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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo del protocollo è confrontare diverse condizioni di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) per valutare in che modo il rivestimento differenziale influisce sul tasso di crescita delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). In particolare, miriamo a creare le condizioni per ottenere una crescita ottimale delle colture iPSC.

Abstract

Questo studio si concentra sulla comprensione di come la crescita di iPSC su diversi substrati di rivestimento ECM può influenzare la confluenza cellulare. È stato stabilito un protocollo per valutare la confluenza di iPSC in tempo reale senza la necessità di contare le cellule in sospensione monocellulare per evitare qualsiasi perturbazione della crescita. Un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto è stato utilizzato per valutare la confluenza di iPCS su 4 diversi ECM nel tempo in modo automatizzato. Sono state utilizzate diverse impostazioni di analisi per valutare la confluenza cellulare di iPSC aderenti e solo una leggera differenza (a 24 e 48 ore con laminina) è stata osservata se è stata applicata una maschera al 60, 80 o 100%. Mostriamo anche che la laminina porta alla migliore confluenza rispetto a Matrigel, vitronectin e fibronectina.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono ottenute da cellule somatiche e possono essere differenziate in diversi tipi di cellule. Sono spesso utilizzati come sistema per modellare la patogenesi della malattia o eseguire lo screening dei farmaci e offrono anche il potenziale per essere utilizzati nel contesto della medicina personalizzata. Poiché le iPSC hanno un grande potenziale, è importante caratterizzarle completamente per l'uso come sistema modello affidabile. In precedenza abbiamo dimostrato l'importanza della crescita di iPSC in un ambiente ipossico poiché queste cellule si basano sulla glicolisi e un ambiente aerobico può causare uno squilibrio redox1. Le iPSC sono anche vulnerabili ad altre condizioni di coltura, in particolare all'ambiente extracellulare. L'ottimizzazione delle condizioni colturali è una questione chiave per mantenerle sane e proliferanti. Una coltura iPSC sana porterà a cellule differenziate sane che generalmente sono l'endpoint del modello utilizzato per comprendere le caratteristiche molecolari, cellulari e funzionali di specifici disturbi umani o processi cellulari.

In questo studio, è stato utilizzato un semplice protocollo per testare la confluenza di iPSC utilizzando diverse condizioni di rivestimento in pozzetti separati. Le iPSC richiedono uno strato di alimentazione di fibroblasti embrionali murini (MEF) per attaccarsi correttamente, ma la coesistenza di iPSC e MEF rende difficile eseguire analisi come l'estrazione di RNA o proteine poiché sono presenti due popolazioni di cellule. Al fine di evitare lo strato di alimentazione, diverse proteine appartenenti alla matrice extracellulare (ECM) sono state utilizzate per ricreare la nicchia cellulare naturale e per avere una coltura di iPSC priva di alimentatore. In particolare, Matrigel è un preparato di membrana basale solubilizzato estratto dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), arricchito in proteine della matrice extracellulare (laminina, collagene IV, eparan solfato proteoglicani, entactin/nidogeno e fattori di crescita)2,3. Le altre condizioni di rivestimento utilizzate sono invece proteine purificate con rilevanza nota nella costruzione delle ECM: la laminina-521 è nota per essere secreta dalle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nella massa cellulare interna dell'embrione ed è una delle laminine più comuni nell'organismo dopo la nascita 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectina è una matrice di coltura cellulare xeno-free nota per supportare la crescita e la differenziazione di hPSC 12,13,14,15,16; la fibronectina è una proteina ECM importante per lo sviluppo dei vertebrati e l'attaccamento e il mantenimento delle cellule staminali embrionali in uno stato pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Poiché sono disponibili diverse condizioni di rivestimento, le confrontiamo in termini di effetto sulla confluenza delle iPSC.

Protocollo

1. Rivestimento di 96 piastre di pozzetto

NOTA: Diversi rivestimenti sono stati testati nella stessa piastra ma pozzetti separati (vedere File supplementare).

  1. Diluire il Matrigel 1:100 in DMEM. Aggiungere 100 μL per pozzetto alle piastre da 96 pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la soluzione e lavare i pozzetti con 100 μL di DMEM due volte.
  2. Laminina diluita (20 μg/mL, LN-521) in PBS (con calcio e magnesio). Aggiungere 100 μL nel pozzetto e incubare a 4 °C durante la notte. Il giorno seguente eseguire due lavaggi con DMEM prima di seminare le cellule.
  3. Vitronectina diluita (10 μg/ml) in tampone di diluizione. Aggiungere 100 μL per pozzetto alla piastra a 96 pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i pozzetti con PBS (senza calcio e magnesio) prima di placcare le cellule.
  4. Diluire HU-Fibronectina (30 μg/ml) in ddH2O. Aggiungere 100 μL ai pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Successivamente, lavare i pozzetti con il mezzo prima di seminare le cellule.

2. Mantenimento delle iPSC in coltura

NOTA: le iPSC sono state acquistate commercialmente. Le iPSC sono state derivate da fibroblasti umani sani e riprogrammate utilizzando la tecnologia episomiale.

  1. Dal congelatore a -80 °C o dall'azoto liquido, scongelare le iPSC crioconservate in un bagno d'acqua a 37 °C. Pulire il flaconcino contenente le cellule con etanolo al 70% prima di spostarlo nell'armadio di sicurezza biologica.
  2. Aggiungere la sospensione cellulare a 5 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato (ad es. mTeSR1) goccia a goccia con una pipetta da 1000 μL in un tubo conico sterile da 15 ml.
  3. Centrifugare le celle a 304 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  4. Rimuovere il terreno e risospendere il pellet cellulare in 4 ml di terreno di coltura cellulare.
  5. Placcare la sospensione cellulare in due pozzetti delle 6 piastre del pozzetto (105 iPSC per piatto di coltura cellulare a 6 pozzetti), dove i fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati placcati in precedenza. MEF di semi due giorni prima della placcatura delle iPSC ad una densità di 2,4 x 104/cm2 in DMEM (contenente il 10% di siero bovino fetale, l'1% di L-glutammina e l'1% di penicillina-streptomicina).
  6. Dopo la semina, integrare il terreno cellulare con 10 μM di inibitore ROCK Y-27632.
  7. Far crescere le iPSC sui MEF per le prime 4-5 settimane e poi in condizioni di feeder free (MEF free condition), utilizzando uno dei rivestimenti di interesse (vedi step 1 e Tabella 1) in mTeSR1.
  8. Quando le iPSC sono confluenti al 70-80%, passare 1:4 usando il trattamento EDTA da 0,5 mM per 3-5 minuti a RT. Aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA per una piastra a 6 pozzetti (o quantità proporzionali per altri tipi di piastre). Trasferimento in nuovi pozzi in condizioni di assenza di alimentazione e incubazione a 37 °C, 5% CO2, 20% O2.
  9. Cambiare il supporto con mTeSR1 fresco ogni giorno e dividere le celle ogni 2 giorni.

3. Caratterizzazione della confluenza cellulare

  1. Utilizzare 96 piastre per pozzetti per gli esperimenti.
  2. Seminare 10.000 cellule per pozzetto dopo almeno 1 mese di coltura in condizioni di feeder free per essere sicuri che i MEF non siano stati passati. Utilizzare vetrini di conteggio usa e getta per contare le cellule con il microscopio ottico.
  3. Eseguire gli esperimenti in triplice copia. Pertanto, testare ogni condizione di semina in tre pozzi.
  4. Eseguire l'acquisizione automatica delle immagini dal giorno 1 successivo alla semina utilizzando un citometro in modalità campo chiaro. Esegui l'acquisizione automatica delle immagini ogni 24 ore per 5 giorni. Per informazioni dettagliate sui parametri sperimentali, fare riferimento al file supplementare.
  5. Usa il contrasto automatico e l'esposizione automatica per visualizzare meglio le celle.
  6. Impostare l'impostazione di analisi (vedere File supplementare) per l'analisi di confluenza per applicare una maschera del 60%, 80% e 100% per pozzetto, al fine di valutare i cambiamenti di messa a fuoco dovuti alla rifrazione della luce al bordo dei pozzi. Utilizzare la diversa impostazione di analisi della maschera menzionata sopra per analizzare la confluenza della cella in ogni punto temporale.

4. Analisi statistiche

  1. Riportare i risultati quantitativi come mezzi ± errore standard della media (SEM).
  2. Per confrontare le differenze complessive delle diverse condizioni di rivestimento, ottenere dati utilizzando gli stessi campioni ed eseguire il test t del campione accoppiato dello studente. I valori di p inferiori a 0,05 sono considerati statisticamente significativi e tutti i valori p riportati sono a due facce.

5. Caratterizzazione dei microfilamenti citoscheletrici

  1. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (4% PFA) in PBS per 10 minuti a RT, seguito da due lavaggi in PBS (10 minuti totali).
  2. Aggiungere 100 μL di soluzione bloccante (composta da 5% BSA, 0,1% Triton in PBS) a ciascun pozzetto per 1 ora a RT.
  3. Rimuovere la soluzione bloccante e lavare i campioni due volte con PBS per 10 minuti.
  4. Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro coniugata alla falloidina per campione e incubare per 1 ora a RT.
  5. Lavare le celle due volte con PBS (10 minuti a RT).
  6. Nuclei di colorazione con Hoechst 33342 diluito 1:10000 in PBS per 10 minuti a RT.
  7. Rimuovere la soluzione di Hoechst e lavare le celle due volte con PBS per 10 minuti ogni volta.
  8. Lavare il campione con H2O e lasciare asciugare sotto un cappuccio chimico.
  9. Aggiungere 100 μL di mezzi di montaggio (cioè PBS:glicerolo, 1:1) per coprire le cellule e preservare la fluorescenza dei campioni.
  10. Osservare la cella a Ex/Em 493/517 nm su un microscopio confocale a scansione laser dotato di una sorgente laser a luce bianca (WLL) e di un laser a diodi da 405 nm. Acquisisci immagini confocali sequenziali utilizzando un obiettivo HC PLAPO 40x ad immersione in olio. Utilizzare la stessa potenza laser, gli stessi beam splitter, le impostazioni del filtro, i diametri stenopeici e la modalità di scansione per tutti i campioni esaminati.

Risultati

In questo studio, abbiamo studiato la confluenza delle iPSC quando coltivate in diverse condizioni di rivestimento. Utilizzando un citometro, siamo stati in grado di ottenere risultati prontamente informativi in triplice copia in 5 giorni. Poiché le iPSC difficilmente si attaccano ai vasi di plastica ed è necessario un rivestimento per supportare la loro proliferazione, abbiamo deciso di monitorare la confluenza delle iPSC umane in quanto è indicativa della salute della coltura cellulare e potrebbe riflettersi sul lor...

Discussione

L'utilizzo delle iPSC per la modellizzazione delle malattie e il futuro screening farmacologico insieme alla loro possibile applicazione in medicina di precisione la rende una tecnologia di grande rilevanza e per questo motivo riteniamo che sia necessario comprendere chiaramente la condizione di coltura in vitro che meglio assomiglia alla situazione fisiologica delle cellule staminali embrionali. In questo contesto, abbiamo testato diversi rivestimenti ECM utilizzando iPSC wild type al fine di comprendere le condizioni c...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Bambino Gesù e Ricerca Corrente a C.C.  Si ringraziano il Dott. Enrico Bertini (Dipartimento di Neuroscienze, Unità di Malattie Neuromuscolari e Neurodegenerative, Laboratorio di Medicina Molecolare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), la Dott.ssa Stefania Petrini (Centro di Microscopia Confocale, Laboratori di Ricerca, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale di Ricerca Pediatrica Bambino Gesù) e Roberta Ferretti (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù) per le discussioni scientifiche e l'assistenza tecnica. Maria Vinci è destinataria di una borsa di studio "Children with Cancer UK".

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, SterileCorning4488Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubesFalcon352097Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+)Thermofisher14040133Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+)EurocloneECB4004LMedium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, SterileCorning4487Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-BottomGreiner Bio One655090Support
Cell culture plate, 6 wellCostar3516Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)SigmaD5671Medium
EDTASigmaED4SS-500gReagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming KitInvitrogenA15960Reagent
FAST - READ 102BiosigmaBVS100Tool
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270106Medium
FibronectinMerckFC010Coating
GlycerolSigmaG5516Reagent
H2OMILLIQ
HoechstThermofisher33342Reagent
Laminin 521Stem Cell Technologies77003Coating
L-Glutamine (200 mM)GibcoLS25030081Reagent
MatrigelCorning Matrigel hESC-Qualified Matrix354277Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF)Life TechnologiesA24903Coating
MTESR1 MediumStem Cell Technologies85851Medium
MTESR1 SupplementStem Cell Technologies85852Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122Reagent
PhalloidinSigmaP1951Reagent
VitronectinStem Cell Technologies7180Coating
Y-27632SigmaY0503Reagent

Riferimenti

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