Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem.

Resumo

O objetivo do protocolo é comparar diferentes condições de revestimento de matriz extracelular (ECM) para avaliar como o revestimento diferencial afeta a taxa de crescimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em particular, pretendemos estabelecer condições para obter o crescimento ideal das culturas de iPSC.

Resumo

Este estudo se concentra em entender como o crescimento de iPSCs em diferentes substratos de revestimento de ECM pode afetar a confluência celular. Um protocolo para avaliar a confluência de iPSC em tempo real foi estabelecido sem a necessidade de contar células em suspensão de célula única para evitar qualquer perturbação do crescimento. Um sistema de análise de imagens de alto conteúdo foi usado para avaliar a confluência de iPCS em 4 ECMs diferentes ao longo do tempo de forma automatizada. Diferentes configurações de análise foram usadas para avaliar a confluência celular de iPSCs aderentes e apenas uma pequena diferença (em 24 e 48 horas com laminina) foi observada se uma máscara de 60, 80 ou 100% foi aplicada. Também mostramos que a laminina leva à melhor confluência em comparação com Matrigel, vitronectina e fibronectina.

Introdução

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são obtidas a partir de células somáticas e podem ser diferenciadas em diferentes tipos de células. Eles são frequentemente usados como um sistema para modelar a patogênese da doença ou realizar triagem de medicamentos, e também oferecem o potencial para ser usado no contexto da medicina personalizada. Como as iPSCs têm grande potencial, é importante caracterizá-las completamente para uso como um sistema modelo confiável. Mostramos anteriormente a importância do cultivo de iPSCs em um ambiente hipóxico, pois essas células dependem da glicólise e um ambiente aeróbio pode causar desequilíbrio^redox1. As iPSCs também são vulneráveis a outras condições de cultura, particularmente o ambiente extracelular. A otimização das condições da cultura é uma questão fundamental para mantê-las saudáveis e proliferantes. Uma cultura saudável de iPSC levará a células diferenciadas saudáveis que geralmente são o ponto final do modelo usado para entender as características moleculares, celulares e funcionais de distúrbios humanos específicos ou processos celulares.

Neste estudo, um protocolo simples foi utilizado para testar a confluência de iPSCs utilizando diferentes condições de revestimento em poços separados. As iPSCs requerem uma camada alimentadora de fibroblastos embrionários murinos (MEF) para se ligarem adequadamente, mas a coexistência de iPSCs e MEF dificulta a realização de análises como RNA ou extração de proteínas, uma vez que duas populações de células estão presentes. A fim de evitar a camada de alimentação, diferentes proteínas pertencentes à matriz extracelular (ECM) têm sido utilizadas para recriar o nicho celular natural e para ter cultura iPSC livre de alimentador. Em particular, Matrigel é uma preparação de membrana basal solubilizada extraída do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que é enriquecida em proteínas da matriz extracelular (ou seja, laminina, colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparano, entactina/nidogênio e fatores de crescimento)^2,3. As outras condições de revestimento utilizadas são, em vez disso, proteínas purificadas com relevância conhecida na construção dos ECMs: a laminina-521 é conhecida por ser secretada por células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) na massa celular interna do embrião e é uma das lamininas mais comuns no corpo após o nascimento 4,5,6,7,8,9^{, 10,11}; a vitronectina é uma matriz de cultura celular livre de xeno conhecida por apoiar o crescimento e a diferenciação da hPSC 12,13,14,15,16; a fibronectina é uma proteína da MEC importante para o desenvolvimento de vertebrados e a fixação e manutenção de células-tronco embrionárias em estado pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Uma vez que diferentes condições de revestimento estão disponíveis, nós as comparamos em termos de seu efeito na confluência das iPSCs.

Protocolo

1. Revestimento de 96 placas de poço

NOTA: Diferentes revestimentos foram testados na mesma placa, mas poços separados (consulte Arquivo Suplementar).

1. Diluir o Matrigel 1:100 em DMEM. Adicionar 100 μL por poço às 96 placas de poço e incubar por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução e lave os poços com 100 μL de DMEM duas vezes.
2. Laminina diluída (20 μg/mL, LN-521) em PBS (com cálcio e magnésio). Adicionar 100 μL ao poço e incubar a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, realize duas lavagens com DMEM antes de semear as células.
3. Vitronectina diluída (10 μg/mL) em tampão de diluição. Adicionar 100 μL por poço à placa de 96 poços e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lave os poços com PBS (sem cálcio e magnésio) antes de chapear as células.
4. Diluir HU-Fibronectina (30 μg/mL) em ddH₂O. Adicionar 100 μL aos poços e incubar à temperatura ambiente por 45 minutos. Em seguida, lave os poços com o meio antes de semear as células.

2. Manutenção das iPSCs em cultura

NOTA: iPSCs foram comprados comercialmente. As iPSCs foram derivadas de fibroblastos humanos saudáveis e reprogramadas usando tecnologia episómica.

1. A partir do congelador a -80 °C ou do azoto líquido, descongelar as iPSCs criopreservadas num banho-maria de 37 °C. Limpe o frasco para injetáveis que contém as células com etanol a 70% antes de o mover para o armário de segurança biológica.
2. Adicione a suspensão celular a 5 mL de meio de cultura celular pré-aquecido (por exemplo, mTeSR1) gota a gota com uma pipeta de 1000 μL em um tubo cônico estéril de 15 mL.
3. Centrifugar as células a 304 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
4. Remova o meio e ressuspenda o pellet celular em 4 mL de meio de cultura celular.
5. Chapear a suspensão celular em dois poços das placas de 6 poços (10⁵ iPSCs por placa de cultura celular de 6 poços), onde os fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) foram revestidos anteriormente. MEFs de sementes dois dias antes do revestimento de iPSCs a uma densidade de 2,4 x 10⁴/cm² em DMEM (contendo 10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina).
6. Após a semeadura, complemente o meio celular com 10 μM de inibidor de ROCK Y-27632.
7. Cultivar as iPSCs em MEFs durante as primeiras 4-5 semanas e, em seguida, em condição livre de alimentador (condição livre de MEF), usando um dos revestimentos de interesse (ver etapa 1 e Tabela 1) em mTeSR1.
8. Quando as iPSCs são 70-80% confluentes, passagem 1:4 usando o tratamento de EDTA 0,5 mM por 3-5 min no RT. Adicione 1 mL de EDTA 0,5 mM para uma placa de 6 poços (ou quantidades proporcionais para outros tipos de placas). Transferir para novos poços em condições livres de alimentadores e incubar a 37 °C, 5% de CO2, 20% de O₂.
9. Mude a mídia com mTeSR1 fresco todos os dias e divida as células a cada 2 dias.

3. Caracterização da confluência celular

1. Use 96 placas de poço para os experimentos.
2. Semear 10.000 células por poço após pelo menos 1 mês de cultura em condição livre de alimentadores, a fim de ter certeza de que os MEFs não foram passados. Use lâminas de contagem descartáveis para contar as células com o microscópio óptico.
3. Realizar os experimentos em triplicado. Portanto, teste cada condição de semeadura em três poços.
4. Realize a aquisição automatizada de imagens a partir do dia 1 após a semeadura usando um citômetro no modo de campo brilhante. Realize a aquisição automatizada de imagens a cada 24 horas durante 5 dias. Para obter informações detalhadas sobre os parâmetros experimentais, consulte o Arquivo Suplementar.
5. Use o auto-contraste e auto-exposição para visualizar melhor as células.
6. Defina a configuração de análise (consulte Arquivo Suplementar) para análise de confluência para aplicar uma máscara de 60%, 80% e 100% por poço, a fim de avaliar as mudanças de foco devido à refração de luz na borda dos poços. Use a configuração de análise de máscara diferente mencionada acima para analisar a confluência celular em cada ponto de tempo.

4. Análises estatísticas

1. Relatar resultados quantitativos como meio ± erro padrão da média (EPM).
2. Para comparar as diferenças gerais das diferentes condições de revestimento, obtenha dados usando as mesmas amostras e execute o teste t de amostra emparelhada de Student. Valores de p menores que 0,05 são considerados estatisticamente significativos, e todos os valores de p relatados são de dois lados.

5. Caracterização dos microfilamentos citoesqueléticos

1. Fixar células com paraformaldeído a 4% (PFA a 4%) em PBS por 10 min no RT, seguido de duas lavagens em PBS (total de 10 min).
2. Adicionar 100 μL de solução de bloqueio (composta por 5% de BSA, 0,1% de Triton em PBS) a cada poço por 1 h no RT.
3. Retire a solução de bloqueio e lave as amostras duas vezes com PBS por 10 min.
4. Adicionar 100 μL da solução de trabalho conjugada com faloidina por amostra e incubar durante 1 h a RT.
5. Lave as células duas vezes com PBS (10 min no RT).
6. Núcleos de coloração com Hoechst 33342 diluídos 1:10000 em PBS durante 10 min a RT.
7. Retire a solução Hoechst e lave as células duas vezes com PBS durante 10 minutos de cada vez.
8. Lavar a amostra com H₂O e deixar secar debaixo de um exaustor químico.
9. Adicionar 100 μL de meio de montagem (ou seja, PBS:glicerol, 1:1) para cobrir as células e preservar a fluorescência das amostras.
10. Observe a célula em Ex/Em 493/517 nm em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma fonte de laser de luz branca (WLL) e um laser de diodo de 405 nm. Adquira imagens confocais sequenciais usando um objetivo de imersão em óleo HC PLAPO 40x. Use a mesma potência do laser, divisores de feixe, configurações de filtro, diâmetros de orifício e modo de varredura para todas as amostras examinadas.

Resultados

Neste estudo, investigamos a confluência de iPSCs quando cultivadas em diferentes condições de revestimento. Usando um citômetro, fomos capazes de obter resultados prontamente informativos em triplicados em 5 dias. Como as iPSCs dificilmente se ligam a recipientes plásticos e um revestimento é necessário para suportar sua proliferação, decidimos monitorar a confluência de iPSCs humanas, pois é indicativa da saúde da cultura celular e pode refletir em seu potencial de diferenciação. Após a expansão in vitr...

Discussão

O uso de iPSCs para modelagem de doenças e futura triagem de medicamentos, juntamente com sua possível aplicação em medicina de precisão, torna-a uma tecnologia de grande relevância e, por essa razão, acreditamos que é necessário entender claramente a condição de cultura in vitro que melhor se assemelha à situação fisiológica das células-tronco embrionárias. Neste contexto, testamos diferentes revestimentos de ECM usando iPSCs do tipo selvagem, a fim de entender as condições que permitem que as célula...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4488	Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	352097	Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+)	Thermofisher	14040133	Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+)	Euroclone	ECB4004L	Medium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4487	Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom	Greiner Bio One	655090	Support
Cell culture plate, 6 well	Costar	3516	Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)	Sigma	D5671	Medium
EDTA	Sigma	ED4SS-500g	Reagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit	Invitrogen	A15960	Reagent
FAST - READ 102	Biosigma	BVS100	Tool
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270106	Medium
Fibronectin	Merck	FC010	Coating
Glycerol	Sigma	G5516	Reagent
H2O		MILLIQ
Hoechst	Thermofisher	33342	Reagent
Laminin 521	Stem Cell Technologies	77003	Coating
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	LS25030081	Reagent
Matrigel	Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	354277	Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF)	Life Technologies	A24903	Coating
MTESR1 Medium	Stem Cell Technologies	85851	Medium
MTESR1 Supplement	Stem Cell Technologies	85852	Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Reagent
Phalloidin	Sigma	P1951	Reagent
Vitronectin	Stem Cell Technologies	7180	Coating
Y-27632	Sigma	Y0503	Reagent