تحسين Fecundity والخصوبة المقايسة لAedes aegypti باستخدام 24 لوحات زراعة أنسجة البئر (لوحات EAgaL)

Summary

الموصوفة هي طريقة لتوفير الوقت والمكان لحساب البيض وتحديد معدلات فقس البعوض الفردية باستخدام 24 لوحات زراعة أنسجة الآبار، والتي يمكن أن تزيد بشكل كبير من حجم وسرعة البراز والخصوبة المقايسات.

Abstract

يمثل البعوض مشكلة صحية عامة كبيرة كناقلات لمختلف مسببات الأمراض. وبالنسبة للدراسات التي تتطلب تقييما لمعلمات لياقة البعوض، ولا سيما معدلات إنتاج البيض والفقس على المستوى الفردي، وضعت الطرق التقليدية عبئا كبيرا على المحققين بسبب كثافة العمالة العالية ومتطلبات الحيز المختبري. وصف هو وسيلة بسيطة باستخدام 24 لوحة زراعة الأنسجة جيدا مع agarose في كل بئر والتصوير الرقمي لكل بئر لتحديد أعداد البيض ومعدلات فقس على مستوى فردي مع انخفاض كبير في الوقت ومتطلبات الفضاء.

Introduction

إن مكافحة البعوض لحماية البشر من مسببات الأمراض المنقولة بالنواقل هدف هام للصحة العامة، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود لقاحات فعالة لمعظم مسببات الأمراض التي يحملها البعوض. تهدف العديد من الدراسات إلى الحد من لياقة البعوض بالتزامن مع^{استراتيجية}الحد من السكان المطبقة ميدانيا 1^و2و3. وهذا يشمل دراسات مستفيضة لإنشاء البعوض المعدلة وراثيا و / أو CRISPR / Cas9 خطوط خروج المغلوب. تتطلب نهج تعديل السكان هذه تقييما مفصلا لمعلمات اللياقة البدنية الفردية^4. تقنيات المختبر التقليدية لتقييم اللياقة البدنية للبعوض الإناث تشمل الاحتواء الفردي للبعوض الأنثوي المتزاوج الذي يتغذى على الدم في حاويات 100 مل⁵، تعديل 50 مل أنابيب مخروطية ، أو أنابيب لتربية Drosophila المعدلة عن طريق توفير أسطح رطبة باستخدام القطن الرطب وأقراص الورق المرشحة للoviposition (أي أوراق البيض)^1،2،6،7. تتطلب هذه الطرق مساحة كبيرة نسبيا (على سبيل المثال ، 30 سم × 30 سم × 10 سم: W × L x H لمدة تصل إلى 100 أنبوب Drosophila) (الشكل 1) ، والتلاعب بأوراق البيض الفردية لحساب البيض ويرقات الفقس ، والتي يمكن أن تكون كثيفة العمالة. تقدم هذه المخطوطة طريقة لحساب بيض البعوض وتحديد معدلات الفقس باستخدام 24 لوحة بئر وأغاروز كسطح أوفييشن للتحايل على هذه القضايا^8.

وفي الوقت نفسه، وصف إيوشينو وآخرون^طريقة مفصلة باستخدام 12 و 24 لوحة بئر لأداء عد البيض الذي تم الحصول عليه من الإناث الفردية. يمثل بروتوكولها تحسنا كبيرا عن الطرق التقليدية في توفير الوقت والمكان⁹. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الذي وصفوه لا يزال يستخدم ورق التصفية الرطب كسطح للoviposition ، مما يتطلب تتكشف كل ورقة فردية للحصول على التهم ، كما يتم العثور على البيض في كثير من الأحيان تحت أو في طيات. كما أن بروتوكولها لم يتضمن استخدام تقنيات التصوير أو طريقة لحساب اليرقات.

يقدم هو طريقة محسنة لأداء اختبارات اللياقة البدنية لعدد البيض (أي البراز) ومعدل الفتحة (أي الخصوبة) باستخدام الآغروز كسطح oviposition في شكل لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا لAe. aegypti أن oviposit على الأسطح الرطبة. سميت هذه اللوحات لوحات "EAgaL" ، من Egg ، ارتفع الآغا، وLarva. توفر لوحات الآبار ال 24 هذه للبعوض الفردي سطحا ضئيلا لوضع البيض ، وبالتالي تبسيط وتقليل الوقت والجهد اللازمين لعد البيض واليرقات المفقسة وصيانته لبضعة أيام. يستخدم صفيحة EAgaL agarose شفافة لسطح oviposition ، مما يلغي الحاجة إلى التعامل مع أوراق البيض والعثور على البيض واليرقات عند فقسها ؛ تصوير كل بئر يؤسس سجل طويل الأجل المؤرشفة من النتائج ويفصل عملية العد في كل من الزمان والمكان من عملية تربية / المناولة، حيث الوقت غالبا ما تكون محدودة.

Protocol

1. إعداد لوحة

1. حفر ثقوب في 24 أغطية لوحة زراعة أنسجة البئر (4-6 ثقوب لكل بئر) باستخدام حفر المنزلية مع ~ 1.6 ملم (1/16 في) بت (الشكل 2).
   ملاحظة: تمنع هذه الثقوب تكثيف المياه من الآغاروز لتتراكم على الغطاء، حيث قد يضع البعوض البيض. الحجم القياسي للإناث Ae. aegypti ("ليفربول" سلالة) هو ~ 3.11 ملم جناحيها. يوصى بتقليل حجم الثقوب عند استخدام البعوض الأصغر لتجنب الهروب من اللوحة.
2. في اليوم السابق لتجربة التبييض، اغسل وشطف الأطباق جيدا وانقعها في تبييض بنسبة 1-5٪ لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف جيدا تحت تشغيل المياه deionized وتجفيفها.
   ملاحظة: هذه العملية يقلل من فرصة الفطريات والبكتيريا تنمو على الآغاروز.
3. تذوب agarose في 2٪ في الماء deionized وإضافة فورا 500 ميكرولتر من الآغاروز المنصهر إلى كل بئر من لوحات الآبار 24 باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (الشكل 3A،B). عندما يبدأ agarose لتبرد تسد طرف ماصة، إعادة تسخين agarose واستخدام طرف ماصة جديدة.
   ملاحظة: تجنب لمس جدران البئر مع طرف ماصة لأنه قد يترك قطعة من الآجروز على الحائط حيث قد تضع الأنثى البيض، مما يعقد عملية التصوير والعد.
4. قبل الاستخدام، تجف أي تكثيف على جدران البئر بين عشية وضحاها على مقاعد البدلاء مختبر (الشكل 3C،D).
   ملاحظة: يصور الجدول الزمني لل المقايسة لوحة EAgaL من تغذية الدم لتصوير اليرقات في الشكل 4، وهو للبعوض مستعمرة (Ae. aegypti "ليفربول" تربى تحت 14 ساعة ضوء: 10 ساعة دورة الضوء الداكن، 27 درجة مئوية، 80٪ الرطوبة النسبية، 500 يرقة في 49.5 سم × 29.2 سم × 9.5 سم صينية مع 2 لتر من الماء)، في ظل ظروف حشرية. يوصى بأن يقوم كل مختبر باختبار لوحة EAgaL باستخدام البعوض ، خاصة عند استخدام سلالات مختلفة ، أنواع مختلفة من البعوض ، بالإضافة إلى بروتوكولات تربية مختلفة.

2. تغذية البعوض

ملاحظة: من المهم استخدام البعوض الذي تتم تربيته في ظروف موحدة لجميع مجموعات العلاج ومجموعات المكافحة ، لأن تغذية اليرقات لها تأثير على معلمات اللياقة البدنية للبعوض^10،11. اليرقات الخلفية في ظل ظروف غير مزدحمة مع ما يكفي من الغذاء. السماح للبعوض الإناث eclose في وجود الذكور بحيث يتم ضمان التزاوج، وناضجة لمدة 3 أيام على الأقل.

1. إزالة أي مصدر للمياه و / أو السكر من البعوض الإناث على الأقل 16 ساعة قبل تغذية الدم من أجل تعزيز تغذية الدم.
2. سخني مدور الماء للتغذية الاصطناعية عند 37 درجة مئوية وأطعم البعوض الأنثوي باستخدام الدم الفقاري الموضوع في مغذيات اصطناعية لمدة 15-30 دقيقة(الشكل 5A).
3. تخدير البعوض مع CO₂ أو على الجليد، ونقلها إلى طبق زجاجي على الجليد، واختيار تلك التي هي محفورة مع الدم(الشكل 5B)في وعاء المقدمة مع الماء السكروز 30٪ لأكثر من 72 ساعة، عندما تنتهي الإناث إفراز وتطوير البيض.
   ملاحظة: إذا تم تزويد الإناث بتركيز أقل من ماء السكروز، قم بإزالة ماء السكروز وأي أسطح رطبة بعد 48 ساعة لمنع الإناث من ovipositing.

3. أوفيييشن

1. قبل نقل البعوض إلى الصفائح بحوالي ساعة واحدة، أضف 2−3 قطرات (~80−120 ميكرولتر) من الماء إلى كل بئر صفيحة باستخدام ماصة نقل.
2. على الأقل 72 ساعة بعد تغذية الدم، وضرب البعوض مع CO₂ أو على الجليد، ونقلها إلى طبق زجاجي على الجليد، ووضع كل البعوض بشكل فردي على غطاء مقلوب من لوحة بئر 24 على الجليد (الشكل 6A).
   ملاحظة: تم تطبيق هذا الإجراء من إيوشينو^{وآخرون.}
3. مرة واحدة وقد وضعت جميع البعوض 24، وتغطية الغطاء مع قاع لوحة مقلوبة(الشكل 6B)،وتأمين الغطاء ولوحة مع الطازجة، شريط مطاطي جديد ومكان في غرفة بيئية (أو غرفة تربية) (الشكل 6C) حتى يتعافى البعوض (~ 10-15 دقيقة) وتحويل لوحة الجانب الأيمن لأعلى(الشكل 6D).
4. السماح للبعوض الإناث لoviposit لمدة 24-48 ساعة وإزالة الإناث عن طريق الإفراج عنهم من لوحات في قفص كبير.
   ملاحظة: إذا كان من المهم تتبع الإناث الفردية، تخدير لهم عن طريق تقشعر لها الأبدان لوحات وإزالتها بشكل فردي على الجليد. لوحظ تأخر oviposition والإفرازات الداكنة التي تتداخل مع عد البيض عندما تم نقل الإناث إلى لوحات في وقت سابق من 72 ساعة بعد وجبة الدم (PBM) (الشكل 7D).

4. عد البيض

1. تحقق من كل بئر من لوحة البئر ال 24 ، حيث يضع البعوض البيض في بعض الأحيان على جدار الآبار وعلى هامش سطح الآغاروز / البلاستيك ، حيث يصعب حلها في الصور الفوتوغرافية. باستخدام فرشاة الطلاء الرطب، نقل البيض وضعت على الجدار وحافة الآغاروز إلى السطح المسطح من الآغاروز بحيث يكون كل البيض في طائرة موحدة ولا تتداخل مع بعضها البعض.
   ملاحظة: حافة agarose عادة ما تكون خارج الطائرة المحورية للكاميرا بسبب التوتر السطحي للمحلول agarose.
2. باستخدام ملقط، وإزالة أي كسر في الساقين، وأجنحة، وغيرها من الجسيمات في الآبار التي قد تتداخل مع البيض التصوير(الشكل 7C).
3. أدخل ورقة بيضاء أسفل اللوحة لزيادة التباين مع بيض البعوض الداكن قبل التصوير باستخدام مضيء مجسم(الشكل 7A).
4. التقاط صورة لكل بئر باستخدام كاميرا رقمية مدمجة في وضع المجهر، والذي يسمح للمستخدم للتركيز على كائنات أقرب إلى 1 سم. هذه القدرة تسمح للكاميرا أن توضع مباشرة على لوحة لصور البيض دون ترايبود أو موقف(الشكل 7A). لتمييز البيض الفردي الموضوع في كتل، استخدم الوضع الدقيق أو فائق الدقة لالتقاط صور عالية الدقة بحيث يمكن رؤية التفاصيل عن قرب.
   ملاحظة: مسح بطاقة الذاكرة للكاميرا قبل استخدامها لمنع الخلط بين الصور الجديدة والازهقة.
5. بعد تصوير كل بئر من لوحة، التقط صورة للوحة كاملة مع تسمية أمر التصوير لتمييز كل لوحة في وقت لاحق(الشكل 7E).
6. إضافة طبقة رقيقة ~ 5 قطرات من الماء (~ 200 ميكرولتر) مع ماصة نقل إلى كل بئر لمنع المكونات agarose والبيض من التجفيف والحث على نمو الجنين والفقس. انتبه لمستويات المياه في الساعات القليلة الأولى وتحقق كل يوم، لأنه قد يكون هناك فقدان المياه بسبب الامتصاص عن طريق الآغروز أو التبخر. أضف الماء عندما يكون مستواه منخفضا جدا بحيث لا يمكن لليرقات أن تفقس.
   ملاحظة: تبخر المياه يحدث بشكل غير موحد سواء داخل لوحة أو داخل كومة من لوحات. وقد لوحظ أن التجفيف يحدث بالترتيب التالي: 1) آبار الزاوية (A1، A6، D1، D6) تجف أسرع؛ 1) الآبار الزاوية (A1، A6، D1، D6) تجف أسرع؛ 4) الآبار الزاوية (A1، A6، D1، D6) تجف أسرع. تليها آبار 2) عند الحافة الخارجية للوح (A2-A5، B1، B6، C1، C6، D2-D5)؛ وآخر 3) الآبار داخل. عندما تكون اللوحات مكدسة، يجف الطبق العلوي أسرع.
7. نقل الصور إلى جهاز كمبيوتر مع ImageJ (فيجي) وإعادة تسمية الملفات لتنظيم أسهل مثل "[لوحة معرف]_[حسنا معرف].jpg" (الشكل 8A،B).
8. إنشاء ملف جدول بيانات لتسجيل أرقام البويضات (أي البراز) وأرقام اليرقات وحساب معدل الفقس (أيالخصوبة) (الشكل 9E).
9. فتح الصور مع ImageJ (فيجي)¹² واستخدام"متعددة النقاط"أداة لوضع علامة على كل بيضة (الشكل 9A−C); التكبير أو التصغير باستخدام "+" أو "-" مفتاح لحساب البيض في كتل. بعد وضع علامة على كل البيض، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز متعدد النقاط لطرح عدد العلامات(الشكل 9D). تسجيل النتائج في جدول بيانات.

5. تقييم الخصوبة

ملاحظة: في غضون يومين ، قد تبدأ يرقات النجوم الأولى في النسيلة في الآبار. انتظر لمدة 3-5 أيام أخرى قبل التصوير / العد لضمان أن جميع البيض قابلة للحياة يفقس.

1. إعداد طعام اليرقات عن طريق خلط ملعقة كبيرة (~ 168 ملغ) من أغذية الأسماك المطحونة (أي النظام الغذائي العادي ليرقات البعوض) في 20 مل من الماء وانتظار استقرار الجسيمات الصلبة الكبيرة (الشكل 10A−D). ابدأ بإضافة الطعام (الناسخ) إلى الآبار التي تحتوي على يرقات مفقسة بمجرد ظهورها ، لأنها لا تبقى لفترة طويلة دون طعام.
   ملاحظة: قد تتداخل الإضافة الزائدة لجسيمات الطعام مع تصوير اليرقات المفقسة وإحصاءها.
2. بعد حوالي 5-8 أيام من إضافة الماء إلى الآبار، تبرد الصفيحة بالغطاء بالجليد المسحوق لمدة 15-20 دقيقة لتخدير اليرقات.
3. التقاط صور لكل بئر مع الحفاظ على لوحات على الجليد كما تم القيام به مع البيض. بالنسبة للصور اليرقات ، قم بتوفير خلفية داكنة عن طريق إدخال مادة سوداء تحت اللوحة للمساعدة في تعزيز التباين. بعد تصوير كل بئر من لوحة، التقط صورة للوحة بأكملها مع ملصق أمر التصوير لتمييز كل لوحة في وقت لاحق.
   ملاحظة: يتم التقاط الصور أثناء وجود الصفائح على الجليد لأن حركة اليرقات قد تعرض العد للخطر. لوحات قابلة لإعادة الاستخدام. تجميد وإزالة البعوض وأغاروز لتنظيف للاستخدام المقبل. لوحة EAgaL ليست مناسبة لتربية اليرقات إلى مراحل متقدمة.
4. فتح الصور مع ImageJ (فيجي) واستخدام"متعددة النقاط"أداة لحساب بالنقر على كل يرقة. على مدى فترة 3-5 أيام قد تكون بعض اليرقات قد ذابت ، خاصة في الآبار ذات الأعداد المنخفضة من اليرقات. لذلك ، عند العد ، استثني البشرة السقيفة (أي exuviae) ، والتي تبدو مثل يرقات الرأس فقط مع القليل من الجسم ، أو اليرقات المنكمشة(الشكل 10E). تسجيل النتائج في جدول البيانات.

6. إجراء التحليل

1. بعد جمع جميع البيانات اللازمة لتحليل البراز والخصوبة، وإجراء التحليل الإحصائي المناسب وإنشاء الرسوم البيانية باستخدام البرامج المفضلة.

النتائج

تم حقن البعوض مع dsRNA استهداف ناقل الحديد المرشح (FeT) أو الجين التحكم (EGFP)، التي تغذيها الدم، وقياسها لالخراز والخصوبة الناتج باستخدام طريقة لوحة EAgaL، بعد الإجراء المذكور أعلاه.

أظهر البعوض الذي تم إسكات تعبير FeT بعد حقن dsRNA انخفاضا كبيرا في كل من عدد البيض ومعدل الفتحة

Discussion

لوحة EAgaL يقلل بشكل كبير من العمل والوقت والفضاء لإجراء فحوصات البراز والخصوبة الفردية في Aedes aegypti بالمقارنة مع طريقة FT. وأسفرت المقارنة الأولية بين طريقة FT ولوحة EAgaL عن أوقات أقصر لجميع الخطوات (تم تطبيق تقنية التصوير على طريقة FT)(الجدول 1). كمرجع، يتم توفير تقدير تكاليف بد?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188