使用自动成像系统测量 iPSC 的汇合度。

摘要

该方案的目标是比较不同的细胞外基质（ECM）包被条件，以评估差异涂层如何影响诱导多能干细胞（iPSC）的生长速率。特别是，我们的目标是创造条件以获得iPSC培养物的最佳生长。

摘要

本研究的重点是了解在不同ECM包衣底物上生长iPSC如何影响细胞汇合。已经建立了实时评估iPSC汇合的协议，而无需对单细胞悬液中的细胞进行计数，以避免任何生长扰动。使用高内涵图像分析系统以自动方式评估 4 种不同 ECM 上的 iPCS 汇合度。使用不同的分析设置来评估贴壁iPSC的细胞汇合度，并且仅观察到使用60%、80%或100%面膜的微小差异（在层粘连蛋白24和48小时）。我们还表明，与基质胶，玻连蛋白和纤连蛋白相比，层粘连蛋白导致最佳汇合。

引言

诱导多能干细胞（iPSC）是从体细胞中获得的，可以分化成不同的细胞类型。它们通常被用作模拟疾病发病机制或进行药物筛选的系统，并且还提供了用于个性化医疗的潜力。由于iPSCs具有巨大的潜力，因此充分表征它们以用作可靠的模型系统非常重要。我们之前展示了在缺氧环境中生长iPSCs的重要性，因为这些细胞依赖于糖酵解，而有氧环境会导致氧化还原失衡¹。iPSCs也容易受到其他培养条件的影响，特别是细胞外环境。优化培养条件是保持其健康和增殖的关键问题。健康的iPSC培养将产生健康的分化细胞，这些分化细胞通常是用于了解特定人类疾病或细胞过程的分子，细胞和功能特征的模型的终点。

在这项研究中，已经使用一个简单的方案来测试在不同孔中使用不同包衣条件的iPSCs的汇合度。iPSCs需要鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的饲养层才能正确附着，但是iPSCs和MEF的共存使得难以进行RNA或蛋白质提取等分析，因为存在两个细胞群。为了避免饲养层，属于细胞外基质（ECM）的不同蛋白质已被用于重建天然细胞生态位并具有无饲养层iPSC培养物。特别是，Matrigel是从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的可溶基底膜制剂，其富含细胞外基质蛋白（即层粘连蛋白，胶原蛋白IV，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，entactin/nidogen和生长因子）^2，3。其他使用的包被条件是纯化的蛋白质，这些蛋白质在构建ECM中具有已知的相关性:已知层粘连蛋白-521由胚胎内部细胞团中的人多能干细胞（hPSCs）分泌，^{它是出生后}体内最常见的层粘连蛋白之一4，⁵，⁶，⁷，⁸，^9， 10^，11;玻连蛋白是一种无异种细胞培养基质，已知可支持hPSC^12，13，¹⁴，^15，16的生长和分化;纤连蛋白是一种ECM蛋白，对脊椎动物发育以及胚胎干细胞在多能状态下的附着和维持很重要¹⁷，¹⁸，¹⁹，²⁰，²¹，22^，23，^24，25。由于存在不同的包被条件，我们根据它们对iPSC汇合的影响来比较它们。

研究方案

1. 涂覆 96 孔板

注意:在同一板中测试不同的涂层，但不同的孔（见 补充文件）。

1. 在DMEM中以1:100稀释基质胶。向96孔板中每孔加入100μL，并在室温下孵育1小时。之后，除去溶液并用 100 μL DMEM 洗涤孔两次。
2. 在PBS（含钙和镁）中稀释层粘连蛋白（20μg/ mL，LN-521）。向孔中加入100μL并在4°C下孵育过夜。第二天在接种细胞之前用DMEM进行两次洗涤。
3. 在稀释缓冲液中稀释玻连蛋白（10μg/mL）。向 96 孔板中每孔加入 100 μL，并在室温下孵育 1 小时。在电镀细胞之前，用PBS（不含钙和镁）清洗孔。
4. 在ddH₂O中稀释HU-纤连蛋白（30μg/ mL），向孔中加入100μL并在室温下孵育45分钟。之后，在接种细胞之前用培养基清洗孔。

2. 培养中iPSCs的维持

注意:iPSC 是商业购买的。iPSCs来源于健康的人成纤维细胞，并使用游离体技术重新编程。

1. 从-80°C冰箱或液氮中，在37°C水浴中解冻冷冻保存的iPSC。在将其移入生物安全柜之前，用70%乙醇清洁装有细胞的小瓶。
2. 用 1000 μL 移液器在 15 mL 无菌锥形管中逐滴将细胞悬液加入 5 mL 预热的细胞培养基（例如 mTeSR1）中。
3. 在室温（RT）下以304× g 离心细胞5分钟。
4. 取出培养基并将细胞沉淀重悬于 4 mL 细胞培养基中。
5. 将细胞悬液接种到 6 孔板的两个孔中（每个 6 孔细胞培养皿 10^{5 个} iPSC），其中小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 先前已接种。在DMEM中以2.4 x 10⁴ / cm² 的密度接种iPSCs前两天播种MEF（含有10%胎牛血清，1%L-谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素）。
6. 接种后，用10μM的ROCK抑制剂Y-27632补充细胞培养基。
7. 在 MEF 上培养 iPSC 前 4-5 周，然后在无饲养层条件下（无 MEF 条件），使用 mTeSR1 中感兴趣的包衣之一（参见步骤 1 和 表 1）。
8. 当 iPSC 汇合 70-80% 时，使用 0.5 mM EDTA 处理在室温下 1:4 传代 3-5 分钟。 为 6 孔板添加 1 mL 的 0.5 mM EDTA（或其他类型的板按比例）。在无饲养器条件下转移到新孔中，并在37°C，5%CO 2，20%O₂下孵育。
9. 每天用新鲜的mTeSR1更换培养基，每2天分裂一次细胞。

3. 细胞汇合的表征

1. 使用96孔板进行实验。
2. 在无饲养层条件下培养至少 1 个月后，每孔接种 10，000 个细胞，以确保 MEF 未传代。使用一次性计数玻片用光学显微镜对细胞进行计数。
3. 一式三份进行实验。因此，在三个孔中测试每个播种条件。
4. 从接种后的第1天开始，在明场模式下使用细胞仪进行自动图像采集。每24小时进行一次自动图像采集，持续5天。有关实验参数的详细信息，请参阅 补充文件。
5. 使用自动对比和自动曝光来更好地可视化细胞。
6. 设置汇合分析的分析设置（参见 补充文件），以应用每孔60%、80%和100%的掩模，以评估由于孔边界的光折射引起的焦点变化。使用上面提到的不同掩模分析设置来分析每个时间点的细胞汇合度。

4. 统计分析

1. 将定量结果报告为平均值的标准误差 （SEM） ±平均值。
2. 为了比较不同涂层条件的总体差异，使用相同的样本获取数据并执行学生配对样本t检验。小于 0.05 的 P 值被认为具有统计显著性，并且所有报告的 p 值都是双侧的。

5. 细胞骨架微丝的表征

1. 用4%多聚甲醛（4%PFA）在PBS中固定细胞在室温下10分钟，然后在PBS中洗涤两次（总共10分钟）。
2. 在室温下向每个孔中加入 100 μL 封闭溶液（由 5% BSA、0.1% Triton 在 PBS 中组成）1 小时。
3. 除去封闭溶液并用PBS洗涤样品两次10分钟。
4. 每个样品加入 100 μL 鬼笔环肽偶联工作溶液，并在室温下孵育 1 小时。
5. 用PBS洗涤细胞两次（室温下10分钟）。
6. 用Hoechst 33342染色细胞核，在PBS中稀释1:10000，在室温下10分钟。
7. 取出Hoechst溶液，用PBS洗涤细胞两次，每次10分钟。
8. 用H₂O洗涤样品，并在化学罩下干燥。
9. 加入 100 μL 封片剂（即 PBS:甘油，1:1）以覆盖细胞并保留样品荧光。
10. 在配备白光激光 （WLL） 源和 405 nm 二极管激光器的激光扫描共聚焦显微镜上观察 Ex/Em 493/517 nm 处的细胞。使用HC PLAPO 40x油浸物镜采集连续共聚焦图像。对所有检查样品使用相同的激光功率、分束器、滤光片设置、针孔直径和扫描模式。

结果

在这项研究中，我们研究了在不同包衣条件下生长时的iPSCs汇合。使用细胞仪，我们能够在5天内获得一式三份的简单信息结果。由于iPSCs几乎不附着在塑料容器上，并且需要涂层来支持其增殖，因此我们决定监测人iPSC的汇合，因为它表明细胞培养物的健康状况，并可能反映其分化潜力。体外扩增后，我们将iPSCs接种在不同的ECM底物上，并通过观察在明场中获得的样品图像并使用鬼笔环肽染色（用?...

讨论

使用iPSCs进行疾病建模和未来的药物筛选以及它们在精准医学中的可能应用使其成为一项具有重要意义的技术，因此我们认为有必要清楚地了解更类似于胚胎干细胞生理状况的体外培养条件。在这种情况下，我们使用野生型iPSCs测试了不同的ECM涂层，以了解允许细胞保持健康和未分化状态的条件。除此之外，一个关键点是在MEF和基质胶的异种成分中培养iPSC，这可能解释了一式三份之间的实验变异?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4488	Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	352097	Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+)	Thermofisher	14040133	Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+)	Euroclone	ECB4004L	Medium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile	Corning	4487	Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom	Greiner Bio One	655090	Support
Cell culture plate, 6 well	Costar	3516	Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)	Sigma	D5671	Medium
EDTA	Sigma	ED4SS-500g	Reagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit	Invitrogen	A15960	Reagent
FAST - READ 102	Biosigma	BVS100	Tool
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270106	Medium
Fibronectin	Merck	FC010	Coating
Glycerol	Sigma	G5516	Reagent
H2O		MILLIQ
Hoechst	Thermofisher	33342	Reagent
Laminin 521	Stem Cell Technologies	77003	Coating
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	LS25030081	Reagent
Matrigel	Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	354277	Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF)	Life Technologies	A24903	Coating
MTESR1 Medium	Stem Cell Technologies	85851	Medium
MTESR1 Supplement	Stem Cell Technologies	85852	Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Reagent
Phalloidin	Sigma	P1951	Reagent
Vitronectin	Stem Cell Technologies	7180	Coating
Y-27632	Sigma	Y0503	Reagent