JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מטרת הפרוטוקול היא להשוות בין תנאי ציפוי שונים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי להעריך כיצד ציפוי דיפרנציאלי משפיע על קצב הצמיחה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). בפרט, אנו שואפים ליצור תנאים להשגת צמיחה אופטימלית של תרביות iPSC.

Abstract

מחקר זה מתמקד בהבנת האופן שבו גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים על מצעי ציפוי ECM שונים יכול להשפיע על מפגש התאים. פרוטוקול להערכת מפגש iPSC בזמן אמת נקבע ללא צורך לספור תאים בתרחיף של תא בודד כדי למנוע כל הפרעה בגדילה. מערכת ניתוח תמונות בעלת תוכן גבוה שימשה להערכת מפגש iPCS על 4 ECMs שונים לאורך זמן באופן אוטומטי. הגדרות ניתוח שונות שימשו להערכת מפגש תאים של iPSCs דבקים ורק הבדל קל (ב 24 ו 48 שעות עם laminin) נצפתה אם מסכה 60, 80 או 100% הוחל. אנו גם מראים כי laminin להוביל את המפגש הטוב ביותר לעומת Matrigel, vitronectin ו fibronectin.

Introduction

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מתקבלים מתאים סומטיים וניתן למיין אותם לסוגי תאים שונים. הם משמשים לעתים קרובות כמערכת למודל פתוגנזה של מחלות או לביצוע בדיקת תרופות, וגם מציעים את הפוטנציאל לשמש בהקשר של רפואה מותאמת אישית. מאז iPSCs יש פוטנציאל גדול, חשוב לאפיין אותם באופן מלא לשימוש כמערכת מודל אמין. בעבר הראינו את החשיבות של גידול תאי גזע פלוריפוסיים בסביבה היפוקסית, שכן תאים אלה מסתמכים על גליקוליזה וסביבה אירובית עלולה לגרום לחוסר איזון חמצון-חיזור1. תאי גזע פלוריפוטנטיים עצביים פגיעים גם לתנאי תרבית אחרים, במיוחד לסביבה החוץ-תאית. אופטימיזציה של תנאי התרבות היא נושא מרכזי כדי לשמור עליהם בריאים ומתרבים. תרבית iPSC בריאה תוביל לתאים ממוינים בריאים שהם בדרך כלל נקודת הקצה של המודל המשמש להבנת תכונות מולקולריות, תאיות ותפקודיות של הפרעות אנושיות ספציפיות או תהליכים תאיים.

במחקר זה, נעשה שימוש בפרוטוקול פשוט כדי לבדוק את המפגש של iPSCs באמצעות תנאי ציפוי שונים בבארות נפרדות. תאי גזע פלוריפוטנטיים דורשים שכבה מזינה של פיברובלסטים עובריים (MEF) כדי להתחבר כראוי, אך הדו-קיום של תאי גזע פלוריפוטנטיים ו-MEF מקשה על ביצוע אנליזה כמו RNA או מיצוי חלבונים מכיוון שקיימות שתי אוכלוסיות של תאים. על מנת להימנע משכבת ההזנה, חלבונים שונים השייכים למטריצה החוץ-תאית (ECM) שימשו כדי ליצור מחדש את נישת התאים הטבעית וכדי לקבל תרבית iPSC ללא הזנה. בפרט, Matrigel הוא תכשיר ממברנת מרתף מסולפת המופק מסרקומה של עכבר אנגלברט-הולם-נחיל (EHS), המועשרת בחלבוני מטריצה חוץ-תאית (כלומר, למינין, קולגן IV, פרוטאוגליקנים של הפראן סולפט, אנטקטין/נידוג'ן וגורמי גדילה)2,3. תנאי הציפוי האחרים המשמשים הם במקום זאת חלבונים מטוהרים עם רלוונטיות ידועה בבניית ה- ECMs: laminin-521 ידוע כמופרש על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) במסת התא הפנימית של העובר והוא אחד הלמינינים הנפוצים ביותר בגוף לאחר הלידה 4,5,6,7,8,9, 10,11; ויטרונקטין הוא מטריצת תרבית תאים נטולת קסנו-קסנו, הידועה כתומכת בצמיחה ובהתמיינות של hPSC 12,13,14,15,16; פיברונקטין הוא חלבון ECM החשוב להתפתחות בעלי חוליות ולחיבור ותחזוקה של תאי גזע עובריים במצב פלוריפוטנטי 17,18,19,20,21,22,23,24,25. מכיוון שתנאי ציפוי שונים זמינים, אנו משווים אותם מבחינת השפעתם על מפגש ה-iPSCs.

Protocol

1. ציפוי 96 לוחות באר

הערה: ציפויים שונים נבדקו באותה צלחת אך בארות נפרדות (ראה קובץ משלים).

  1. לדלל את המטריגל 1:100 ב-DMEM. הוסיפו 100 מיקרון לבאר ל-96 לוחות הקידוח ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את התמיסה ושטוף את הבארות עם 100 μL של DMEM פעמיים.
  2. לדלל למינין (20 מיקרוגרם/מ"ל, LN-521) ב-PBS (עם סידן ומגנזיום). יש להוסיף 100 μL לבאר ולדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת לבצע שתי שטיפות עם DMEM לפני זריעת התאים.
  3. דילול ויטרונקטין (10 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר דילול. יש להוסיף 100 μL לכל באר לצלחת 96 הבאר ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף את הבארות עם PBS (ללא סידן ומגנזיום) לפני ציפוי התאים.
  4. יש לדלל HU-פיברונקטין (30 מיקרוגרם/מ"ל) ב-ddH2O. יש להוסיף 100 מיקרוגרם לבארות ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. לאחר מכן, לשטוף את הבארות עם המדיום לפני זריעת התאים.

2. תחזוקה של iPSCs בתרבות

הערה: iPSCs נרכשו באופן מסחרי. ה-iPSCs הופקו מפיברובלסטים אנושיים בריאים ותוכנתו מחדש באמצעות טכנולוגיה אפיזומלית.

  1. מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי, הפשירו את ה- iPSCs בהקפאה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. נקו את הבקבוקון המכיל את התאים עם 70% אתנול לפני העברתו לארון הבטיחות הביולוגי.
  2. הוסף את תרחיף התא ל-5 מ"ל של מדיית תרבית תאים שחוממה מראש (לדוגמה, mTeSR1) טיפה אחר טיפה עם פיפטה של 1000 μL בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה של התאים ב 304 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  4. הסר את המדיה והשהה את כדור התא ב -4 מ"ל של מדיום תרבית תאים.
  5. צלחת את תרחיף התא לתוך שתי בארות של 6 לוחות באר (105 iPSCs לכל צלחת תרבית תאים 6 באר), שבו פיברובלסטים עובריים העכבר (MEFs) כבר מצופה בעבר. זרעי MEFs יומיים לפני ציפוי iPSCs בצפיפות של 2.4 x 104/cm2 ב- DMEM (המכיל 10% סרום בקר עוברי, 1% L-גלוטמין ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
  6. לאחר הזריעה, השלימו את מדיית התא עם 10 מיקרומטר של מעכב ROCK Y-27632.
  7. הגדל את ה- iPSCs על MEFs במשך 4-5 השבועות הראשונים ולאחר מכן במצב ללא מזין (מצב ללא MEF), באמצעות אחד הציפויים המעניינים (ראה שלב 1 וטבלה 1) ב- mTeSR1.
  8. כאשר ה- iPSCs הם 70-80% נפגשים, מעבר 1:4 באמצעות 0.5 mM EDTA טיפול במשך 3-5 דקות ב RT. הוסף 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA עבור צלחת 6 באר (או כמויות פרופורציונליות עבור סוגים אחרים של צלחות). מעבירים לבארות חדשות בתנאים נטולי הזנה ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 20% O2.
  9. שנה את המדיה עם mTeSR1 טרי מדי יום ופצל את התאים כל יומיים.

3. אפיון מפגש תאים

  1. השתמש ב-96 לוחות באר לניסויים.
  2. זרעו 10,000 תאים בכל באר לאחר לפחות חודש אחד של גידול במצב ללא הזנה כדי להיות בטוחים שה-MEFs לא הועברו. השתמש בשקופיות ספירה חד פעמיות כדי לספור את התאים באמצעות המיקרוסקופ האופטי.
  3. בצע את הניסויים במשולש. לכן, בדקו כל מצב זריעה בשלוש בארות.
  4. בצע רכישת תמונה אוטומטית מהיום הראשון שלאחר הזריעה באמצעות ציטומטר במצב שדה בהיר. בצע רכישת תמונות אוטומטית כל 24 שעות למשך 5 ימים. למידע מפורט על הפרמטרים הניסיוניים, עיין בקובץ המשלים.
  5. השתמש בניגודיות אוטומטית ובחשיפה אוטומטית כדי להציג תאים באופן חזותי טוב יותר.
  6. הגדר את הגדרת הניתוח (ראה קובץ משלים) לניתוח מפגש כדי להחיל מסכה של 60%, 80% ו-100% לכל באר, על מנת להעריך את השינויים במיקוד עקב שבירת האור בגבול הבארות. השתמש בהגדרת ניתוח המסיכות השונה שהוזכרה לעיל כדי לנתח את מפגש התאים בכל נקודת זמן.

4. ניתוחים סטטיסטיים

  1. דווח על תוצאות כמותיות כאמצעי ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
  2. כדי להשוות את ההבדלים הכוללים בין תנאי הציפוי השונים, קבל נתונים באמצעות אותן דגימות ובצע את מבחן ה- t של הסטודנט עם דגימה זוגית. ערכי P הנמוכים מ- 0.05 נחשבים למובהקים סטטיסטית, וכל ערכי ה- p המדווחים הם דו-צדדיים.

5. אפיון המיקרופילמנטים הציטוסקטליים

  1. תקן תאים עם 4% פרפורמלדהיד (4% PFA) ב-PBS למשך 10 דקות ב-RT, ולאחר מכן שתי שטיפות ב-PBS (10 דקות בסך הכל).
  2. הוסף 100 μL של תמיסת חסימה (המורכבת מ-5% BSA, 0.1% טריטון ב-PBS) לכל באר למשך שעה אחת ב-RT.
  3. הסר את תמיסת החסימה ושטוף את הדגימות פעמיים עם PBS למשך 10 דקות.
  4. הוסיפו 100 μL של תמיסת העבודה המצומדת phalloidin לכל דגימה ודגרו במשך שעה אחת ב-RT.
  5. שטפו תאים פעמיים עם PBS (10 דקות ב-RT).
  6. גרעיני כתם עם Hoechst 33342 מדולל 1:10000 ב- PBS במשך 10 דקות ב- RT.
  7. הסר את תמיסת Hoechst ושטוף את התאים פעמיים עם PBS במשך 10 דקות בכל פעם.
  8. שטפו את הדגימה עם H2O והניחו לה להתייבש מתחת למכסה המנוע הכימי.
  9. הוסף 100 μL של מדיה הרכבה (כלומר PBS:גליצרול, 1:1) כדי לכסות את התאים ולשמר פלואורסצנטיות של דגימות.
  10. התבונן בתא ב- Ex/Em 493/517 ננומטר במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר המצויד במקור לייזר אור לבן (WLL) ולייזר דיודה של 405 ננומטר. רכשו תמונות קונפוקליות עוקבות באמצעות מטרת טבילת שמן HC PLAPO 40x. השתמש באותו כוח לייזר, מפצלי קרן, הגדרות מסנן, קוטרי חור סיכה ומצב סריקה עבור כל הדגימות שנבדקו.

תוצאות

במחקר זה חקרנו את המפגש של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) כאשר הם גדלים בתנאי ציפוי שונים. באמצעות ציטומטר, הצלחנו להשיג תוצאות אינפורמטיביות בקלות במשולשים תוך 5 ימים. מאחר שתאי גזע פלוריפוטנטיים כמעט ואינם נצמדים לכלי פלסטיק ויש צורך בציפוי כדי לתמוך בהתפשטותם, החלטנו לעקוב אחר המפגש של תאי ...

Discussion

השימוש ב- iPSCs למידול מחלות ובדיקת תרופות עתידיות יחד עם היישום האפשרי שלהם ברפואה מדויקת הופכים אותה לטכנולוגיה בעלת רלוונטיות רבה ומסיבה זו אנו מאמינים כי יש צורך להבין בבירור את מצב התרבות במבחנה הדומה יותר למצב הפיזיולוגי של תאי גזע עובריים. בהקשר זה, בדקנו ציפויי ECM שונים באמצעות iPSCs מס...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי מענקים ממשרד הבריאות האיטלקי פונדציונה במבינו גסו (Fondazione Bambino Gesù) ורייסרקה קורנטה (Ricerca Corrente) ל-C.C.  ברצוננו להודות לד"ר אנריקו ברתיני (המחלקה למדעי המוח, היחידה למחלות נוירומוסקולריות ונוירודגנרטיביות, המעבדה לרפואה מולקולרית, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו), ד"ר סטפניה פטריני (מתקן ליבה למיקרוסקופיה קונפוקלית, מעבדות מחקר, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו), ג'וליה פריקולי (המחלקה לאונקו-המטולוגיה, גנים ותרפיה תאית, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו) ורוברטה פרטי (המחלקה לאונקו-המטולוגיה, טיפול גנטי ותאי, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו) לדיונים מדעיים ועזרה טכנית. מריה וינצ'י זכתה ב"מלגת ילדים חולי סרטן בבריטניה".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, SterileCorning4488Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubesFalcon352097Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+)Thermofisher14040133Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+)EurocloneECB4004LMedium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, SterileCorning4487Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-BottomGreiner Bio One655090Support
Cell culture plate, 6 wellCostar3516Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)SigmaD5671Medium
EDTASigmaED4SS-500gReagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming KitInvitrogenA15960Reagent
FAST - READ 102BiosigmaBVS100Tool
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270106Medium
FibronectinMerckFC010Coating
GlycerolSigmaG5516Reagent
H2OMILLIQ
HoechstThermofisher33342Reagent
Laminin 521Stem Cell Technologies77003Coating
L-Glutamine (200 mM)GibcoLS25030081Reagent
MatrigelCorning Matrigel hESC-Qualified Matrix354277Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF)Life TechnologiesA24903Coating
MTESR1 MediumStem Cell Technologies85851Medium
MTESR1 SupplementStem Cell Technologies85852Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122Reagent
PhalloidinSigmaP1951Reagent
VitronectinStem Cell Technologies7180Coating
Y-27632SigmaY0503Reagent

References

  1. Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
  2. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
  3. Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
  4. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
  5. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  6. Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
  7. Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
  8. Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
  9. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
  10. Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
  11. Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
  12. Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  13. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
  14. Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
  15. Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
  16. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  17. Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
  18. Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
  19. Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
  20. Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
  21. Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
  22. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
  23. Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
  24. Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
  25. Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
  26. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
  27. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  28. Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved