Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.

Résumé

L’objectif du protocole est de comparer différentes conditions de revêtement de la matrice extracellulaire (ECM) afin d’évaluer comment le revêtement différentiel affecte le taux de croissance des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). En particulier, nous visons à mettre en place les conditions pour obtenir une croissance optimale des cultures iPSC.

Résumé

Cette étude vise à comprendre comment la croissance des CSPi sur différents substrats de revêtement ECM peut affecter la confluence cellulaire. Un protocole permettant d’évaluer la confluence des CSPi en temps réel a été établi sans qu’il soit nécessaire de compter les cellules en suspension unicellulaire pour éviter toute perturbation de la croissance. Un système d’analyse d’images à haut contenu a été utilisé pour évaluer de manière automatisée la confluence iPCS sur 4 ECM différents au fil du temps. Différents paramètres d’analyse ont été utilisés pour évaluer la confluence cellulaire des CSPi adhérentes et seule une légère différence (à 24 et 48 heures avec la laminine) a été observée si un masque à 60, 80 ou 100% a été appliqué. Nous montrons également que la laminine conduit à la meilleure confluence par rapport à Matrigel, la vitronectine et la fibronectine.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont obtenues à partir de cellules somatiques et peuvent être différenciées en différents types de cellules. Ils sont souvent utilisés comme système pour modéliser la pathogenèse des maladies ou effectuer le dépistage de médicaments, et offrent également le potentiel d’être utilisés dans le contexte de la médecine personnalisée. Étant donné que les CSPi ont un grand potentiel, il est important de les caractériser pleinement pour les utiliser en tant que système modèle fiable. Nous avons déjà montré l’importance de cultiver des CSPi dans un environnement hypoxique, car ces cellules dépendent de la glycolyse et un environnement aérobie peut provoquer un déséquilibre redox¹. Les CSPi sont également vulnérables à d’autres conditions de culture, en particulier l’environnement extracellulaire. L’optimisation des conditions de culture est un enjeu clé pour les maintenir en bonne santé et proliférer. Une culture saine de CSPi conduira à des cellules différenciées saines qui sont généralement le point final du modèle utilisé pour comprendre les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles de troubles humains ou de processus cellulaires spécifiques.

Dans cette étude, un protocole simple a été utilisé pour tester la confluence des CSPi en utilisant différentes conditions de revêtement dans des puits séparés. Les CSPi nécessitent une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires murins (MEF) pour se fixer correctement, mais la coexistence des CSPi et du MEF rend difficile l’analyse comme l’extraction d’ARN ou de protéines puisque deux populations de cellules sont présentes. Afin d’éviter la couche nourricière, différentes protéines appartenant à la matrice extracellulaire (ECM) ont été utilisées pour recréer la niche cellulaire naturelle et pour avoir une culture iPSC sans nourrisseur. En particulier, Matrigel est une préparation solubilisée de membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), qui est enrichie en protéines de la matrice extracellulaire (c.-à-d. laminine, collagène IV, protéoglycanes sulfate d’héparane, entactine/nidogène et facteurs de croissance)^2,3. Les autres conditions de revêtement utilisées sont plutôt des protéines purifiées dont la pertinence dans la construction des ECM est connue : la laminine-521 est connue pour être sécrétée par les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans la masse cellulaire interne de l’embryon et c’est l’une des laminines les plus courantes dans le corps après la naissance 4,5,6,7,8,9^{, 10,11}; la vitronectine est une matrice de culture cellulaire exempte de xéno connue pour soutenir la croissance et la différenciation des^CSPh 12,13,14,15,16; La fibronectine est une protéine ECM importante pour le développement des vertébrés et la fixation et le maintien des cellules souches embryonnaires à l’état pluripotent 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Étant donné que différentes conditions de revêtement sont disponibles, nous les comparons en termes d’effet sur la confluence des CSPi.

Protocole

1. Revêtement de 96 plaques de puits

REMARQUE : Différents revêtements ont été testés dans la même plaque, mais dans des puits distincts (voir le dossier supplémentaire).

1. Diluer le Matrigel 1:100 dans DMEM. Ajouter 100 μL par puits aux plaques de 96 puits et incuber pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, retirez la solution et lavez les puits avec 100 μL de DMEM deux fois.
2. Laminine diluée (20 μg/mL, LN-521) dans du PBS (avec calcium et magnésium). Ajouter 100 μL au puits et incuber à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, effectuez deux lavages avec DMEM avant d’ensemencer les cellules.
3. Diluer la vitronectine (10 μg/mL) dans un tampon de dilution. Ajouter 100 μL par puits à la plaque de 96 puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Lavez les puits avec du PBS (sans calcium ni magnésium) avant de plaquer les cellules.
4. Diluer la HU-fibronectine (30 μg/mL) dans le ddH₂O. Ajouter 100 μL dans les puits et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. Ensuite, lavez les puits avec le milieu avant d’ensemencer les cellules.

2. Maintien des CSPi en culture

REMARQUE : Les CSPi ont été achetées dans le commerce. Les CSPi ont été dérivées de fibroblastes humains sains et reprogrammées à l’aide de la technologie épisomique.

1. À partir du congélateur à -80 °C ou de l’azote liquide, décongeler les CSPi cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C. Nettoyez le flacon contenant les cellules avec de l’éthanol à 70 % avant de le déposer dans l’enceinte de sécurité biologique.
2. Ajouter goutte à goutte la suspension cellulaire à 5 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé (p. ex. mTeSR1) goutte à goutte à l’aide d’une pipette de 1000 μL dans un tube conique stérile de 15 mL.
3. Centrifuger les cellules à 304 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
4. Retirer le milieu et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL de milieu de culture cellulaire.
5. Plaquer la suspension cellulaire dans deux puits des 6 plaques de puits (10⁵ CSPi par boîte de culture cellulaire à 6 puits), où les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ont été plaqués précédemment. Semencez des MEF deux jours avant le placage de CSPi à une densité de 2,4 x 10⁴/cm² dans du DMEM (contenant 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de L-glutamine et 1 % de pénicilline-streptomycine).
6. Après l’ensemencement, compléter le milieu cellulaire avec 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632.
7. Cultiver les CSPi sur MEF pendant les 4-5 premières semaines, puis à l’état sans alimentation (condition sans MEF), en utilisant l’un des revêtements d’intérêt (voir l’étape 1 et le tableau 1) dans mTeSR1.
8. Lorsque les CSPi sont confluentes à 70-80%, passage 1:4 en utilisant un traitement EDTA de 0,5 mM pendant 3-5 min à TA. Ajouter 1 mL d’EDTA 0,5 mM pour une plaque à 6 puits (ou des quantités proportionnelles pour les autres types de plaques). Transférer dans de nouveaux puits dans des conditions sans alimentation et incuber à 37 °C, 5% CO2, 20% O₂.
9. Changez le support avec mTeSR1 frais tous les jours et divisez les cellules tous les 2 jours.

3. Caractérisation de la confluence cellulaire

1. Utilisez 96 plaques de puits pour les expériences.
2. Ensemencer 10 000 cellules par puits après au moins 1 mois de culture en conditions exemptes de mangeoire afin de s’assurer que les MEF n’ont pas été transmis. Utilisez des lames de comptage jetables pour compter les cellules avec le microscope optique.
3. Effectuez les expériences en trois exemplaires. Par conséquent, testez chaque condition d’ensemencement dans trois puits.
4. Effectuer l’acquisition automatisée d’images dès le jour 1 suivant l’ensemencement à l’aide d’un cytomètre en mode fond clair. Effectuez une acquisition d’image automatisée toutes les 24 heures pendant 5 jours. Pour obtenir des informations détaillées sur les paramètres expérimentaux, reportez-vous au fichier supplémentaire.
5. Utilisez le contraste automatique et l’exposition automatique pour mieux visualiser les cellules.
6. Définissez le paramètre d’analyse (voir Fichier supplémentaire) pour l’analyse de confluence afin d’appliquer un masque de 60%, 80% et 100% par puits, afin d’évaluer les changements de focalisation dus à la réfraction de la lumière à la limite des puits. Utilisez les différents paramètres d’analyse de masque mentionnés ci-dessus pour analyser la confluence cellulaire à chaque point temporel.

4. Analyses statistiques

1. Déclarez les résultats quantitatifs sous forme de moyennes ±'erreur-type de la moyenne (MEB).
2. Pour comparer les différences globales des différentes conditions de revêtement, obtenez des données en utilisant les mêmes échantillons et effectuez le test t de l’échantillon apparié de Student. Les valeurs de p inférieures à 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives, et toutes les valeurs p déclarées sont recto verso.

5. Caractérisation des microfilaments cytosquelettiques

1. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (4% PFA) dans PBS pendant 10 min à TA, suivi de deux lavages dans PBS (10 min au total).
2. Ajouter 100 μL de solution de blocage (composée de 5% de BSA, 0,1% de Triton dans PBS) à chaque puits pendant 1 h à TA.
3. Retirer la solution bloquante et laver les échantillons deux fois avec du PBS pendant 10 min.
4. Ajouter 100 μL de la solution de travail conjuguée phalloïdine-conjuguée par échantillon et incuber pendant 1 h à TA.
5. Lavez les cellules deux fois avec du PBS (10 min à TA).
6. Colorer les noyaux avec Hoechst 33342 dilué 1:10000 dans PBS pendant 10 min à TA.
7. Retirez la solution Hoechst et lavez les cellules deux fois avec du PBS pendant 10 minutes à chaque fois.
8. Laver l’échantillon avec H₂O et laisser sécher sous une hotte chimique.
9. Ajouter 100 μL de support de montage (c.-à-d. PBS:glycérol, 1:1) pour couvrir les cellules et préserver la fluorescence des échantillons.
10. Observez la cellule à Ex/Em 493/517 nm sur un microscope confocal à balayage laser équipé d’une source laser à lumière blanche (WLL) et d’un laser à diode de 405 nm. Acquérir des images confocales séquentielles à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile HC PLAPO 40x. Utilisez la même puissance laser, les mêmes séparateurs de faisceau, les mêmes réglages de filtre, les mêmes diamètres de trous d’épingle et le même mode de balayage pour tous les échantillons examinés.

Résultats

Dans cette étude, nous avons étudié la confluence des CSPi lorsqu’elles sont cultivées dans différentes conditions de revêtement. À l’aide d’un cytomètre, nous avons pu obtenir des résultats facilement informatifs en trois exemplaires en 5 jours. Étant donné que les CSPi se fixent à peine aux récipients en plastique et qu’un revêtement est nécessaire pour favoriser leur prolifération, nous avons décidé de surveiller la confluence des CSPi humaines car elle indique la santé de la culture cellula...

Discussion

L’utilisation des CSPi pour la modélisation des maladies et le dépistage futur des médicaments, ainsi que leur application possible en médecine de précision, en font une technologie d’une grande pertinence et, pour cette raison, nous pensons qu’il est nécessaire de comprendre clairement les conditions de culture in vitro qui ressemblent mieux à la situation physiologique des cellules souches embryonnaires. Dans ce contexte, nous avons testé différents revêtements ECM utilisant des CSPi de type sauvage afi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4488	Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	352097	Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+)	Thermofisher	14040133	Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+)	Euroclone	ECB4004L	Medium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4487	Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom	Greiner Bio One	655090	Support
Cell culture plate, 6 well	Costar	3516	Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)	Sigma	D5671	Medium
EDTA	Sigma	ED4SS-500g	Reagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit	Invitrogen	A15960	Reagent
FAST - READ 102	Biosigma	BVS100	Tool
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270106	Medium
Fibronectin	Merck	FC010	Coating
Glycerol	Sigma	G5516	Reagent
H2O		MILLIQ
Hoechst	Thermofisher	33342	Reagent
Laminin 521	Stem Cell Technologies	77003	Coating
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	LS25030081	Reagent
Matrigel	Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	354277	Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF)	Life Technologies	A24903	Coating
MTESR1 Medium	Stem Cell Technologies	85851	Medium
MTESR1 Supplement	Stem Cell Technologies	85852	Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Reagent
Phalloidin	Sigma	P1951	Reagent
Vitronectin	Stem Cell Technologies	7180	Coating
Y-27632	Sigma	Y0503	Reagent