Messung des Zusammenflusses von iPSCs mit einem automatisierten Bildgebungssystem.

Zusammenfassung

Das Ziel des Protokolls ist es, verschiedene extrazelluläre Matrix-Beschichtungsbedingungen (ECM) zu vergleichen, um zu beurteilen, wie sich eine differentielle Beschichtung auf die Wachstumsrate von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) auswirkt. Insbesondere wollen wir Bedingungen schaffen, um ein optimales Wachstum von iPSC-Kulturen zu erreichen.

Zusammenfassung

Diese Studie konzentriert sich auf das Verständnis, wie wachsende iPS-Zellen auf verschiedenen ECM-Beschichtungssubstraten die Zellkonfluenz beeinflussen können. Es wurde ein Protokoll zur Bewertung der iPSC-Konfluenz in Echtzeit erstellt, ohne dass Zellen in Einzelzellsuspension gezählt werden müssen, um Wachstumsstörungen zu vermeiden. Ein High-Content-Bildanalysesystem wurde verwendet, um die iPCS-Konfluenz auf 4 verschiedenen ECMs im Laufe der Zeit automatisiert zu bewerten. Verschiedene Analyseeinstellungen wurden verwendet, um die Zellkonfluenz von adhärenten iPS-Zellen zu beurteilen, und es wurde nur ein geringer Unterschied (nach 24 und 48 Stunden mit Laminin) beobachtet, ob eine 60-, 80- oder 100%-Maske angewendet wurde. Wir zeigen auch, dass Laminin im Vergleich zu Matrigel, Vitronektin und Fibronektin zum besten Zusammenfluss führt.

Einleitung

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) werden aus somatischen Zellen gewonnen und können in verschiedene Zelltypen differenziert werden. Sie werden oft als System zur Modellierung der Krankheitspathogenese oder zur Durchführung von Medikamentenscreenings eingesetzt und bieten auch das Potenzial, im Kontext der personalisierten Medizin eingesetzt zu werden. Da iPSCs ein großes Potenzial haben, ist es wichtig, sie für den Einsatz als zuverlässiges Modellsystem vollständig zu charakterisieren. Wir haben bereits gezeigt, wie wichtig es ist, iPS-Zellen in einer hypoxischen Umgebung zu züchten, da diese Zellen auf Glykolyse angewiesen sind und eine aerobe Umgebung ein Redoxungleichgewicht verursachen kann¹. iPSCs sind auch anfällig für andere Kulturbedingungen, insbesondere die extrazelluläre Umgebung. Die Optimierung der Kulturbedingungen ist ein Schlüsselthema, um sie gesund zu halten und zu vermehren. Eine gesunde iPSC-Kultur führt zu gesunden, differenzierten Zellen, die im Allgemeinen der Endpunkt des Modells sind, das zum Verständnis molekularer, zellulärer und funktioneller Merkmale spezifischer menschlicher Störungen oder zellulärer Prozesse verwendet wird.

In dieser Studie wurde ein einfaches Protokoll verwendet, um den Zusammenfluss von iPSCs unter Verwendung verschiedener Beschichtungsbedingungen in separaten Vertiefungen zu testen. iPSCs benötigen eine Feederschicht von murinen embryonalen Fibroblasten (MEF), um richtig zu binden, aber die Koexistenz von iPSCs und MEF macht es schwierig, Analysen wie RNA- oder Proteinextraktion durchzuführen, da zwei Zellpopulationen vorhanden sind. Um die Feederschicht zu vermeiden, wurden verschiedene Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) verwendet, um die natürliche Zellnische nachzubilden und eine feederfreie iPSC-Kultur zu haben. Insbesondere ist Matrigel ein lösliches Basalmembranpräparat, das aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maussarkom extrahiert wird und mit extrazellulären Matrixproteinen (d. h. Laminin, Kollagen IV, Heparansulfat-Proteoglykanen, Entactin/Nidogen und Wachstumsfaktoren⁾ angereichert ^ist2,3. Die anderen verwendeten Beschichtungsbedingungen sind stattdessen gereinigte Proteine mit bekannter Relevanz für den Aufbau der ECMs: Laminin-521 ist dafür bekannt, von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in der inneren Zellmasse des Embryos sezerniert zu werden, und es ist eines der häufigsten Lamininine im Körper nach der Geburt 4,5,6,7,8,9^{, 10,11}; vitronectin ist eine xenofreie Zellkulturmatrix, von der bekannt ist, dass sie das Wachstum und die Differenzierung von hPSC 12,13,14,15,16 unterstützt; Fibronektin ist ein ECM-Protein, das für die Entwicklung von Wirbeltieren und die Anheftung und Erhaltung embryonaler Stammzellen in einem pluripotenten Zustand wichtig ist 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Da unterschiedliche Beschichtungsbedingungen zur Verfügung stehen, vergleichen wir sie hinsichtlich ihrer Wirkung auf den Zusammenfluss von iPSCs.

Protokoll

1. Beschichtung von 96 Well-Platten

HINWEIS: Verschiedene Beschichtungen wurden in derselben Platte, aber separaten Vertiefungen getestet (siehe Zusatzdatei).

1. Verdünnen Sie das Matrigel 1:100 in DMEM. 100 μL pro Vertiefung in die 96 Wellplatten geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie anschließend die Lösung und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 100 μL DMEM.
2. Verdünnen Sie Laminin (20 μg/ml, LN-521) in PBS (mit Calcium und Magnesium). 100 μL in die Vertiefung geben und bei 4 °C über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag führen Sie zwei Wäschen mit DMEM durch, bevor Sie die Zellen säen.
3. Verdünntes Invitronektin (10 μg/ml) in Verdünnungspuffer. 100 μL pro Vertiefung in die 96-Well-Platte geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS (ohne Kalzium und Magnesium), bevor Sie die Zellen plattieren.
4. HU-Fibronektin (30 μg/ml) in_ddH2Overdünnen. 100 μL in die Vertiefungen geben und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend waschen Sie die Vertiefungen mit dem Medium, bevor Sie die Zellen säen.

2. Aufrechterhaltung von iPSC in Kultur

HINWEIS: iPSCs wurden kommerziell erworben. Die iPS-Zellen wurden aus gesunden menschlichen Fibroblasten gewonnen und mittels episomaler Technologie umprogrammiert.

1. Aus dem -80 °C Gefrierschrank oder flüssigem Stickstoff die kryokonservierten iPSCs in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Reinigen Sie die Durchstechflasche mit den Zellen mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in die biologische Sicherheitswerkbank bringen.
2. Geben Sie die Zellsuspension in 5 mL vorgewärmtes Zellkulturmedium (z. B. mTeSR1) Tropfen für Tropfen mit einer 1000 μL Pipette in einem 15 ml sterilen konischen Röhrchen.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 304 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
4. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 ml Zellkulturmedium.
5. Die Zellsuspension wird in zwei Vertiefungen der 6 Wellplatten (10⁵ iPSCs pro 6-Well-Zellkulturschale) gegeben, wo die embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus zuvor plattiert wurden. Seed MEFs zwei Tage vor der Beschichtung von iPSCs mit einer Dichte von 2,4 x 10⁴/cm² in DMEM (enthält 10% Fetal Bovine Serum, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin).
6. Nach der Aussaat ergänzen Sie die Zellmedien mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632.
7. Züchten Sie die iPSCs auf MEFs für die ersten 4-5 Wochen und dann in dosierfreiem Zustand (MEF-freier Zustand), wobei eine der interessierenden Beschichtungen (siehe Schritt 1 und Tabelle 1) in mTeSR1 verwendet wird.
8. Wenn die iPSCs zu 70-80% konfluent sind, Durchgang 1:4 mit 0,5 mM EDTA-Behandlung für 3-5 min bei RT. Fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA für eine 6-Well-Platte (oder proportionale Mengen für andere Arten von Platten) hinzu. Überführung in neue Bohrlöcher unter feederfreien Bedingungen und Inkubation bei 37 °C, 5% CO2, 20%_O2.
9. Wechseln Sie die Medien täglich mit frischem mTeSR1 und teilen Sie die Zellen alle 2 Tage.

3. Charakterisierung der Zellkonfluenz

1. Verwenden Sie 96 Well-Platten für die Experimente.
2. Aussaat von 10.000 Zellen pro Vertiefung nach mindestens 1 Monat Kultivierung in feederfreiem Zustand, um sicher zu sein, dass die MEFs nicht passiert wurden. Verwenden Sie Einweg-Zählobjektträger, um die Zellen mit dem Lichtmikroskop zu zählen.
3. Führen Sie die Experimente in dreifacher Ausführung durch. Testen Sie daher jede Aussaatbedingung in drei Vertiefungen.
4. Führen Sie eine automatisierte Bildaufnahme ab Tag 1 nach der Aussaat mit einem Zytometer im Hellfeldmodus durch. Führen Sie eine automatisierte Bildaufnahme alle 24 Stunden für 5 Tage durch. Ausführliche Informationen zu den experimentellen Parametern finden Sie in der Zusatzdatei.
5. Verwenden Sie Autokontrast und Autobelichtung, um Zellen besser sichtbar zu machen.
6. Legen Sie die Analyseeinstellung (siehe Zusatzdatei) für die Konfluenzanalyse so fest, dass eine Maske von 60%, 80% und 100% pro Vertiefung angewendet wird, um die Fokusänderungen aufgrund der Lichtbrechung am Rand der Vertiefungen zu bewerten. Verwenden Sie die oben erwähnte andere Maskenanalyseeinstellung, um den Zellzusammenfluss zu jedem Zeitpunkt zu analysieren.

4. Statistische Analysen

1. Geben Sie quantitative Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an.
2. Um die Gesamtunterschiede der verschiedenen Beschichtungsbedingungen zu vergleichen, erhalten Sie Daten mit denselben Proben und führen Sie den Paired-Sample-t-Test des Studenten durch. P-Werte kleiner als 0,05 gelten als statistisch signifikant, und alle gemeldeten p-Werte sind zweiseitig.

5. Charakterisierung der Mikrofilamente des Zytoskeletts

1. Fixieren Sie Zellen mit 4% Paraformaldehyd (4% PFA) in PBS für 10 min bei RT, gefolgt von zwei Wäschen in PBS (10 min insgesamt).
2. 100 μL Blockierlösung (bestehend aus 5% BSA, 0,1% Triton in PBS) für 1 h RT in jede Vertiefung geben.
3. Entfernen Sie die Blockierlösung und waschen Sie die Proben zweimal mit PBS für 10 min.
4. 100 μL der Phalloidin-konjugierten Arbeitslösung pro Probe zugeben und 1 h bei RT inkubieren.
5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS (10 min bei RT).
6. Färbekerne mit Hoechst 33342 verdünnt 1:10000 in PBS für 10 min bei RT.
7. Entfernen Sie die Hoechst-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für jeweils 10 Minuten.
8. Die Probe mit_H2Owaschen und unter einer chemischen Haube trocknen lassen.
9. Fügen Sie 100 μL Montagemedien (z. B. PBS: Glycerin, 1: 1) hinzu, um die Zellen abzudecken und die Fluoreszenz der Proben zu erhalten.
10. Beobachten Sie die Zelle bei Ex/Em 493/517 nm auf einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, das mit einer Weißlichtlaserquelle (WLL) und einem 405-nm-Diodenlaser ausgestattet ist. Nehmen Sie sequenzielle konfokale Bilder mit einem HC PLAPO 40x Ölimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie die gleiche Laserleistung, Strahlteiler, Filtereinstellungen, Pinhole-Durchmesser und Scan-Modus für alle untersuchten Proben.

Ergebnisse

In dieser Studie untersuchten wir den Zusammenfluss von iPSCs, wenn er unter verschiedenen Beschichtungsbedingungen gezüchtet wurde. Mit einem Zytometer konnten wir in 5 Tagen leicht aussagekräftige Ergebnisse in dreifacher Ausfertigung erhalten. Da iPSCs kaum an Kunststoffgefäßen haften und eine Beschichtung notwendig ist, um ihre Proliferation zu unterstützen, haben wir uns entschieden, den Zusammenfluss von humanen iPSCs zu überwachen, da dies auf die Gesundheit der Zellkultur hinweist und ihr Differenzierungspo...

Diskussion

Die Verwendung von iPS-Zellen für die Krankheitsmodellierung und das zukünftige Arzneimittelscreening zusammen mit ihrer möglichen Anwendung in der Präzisionsmedizin macht sie zu einer Technologie von großer Relevanz, und aus diesem Grund glauben wir, dass es notwendig ist, die In-vitro-Kultivierungsbedingungen klar zu verstehen, die der physiologischen Situation embryonaler Stammzellen besser ähneln. In diesem Zusammenhang haben wir verschiedene ECM-Beschichtungen mit Wildtyp-iPSCs getestet, um die Bedingungen zu ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4488	Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	352097	Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+)	Thermofisher	14040133	Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+)	Euroclone	ECB4004L	Medium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4487	Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom	Greiner Bio One	655090	Support
Cell culture plate, 6 well	Costar	3516	Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)	Sigma	D5671	Medium
EDTA	Sigma	ED4SS-500g	Reagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit	Invitrogen	A15960	Reagent
FAST - READ 102	Biosigma	BVS100	Tool
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270106	Medium
Fibronectin	Merck	FC010	Coating
Glycerol	Sigma	G5516	Reagent
H2O		MILLIQ
Hoechst	Thermofisher	33342	Reagent
Laminin 521	Stem Cell Technologies	77003	Coating
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	LS25030081	Reagent
Matrigel	Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	354277	Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF)	Life Technologies	A24903	Coating
MTESR1 Medium	Stem Cell Technologies	85851	Medium
MTESR1 Supplement	Stem Cell Technologies	85852	Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Reagent
Phalloidin	Sigma	P1951	Reagent
Vitronectin	Stem Cell Technologies	7180	Coating
Y-27632	Sigma	Y0503	Reagent