابل للذوبان مستخرج من ساركوما الماوس Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ، والتي يتم تخصيبها في بروتينات مصفوفة خارج الخلية (أي laminin ، الكولاجين IV ، بروتيوغليكان كبريتات الهيباران ، entactin / nidogen ، وعوامل النمو)2,3. شروط الطلاء الأخرى المستخدمة هي بدلا من ذلك البروتينات المنقاة ذات الصلة المعروفة في بناء ECMs: من المعروف أن laminin-521 تفرزه الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في كتلة الخلايا الداخلية للجنين وهي واحدة من أكثر اللامينين شيوعا في الجسم بعد الولادة4،5،6،7،8،9 ، 10,11; vitronectin عبارة عن مصفوفة زراعة خلايا خالية من xeno معروفة بدعم نمو وتمايز hPSC12،13،14،15،16 ؛ الفبرونيكتين هو بروتين ECM مهم لتطور الفقاريات وربط وصيانة الخلايا الجذعية الجنينية في حالة متعددة القدرات17،18،19،20،21،22،23،24،25. نظرا لتوفر ظروف طلاء مختلفة ، فإننا نقارنها من حيث تأثيرها على التقاء iPSCs.

Protocol

1. طلاء 96 لوحة بئر

ملاحظة: تم اختبار طلاءات مختلفة في نفس اللوحة ولكن في آبار منفصلة (انظر الملف التكميلي).

  1. تمييع Matrigel 1: 100 في DMEM. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر إلى 96 لوحة بئر واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول وغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من DMEM مرتين.
  2. تمييع laminin (20 ميكروغرام / مل ، LN-521) في PBS (مع الكالسيوم والمغنيسيوم). أضف 100 ميكرولتر إلى البئر واحتضنها عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإجراء غسلتين باستخدام DMEM قبل بذر الخلايا.
  3. تمييع فيترونيكتين (10 ميكروغرام / مل) في عازلة التخفيف. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر إلى لوحة البئر 96 واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الآبار باستخدام PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) قبل طلاء الخلايا.
  4. تمييع HU-Fibronectin (30 ميكروغرام / مل) في ddH2O. أضف 100 ميكرولتر إلى الآبار واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الآبار بالوسط قبل بذر الخلايا.

2. صيانة iPSCs في الثقافة

ملاحظة: تم شراء iPSCs تجاريا. تم اشتقاق iPSCs من الخلايا الليفية البشرية السليمة وإعادة برمجتها باستخدام تقنية episomal.

  1. من الفريزر -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل ، قم بإذابة iPSCs المحفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية. نظف القارورة التي تحتوي على الخلايا بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل نقلها إلى خزانة السلامة البيولوجية.
  2. أضف معلق الخلية إلى 5 مل من وسائط زراعة الخلايا الدافئة مسبقا (على سبيل المثال ، mTeSR1) قطرة قطرة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل.
  3. الطرد المركزي للخلايا في 304 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. قم بإزالة الوسائط وأعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من وسط زراعة الخلية.
  5. قم بصفيحة معلق الخلية في بئرين من 6 ألواح بئر (105 iPSCs لكل طبق زراعة خلوي مكون من 6 آبار) ، حيث تم طلاء الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) سابقا. بذور MEFs قبل يومين من طلاء iPSCs بكثافة 2.4 × 104 / سم2 في DMEM (تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ L- جلوتامين و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين).
  6. بعد البذر ، استكمل وسائط الخلية ب 10 ميكرومتر من مثبط ROCK Y-27632.
  7. قم بتنمية iPSCs على MEFs لأول 4-5 أسابيع ثم في حالة خالية من التغذية (حالة خالية من MEF) ، باستخدام أحد الطلاء محل الاهتمام (انظر الخطوة 1 والجدول 1) في mTeSR1.
  8. عندما تكون iPSCs متقاربة بنسبة 70-80٪ ، قم بمرور 1: 4 باستخدام معالجة EDTA 0.5 mM لمدة 3-5 دقائق في RT. أضف 1 مل من 0.5 mM EDTA للوحة 6 آبار (أو كميات متناسبة لأنواع أخرى من الألواح). انقله إلى آبار جديدة في ظروف خالية من التغذية واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 20٪ O2.
  9. قم بتغيير الوسائط باستخدام mTeSR1 الجديد كل يوم وقم بتقسيم الخلايا كل يومين.

3. توصيف التقاء الخلايا

  1. استخدم 96 لوحة بئر للتجارب.
  2. قم بزرع 10000 خلية لكل بئر بعد شهر واحد على الأقل من الزراعة في حالة خالية من التغذية للتأكد من عدم مرور MEFs. استخدم شرائح العد التي تستخدم لمرة واحدة لعد الخلايا باستخدام المجهر الضوئي.
  3. إجراء التجارب في ثلاث نسخ. لذلك ، اختبر كل حالة بذر في ثلاثة آبار.
  4. قم بإجراء الحصول الآلي على الصور من اليوم 1 التالي للبذر باستخدام مقياس خلوي في وضع المجال الساطع. قم بإجراء الحصول الآلي على الصور كل 24 ساعة لمدة 5 أيام. للحصول على معلومات مفصلة حول المعلمات التجريبية ، راجع الملف التكميلي.
  5. استخدم التباين التلقائي والتعرض التلقائي لتصور الخلايا بشكل أفضل.
  6. اضبط إعداد التحليل (انظر الملف التكميلي) لتحليل التقاء لتطبيق قناع بنسبة 60٪ و 80٪ و 100٪ لكل بئر ، من أجل تقييم التغييرات في التركيز بسبب انكسار الضوء على حدود الآبار. استخدم إعداد تحليل القناع المختلف المذكور أعلاه لتحليل التقاء الخلية في كل نقطة زمنية.

4. التحليلات الإحصائية

  1. الإبلاغ عن النتائج الكمية كوسيلة ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
  2. لمقارنة الاختلافات الإجمالية لظروف الطلاء المختلفة ، احصل على البيانات باستخدام نفس العينات وقم بإجراء اختبار t للعينة المزدوجة للطالب. تعتبر قيم P الأقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية ، وجميع قيم p المبلغ عنها ذات وجهين.

5. توصيف الخيوط الدقيقة الهيكلية الخلوية

  1. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (4٪ PFA) في PBS لمدة 10 دقائق في RT ، متبوعا بغسلتين في PBS (إجمالي 10 دقائق).
  2. أضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب (المكون من 5٪ BSA ، 0.1٪ Triton في PBS) إلى كل بئر لمدة 1 ساعة في RT.
  3. قم بإزالة محلول الحجب واغسل العينات مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل المتقارن phalloidin-conjugate لكل عينة واحتضان لمدة 1 ساعة في RT.
  5. اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني (10 دقائق في RT).
  6. نوى البقع مع Hoechst 33342 مخففة 1: 10000 في PBS لمدة 10 دقائق في RT.
  7. قم بإزالة محلول Hoechst واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة.
  8. اغسل العينة ب H2O واتركها تجف تحت غطاء كيميائي.
  9. أضف 100 ميكرولتر من وسائط التركيب (أي PBS: الجلسرين ، 1: 1) لتغطية الخلايا والحفاظ على مضان العينات.
  10. راقب الخلية عند Ex / Em 493/517 نانومتر على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مزود بمصدر ليزر الضوء الأبيض (WLL) وليزر 405 نانومتر. احصل على صور متحدة البؤر متسلسلة باستخدام هدف الغمر بالزيت HC PLAPO 40x. استخدم نفس طاقة الليزر ، ومقسمات الشعاع ، وإعدادات المرشح ، وأقطار الثقب ، ووضع المسح لجميع العينات التي تم فحصها.

النتائج

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في التقاء iPSCs عند زراعتها في ظروف طلاء مختلفة. باستخدام مقياس الخلايا ، تمكنا من الحصول على نتائج مفيدة بسهولة في ثلاث نسخ في 5 أيام. نظرا لأن iPSCs بالكاد تلتصق بالأوعية البلاستيكية والطلاء ضروري لدعم انتشارها ، فقد قررنا مراقبة التقاء iPSCs البشرية لأنها تدل على ?...

Discussion

إن استخدام iPSCs لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية في المستقبل جنبا إلى جنب مع تطبيقها المحتمل في الطب الدقيق يجعلها تقنية ذات أهمية كبيرة ولهذا السبب نعتقد أنه من الضروري أن نفهم بوضوح حالة الزراعة في المختبر التي تشبه بشكل أفضل الحالة الفسيولوجية للخلايا الجذعية الجنينية. في هذا السياق ، اختبر?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم الدراسة بمنح من مؤسسة بامبينو جيسو و Ricerca Corrente (وزارة الصحة الإيطالية) إلى C.C.  نود أن نشكر الدكتور إنريكو بيرتيني (قسم علم الأعصاب ، وحدة الأمراض العصبية العضلية والتنكسية العصبية ، مختبر الطب الجزيئي ، مستشفى بامبينو جيسو لأبحاث الأطفال) ، الدكتورة ستيفانيا بيتريني (المرفق الأساسي للفحص المجهري البؤري ، مختبرات الأبحاث ، مستشفى بامبينو جيسو لأبحاث الأطفال) ، جوليا بيريكولي (قسم أمراض الدم والأورام والعلاج الجيني والخلوي ، مستشفى أبحاث الأطفال بامبينو جيسو) وروبرتا فيريتي (قسم أمراض الدم والأورام والعلاج الجيني والخلوي ، مستشفى أبحاث الأطفال بامبينو جيسو) للمناقشات العلمية والمساعدة الفنية. حصلت ماريا فينشي على "زمالة الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, SterileCorning4488Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubesFalcon352097Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+)Thermofisher14040133Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+)EurocloneECB4004LMedium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, SterileCorning4487Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-BottomGreiner Bio One655090Support
Cell culture plate, 6 wellCostar3516Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)SigmaD5671Medium
EDTASigmaED4SS-500gReagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming KitInvitrogenA15960Reagent
FAST - READ 102BiosigmaBVS100Tool
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270106Medium
FibronectinMerckFC010Coating
GlycerolSigmaG5516Reagent
H2OMILLIQ
HoechstThermofisher33342Reagent
Laminin 521Stem Cell Technologies77003Coating
L-Glutamine (200 mM)GibcoLS25030081Reagent
MatrigelCorning Matrigel hESC-Qualified Matrix354277Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF)Life TechnologiesA24903Coating
MTESR1 MediumStem Cell Technologies85851Medium
MTESR1 SupplementStem Cell Technologies85852Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122Reagent
PhalloidinSigmaP1951Reagent
VitronectinStem Cell Technologies7180Coating
Y-27632SigmaY0503Reagent

References

  1. Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
  2. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
  3. Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
  4. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
  5. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  6. Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
  7. Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
  8. Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
  9. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
  10. Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
  11. Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
  12. Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  13. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
  14. Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
  15. Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
  16. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  17. Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
  18. Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
  19. Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
  20. Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
  21. Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
  22. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
  23. Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
  24. Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
  25. Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
  26. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
  27. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  28. Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved