Medición de la confluencia de iPSCs utilizando un sistema automatizado de imágenes.

Resumen

El objetivo del protocolo es comparar diferentes condiciones de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) para evaluar cómo el recubrimiento diferencial afecta la tasa de crecimiento de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En particular, nuestro objetivo es establecer las condiciones para obtener un crecimiento óptimo de los cultivos iPSC.

Resumen

Este estudio se centra en comprender cómo el cultivo de iPSC en diferentes sustratos de recubrimiento ECM puede afectar la confluencia celular. Se ha establecido un protocolo para evaluar la confluencia de iPSC en tiempo real sin necesidad de contar células en suspensión unicelular para evitar cualquier perturbación del crecimiento. Se utilizó un sistema de análisis de imágenes de alto contenido para evaluar la confluencia de iPCS en 4 ECM diferentes a lo largo del tiempo de manera automatizada. Se utilizaron diferentes entornos de análisis para evaluar la confluencia celular de las iPSCs adherentes y solo se observó una ligera diferencia (a las 24 y 48 horas con laminina) si se aplicó una máscara al 60, 80 o 100%. También mostramos que la laminina conduce a la mejor confluencia en comparación con Matrigel, vitronectina y fibronectina.

Introducción

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se obtienen de células somáticas y se pueden diferenciar en diferentes tipos de células. A menudo se utilizan como un sistema para modelar la patogénesis de la enfermedad o realizar la detección de drogas, y también ofrecen el potencial de ser utilizados en el contexto de la medicina personalizada. Dado que las iPSC tienen un gran potencial, es importante caracterizarlas completamente para su uso como un sistema modelo confiable. Anteriormente mostramos la importancia de cultivar iPSCs en un ambiente hipóxico, ya que estas células dependen de la glucólisis y un ambiente aeróbico puede causar desequilibrio redox¹. Las iPSC también son vulnerables a otras condiciones de cultivo, particularmente al entorno extracelular. La optimización de las condiciones de cultivo es un tema clave para mantenerlas sanas y proliferantes. Un cultivo saludable de iPSC conducirá a células sanas diferenciadas que generalmente son el punto final del modelo utilizado para comprender las características moleculares, celulares y funcionales de trastornos humanos específicos o procesos celulares.

En este estudio, se ha utilizado un protocolo simple para probar la confluencia de iPSCs utilizando diferentes condiciones de recubrimiento en pozos separados. Las iPSC requieren una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) para adherirse correctamente, pero la coexistencia de iPSCs y MEF dificulta la realización de análisis como ARN o extracción de proteínas, ya que hay dos poblaciones de células. Para evitar la capa de alimentación, se han utilizado diferentes proteínas pertenecientes a la matriz extracelular (ECM) para recrear el nicho celular natural y tener un cultivo de iPSC libre de alimentador. En particular, Matrigel es una preparación solubilizada de membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que está enriquecida en proteínas de la matriz extracelular (es decir, laminina, colágeno IV, proteoglicanos de heparán sulfato, entactina/nidógeno y factores de crecimiento)^2,3. Las otras condiciones de recubrimiento utilizadas son, en cambio, proteínas purificadas con relevancia conocida en la construcción de las ECM: se sabe que la laminina-521 es secretada por células madre pluripotentes humanas (hPSC) en la masa celular interna del embrión y es una de las lamininas más comunes en el cuerpo después del nacimiento 4,5,6,7,8,9^{, 10,11}; la vitronectina es una matriz de cultivo celular libre de xeno-conocida por apoyar el crecimiento y la diferenciación de hPSC 12,13,14,15,16; La fibronectina es una proteína ECM importante para el desarrollo de vertebrados y la unión y mantenimiento de células madre embrionarias en estado pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Dado que existen diferentes condiciones de recubrimiento, las comparamos en términos de su efecto sobre la confluencia de las iPSC.

Protocolo

1. Recubrimiento de placas de 96 pozos

NOTA: Se probaron diferentes recubrimientos en la misma placa pero en pocillos separados (consulte el Archivo suplementario).

1. Diluir el Matrigel 1:100 en DMEM. Añadir 100 μL por pocillo a las placas de 96 pocillos e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Después de esto, retire la solución y lave los pocillos con 100 μL de DMEM dos veces.
2. Laminina diluida (20 μg/mL, LN-521) en PBS (con calcio y magnesio). Añadir 100 μL al pozo e incubar a 4 °C durante la noche. Al día siguiente realizar dos lavados con DMEM antes de sembrar las células.
3. Vitronectina diluida (10 μg/mL) en tampón de dilución. Agregue 100 μL por pocillo a la placa de 96 pocillos e incube durante 1 hora a temperatura ambiente. Lave los pocillos con PBS (sin calcio y magnesio) antes de colocar las células.
4. Diluir HU-fibronectina (30 μg/mL) en ddH₂O. Añadir 100 μL a los pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de esto, lave los pocillos con el medio antes de sembrar las células.

2. Mantenimiento de iPSCs en cultivo

NOTA: Las iPSC se compraron comercialmente. Las iPSCs se derivaron de fibroblastos humanos sanos y se reprogramaron utilizando tecnología episomal.

1. Desde el congelador de -80 °C o nitrógeno líquido, descongelar las iPSC criopreservadas en un baño maría a 37 °C. Limpie el vial que contiene las células con etanol al 70% antes de moverlo al gabinete de seguridad biológica.
2. Agregue la suspensión celular a 5 ml de medios de cultivo celular precalentados (p. ej., mTeSR1) gota a gota con una pipeta de 1000 μL en un tubo cónico estéril de 15 ml.
3. Centrifugar las células a 304 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
4. Retire el medio y vuelva a suspender el pellet celular en 4 ml de medio de cultivo celular.
5. Colocar la suspensión celular en dos pocillos de las placas de 6 pocillos (10⁵ iPSCs por placa de cultivo celular de 6 pocillos), donde los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) han sido chapados previamente. Semillas MEFs dos días antes de emplatar iPSCs a una densidad de 2.4 x 10⁴/cm² en DMEM (que contiene 10% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina).
6. Después de la siembra, complemente los medios celulares con 10 μM del inhibidor de ROCK Y-27632.
7. Cultive las iPSC en MEF durante las primeras 4-5 semanas y luego en condiciones libres de alimentador (condición libre de MEF), utilizando uno de los recubrimientos de interés (consulte el paso 1 y la Tabla 1) en mTeSR1.
8. Cuando las iPSCs son 70-80% confluentes, paso 1:4 usando 0,5 mM de tratamiento EDTA durante 3-5 min a RT. Añadir 1 mL de 0,5 mM EDTA para una placa de 6 pocillos (o cantidades proporcionales para otros tipos de placas). Transferir a nuevos pozos en condiciones libres de alimentadores e incubar a 37 °C, 5% CO2, 20%_O2.
9. Cambie el medio con mTeSR1 nuevo todos los días y divida las celdas cada 2 días.

3. Caracterización de la confluencia celular

1. Use 96 placas de pocillos para los experimentos.
2. Sembrar 10,000 células por pocillo después de al menos 1 mes de cultivo en condiciones libres de alimentador para asegurarse de que los MEF no fueron pasados. Use portaobjetos de conteo desechables para contar las células con el microscopio óptico.
3. Realizar los experimentos por triplicado. Por lo tanto, pruebe cada condición de siembra en tres pozos.
4. Realice la adquisición automatizada de imágenes desde el día 1 después de la siembra utilizando un citómetro en modo de campo claro. Realice la adquisición automatizada de imágenes cada 24 h durante 5 días. Para obtener información detallada sobre los parámetros experimentales, consulte el Archivo complementario.
5. Utilice el contraste automático y la exposición automática para visualizar mejor las células.
6. Establezca la configuración de análisis (consulte Archivo suplementario) para el análisis de confluencia para aplicar una máscara de 60%, 80% y 100% por pozo, con el fin de evaluar los cambios de enfoque debidos a la refracción de la luz en el borde de los pozos. Utilice la configuración de análisis de máscara diferente mencionada anteriormente para analizar la confluencia celular en cada punto de tiempo.

4. Análisis estadísticos

1. Reporte los resultados cuantitativos como medias ± error estándar de la media (SEM).
2. Para comparar las diferencias generales de las diferentes condiciones de recubrimiento, obtenga datos utilizando las mismas muestras y realice la prueba t de muestra pareada de Student. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos, y todos los valores de p informados son bilaterales.

5. Caracterización de los microfilamentos citoesqueléticos

1. Fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA al 4%) en PBS durante 10 min en RT, seguido de dos lavados en PBS (10 min en total).
2. Añadir 100 μL de solución de bloqueo (compuesta por 5% BSA, 0,1% Triton en PBS) a cada pocillo durante 1 h a RT.
3. Retire la solución de bloqueo y lave las muestras dos veces con PBS durante 10 minutos.
4. Añadir 100 μL de la solución de trabajo conjugada con faloidina por muestra e incubar durante 1 h a RT.
5. Lave las células dos veces con PBS (10 min en RT).
6. Núcleos de tinción con Hoechst 33342 diluidos 1:10000 en PBS durante 10 min a RT.
7. Retire la solución de Hoechst y lave las células dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez.
8. Lave la muestra con_H2Oy deje secar bajo una campana química.
9. Añadir 100 μL de medios de montaje (es decir, PBS:glicerol, 1:1) para cubrir las células y preservar la fluorescencia de las muestras.
10. Observe la celda a Ex/Em 493/517 nm en un microscopio confocal de barrido láser equipado con una fuente láser de luz blanca (WLL) y un láser de diodo de 405 nm. Adquiera imágenes confocales secuenciales utilizando un objetivo de inmersión en aceite HC PLAPO 40x. Utilice la misma potencia láser, divisores de haz, ajustes de filtro, diámetros de agujero de alfiler y modo de escaneo para todas las muestras examinadas.

Resultados

En este estudio, investigamos la confluencia de iPSCs cuando se cultivan en diferentes condiciones de recubrimiento. Usando un citómetro, pudimos obtener resultados fácilmente informativos en triplicados en 5 días. Dado que las iPSC apenas se adhieren a recipientes de plástico y es necesario un recubrimiento para apoyar su proliferación, decidimos monitorear la confluencia de iPSCs humanas, ya que es indicativo de la salud del cultivo celular y puede reflejar su potencial de diferenciación. Después de la expansió...

Discusión

El uso de iPSCs para el modelado de enfermedades y el futuro cribado de fármacos junto con su posible aplicación en medicina de precisión lo convierte en una tecnología de gran relevancia y por esta razón creemos que es necesario entender claramente la condición de cultivo in vitro que mejor se asemeja a la situación fisiológica de las células madre embrionarias. En este contexto, probamos diferentes recubrimientos ECM utilizando iPSC de tipo salvaje para comprender las condiciones que permiten que las células ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4488	Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	352097	Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+)	Thermofisher	14040133	Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+)	Euroclone	ECB4004L	Medium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4487	Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom	Greiner Bio One	655090	Support
Cell culture plate, 6 well	Costar	3516	Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)	Sigma	D5671	Medium
EDTA	Sigma	ED4SS-500g	Reagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit	Invitrogen	A15960	Reagent
FAST - READ 102	Biosigma	BVS100	Tool
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270106	Medium
Fibronectin	Merck	FC010	Coating
Glycerol	Sigma	G5516	Reagent
H2O		MILLIQ
Hoechst	Thermofisher	33342	Reagent
Laminin 521	Stem Cell Technologies	77003	Coating
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	LS25030081	Reagent
Matrigel	Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	354277	Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF)	Life Technologies	A24903	Coating
MTESR1 Medium	Stem Cell Technologies	85851	Medium
MTESR1 Supplement	Stem Cell Technologies	85852	Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Reagent
Phalloidin	Sigma	P1951	Reagent
Vitronectin	Stem Cell Technologies	7180	Coating
Y-27632	Sigma	Y0503	Reagent