Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)

Zusammenfassung

Beschrieben wird eine zeit- und platzsparende Methode zur Zählung von Eiern und zur Bestimmung der Brutraten einzelner Mücken anhand von 24 Brunnengewebekulturplatten, die den Umfang und die Geschwindigkeit von Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests erheblich erhöhen können.

Zusammenfassung

Mücken stellen ein erhebliches Problem der öffentlichen Gesundheit als Vektoren verschiedener Krankheitserreger dar. Für Studien, die eine Bewertung der Mückenfitnessparameter, insbesondere der Eiproduktion und der Schraffurraten auf individueller Ebene, erfordern, haben herkömmliche Methoden die Forscher aufgrund der hohen Arbeitsintensität und des Laborraumbedarfs erheblich belastet. Beschrieben wird eine einfache Methode mit 24 Brunnengewebe-Kulturplatte mit Agarose in jedem Brunnen und digitale Bildgebung von jedem Brunnen, um Eizahlen und Schraffurraten auf individueller Ebene mit erheblich reduziertem Zeit- und Platzbedarf zu bestimmen.

Einleitung

Die Bekämpfung von Stechmücken zum Schutz des Menschen vor vektorübertragenen Krankheitserregern ist ein wichtiges Ziel für die öffentliche Gesundheit, vor allem aufgrund des Mangels an wirksamen Impfstoffen für die meisten Von Mücken übertragenen Krankheitserreger. Viele Studien zielen darauf ab, die Mückenfitness in Verbindung mit einer feldtauglichen Bevölkerungsreduktionsstrategie^1,2,^3zureduzieren. Dazu gehören umfangreiche Studien zur Herstellung transgener Mücken und/oder CRISPR/Cas9-Knockout-Linien. Solche Ansätze zur Bevölkerungsmodifikation erfordern eine detaillierte Bewertung der einzelnen Fitnessparameter⁴. Herkömmliche Labortechniken zur Beurteilung der Tauglichkeit weiblicher Mücken umfassen die individuelle Eindämmung von gepaarten, blutgefütterten weiblichen Mücken in 100 ml Behältern⁵, modifizierte 50 ml konische Schläuche oder Röhren für die Drosophila-Aufzucht modifiziert durch bereitstellung feuchter Oberflächen mit feuchter Baumwolle und Filterpapierscheiben für die Eioposition (d.h. Eipapiere)^1,2,6,7. Solche Methoden erfordern einen relativ großen Raum (z.B. 30 cm x 30 cm x 10 cm: B x L x H für bis zu 100 Drosophila-Röhren) (Abbildung 1) und die Manipulation einzelner Eipapiere zum Zählen von Eiern und Brutlarven, die arbeitsintensiv sein können. Dieses Manuskript stellt eine Methode zur Zählung von Mückeneiern und zur Bestimmung der Schraffurraten anhand von 24 Brunnenplatten und Agarose als Eileiteroberfläche dar, um diese Probleme zu umgehen⁸.

Gleichzeitig beschrieben Ioshino et al.⁹ eine detaillierte Methode mit 12 und 24 Brunnenplatten zur Durchführung von Eizählungen, die von einzelnen Weibchen erhalten wurden. Ihr Protokoll stellte eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden bei der Einsparung von Zeit und Platz⁹dar. Das von ihnen beschriebene Protokoll verwendet jedoch weiterhin nasses Filterpapier als Oberfläche für die Eileiterung, die das Entfalten jedes einzelnen Papiers erfordert, um Zählungen zu erhalten, da Eier oft unter oder in Falten gefunden werden. Ihr Protokoll enthielt auch nicht den Einsatz von Bildgebungstechnologien oder eine Methode zur Larvenzählung.

Präsentiert wird eine verbesserte Methode zur Durchführung von Fitness-Assays für Eizahl (d.h. Fruchtbarkeit) und Schraffurrate (d.h. Fruchtbarkeit) mit Agarose als Ovipositionsoberfläche in einem 24-Well-Gewebe-Kultur-Plattenformat für Ae. aegypti, das auf feuchten Oberflächen oviposit. Diese Platten wurden "EAgaL" Platten genannt, von Egg, Agarose, und Larva. Diese 24 Brunnenplatten bieten einzelnen Mücken eine minimale Oberfläche zum Legen von Eiern, wodurch die Zeit und der Aufwand für die Zählung und Pflege von Eiern und geschlüpften Larven für einige Tage vereinfacht und drastisch reduziert werden. Die EAgaL-Platte verwendet transluzente Agarose für die Eileiteroberfläche, die den Umgang mit Eipapieren und das Auffinden der Eier und Larven beim Schlüpfen überflüssig macht; Das Fotografieren jedes Brunnens erstellt eine langfristig archivierte Aufzeichnung der Ergebnisse und trennt den Zählprozess sowohl zeitlich als auch räumsfrei vom Aufzucht-/Handlingprozess, bei dem die Zeit oft begrenzt ist.

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Protokoll

1. Plattenvorbereitung

1. Bohren Sie Löcher in 24 Brunnengewebekulturplattendeckel (4 x 6 Löcher pro Bohrloch) mit einem Haushaltsbohrer mit einem Bit von 1,6 mm (1/16 in)(Abbildung 2).
   HINWEIS: Diese Löcher verhindern, dass sich Wasserkondensation aus Agarose auf dem Deckel ansammelt, wo Mücken Eier legen können. Die Standardgröße der weiblichen Ae. aegypti ("Liverpool"-Sorte) beträgt eine Spannweite von 3,11 mm. Es wird empfohlen, die Größe der Löcher zu reduzieren, wenn kleinere Mücken verwendet werden, um ein Ausweichen aus der Platte zu vermeiden.
2. Am Tag vor dem Eileiterexperiment die Platten gründlich waschen und abspülen und bei Raumtemperatur in 1 bis 5% Bleichmittel einweichen. Unter laufendem entionisiertem Wasser gründlich abspülen und trocknen.
   HINWEIS: Dieser Prozess verringert die Wahrscheinlichkeit, dass Pilze und Bakterien auf Agarose wachsen.
3. Schmelzen Sie Agarose bei 2% in entionisiertem Wasser und fügen Sie sofort 500 l der geschmolzenen Agarose zu jedem Brunnen der 24 Brunnenplatten mit einer 1.000 l Pipette hinzu (Abbildung 3A,B). Wenn die Agarose zu kühlen beginnt und die Pipettenspitze verstopft, erhitzen Sie die Agarose und verwenden Sie eine neue Pipettenspitze.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Wände des Brunnens mit der Pipettenspitze zu berühren, da es ein Stück Agarose an der Wand hinterlassen kann, wo ein Weibchen Eier legen kann, was den Bildgebungs- und Zählprozess erschwert.
4. Trocknen Sie vor dem Gebrauch über Nacht auf einer Laborbank kondensieren Sie die Kondensation an den Brunnenwänden aus (Abbildung 3C,D).
   ANMERKUNG: Die Zeitleiste des EAgaL-Platten-Assays von der Blutfütterung bis zur Larvenbildgebung ist in Abbildung 4dargestellt, die für Koloniemücken (Ae. aegypti "Liverpool" unter 14 h Licht: 10 h dunkles Lichtzyklus, 27 °C, 80% relative Luftfeuchtigkeit, 500 Larven in einem 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm Tablett mit 2 L Wasser) unter insektenbedingter Bedingungen ist. Es wird empfohlen, dass jedes Labor die EAgaL-Platte mit den verwendeten Mücken testet, insbesondere bei Verwendung verschiedener Stämme, verschiedener Mückenarten sowie verschiedener Aufzuchtprotokolle.

2. Mückenfütterung

HINWEIS: Es ist wichtig, Mücken zu verwenden, die unter einheitlichen Bedingungen für alle Behandlungsgruppen und Kontrollgruppen aufgezogen werden, da die Larvenernährung Auswirkungen auf die Fitnessparameter von Mücken^10,11hat. Hintere Larven unter nicht überfüllten Bedingungen mit ausreichend Nahrung. Lassen Sie weibliche Mücken in Gegenwart von Männchen ausschließen, so dass die Paarung gewährleistet ist, und reifen für mindestens 3 Tage.

1. Entfernen Sie alle Wasser- und/oder Zuckerquellen von den weiblichen Mücken mindestens 16 h vor der Blutfütterung, um die Blutfütterung zu verbessern.
2. Erhitzen Sie einen Wasserzirkulator für die künstliche Fütterung bei 37 °C und füttern Sie weibliche Mücken mit Wirbeltierblut, das in künstlichen Feedern für 15 bis 30 min platziert wird (Abbildung 5A).
3. Mücken mit CO₂ oder auf Eis anästheisieren, auf Eis in eine Glasschale übertragen und mit Blut engorged (Abbildung 5B) in einen Behälter mit 30% Saccharosewasser für mehr als 72 h, wenn Weibchen die Ausscheidung und Eientwicklung beenden.
   HINWEIS: Wenn die Weibchen mit einer geringeren Konzentration von Saccharosewasser versorgt sind, entfernen Sie das Saccharosewasser und alle nassen Oberflächen nach 48 h, um zu verhindern, dass die Weibchen sich ovipositieren.

3. Oviposition

1. Etwa 1 h vor der Übertragung von Mücken auf die Platten, fügen Sie 2-3 Tropfen (80 x 120 L) Wasser in jede Platte brunnen mit einer Transferpipette.
2. Mindestens 72 h nach der Blutfütterung, Knockdown-Mücken mit CO₂ oder auf Eis, übertragen Sie sie auf eine Glasschale auf Eis, und legen Sie jede Mücke einzeln auf einen umgekehrten Deckel der 24 Brunnenplatte auf Eis(Abbildung 6A).
   HINWEIS: Dieses Verfahren wurde von Ioshino et al.⁹angewendet.
3. Sobald alle 24 Mücken platziert sind, bedecken Sie den Deckel mit einem umgekehrten Plattenboden (Abbildung 6B), sichern Sie den Deckel und die Platte mit einem frischen, neuen Gummiband und legen Sie sie in eine Umweltkammer (oder Aufzuchtraum)(Abbildung 6C), bis sich die Mücken erholen (10 €15 min) und drehen Sie die Platte nach rechts (Abbildung 6D).
4. Lassen Sie die weiblichen Mücken für 24-48 h oviposit und entfernen Weibchen, indem Sie sie von den Platten in einen großen Käfig.
   HINWEIS: Wenn es wichtig ist, den Überblick über einzelne Weibchen zu behalten, befeuchten Sie sie, indem Sie die Platten kühlen und einzeln auf Eis entfernen. Verzögerte Eizellen und dunkle Ausscheidungen, die die Eizählung stören, wurden beobachtet, wenn Weibchen vor 72 h nach der Blutmahlzeit (PBM) auf die Teller übertragen wurden (Abbildung 7D).

4. Eierzählung

1. Überprüfen Sie jeden Brunnen der 24 Brunnenplatte, da manchmal Mücken Eier an der Wand von Brunnen und am Rand der Agarose/Kunststoffoberfläche legen, wo sie schwer in Fotografien zu lösen sind. Mit einem nassen Pinsel die an der Wand und am Rand der Agarose gelegten Eier auf die flache Oberfläche der Agarose bewegen, so dass sich alle Eier in einer einheitlichen Ebene befinden und sich nicht überlappen.
   HINWEIS: Die Kante der Agarose ist aufgrund der Oberflächenspannung der Agaroselösung typischerweise atypisch aus der Fokusebene der Kamera.
2. Entfernen Sie mit Zangen alle gebrochenen Beine, Flügel und andere Partikel in den Brunnen, die bildgebende Eier stören können (Abbildung 7C).
3. Legen Sie weißes Papier unter die Platte, um den Kontrast zu dunklen Mückeneiern vor der Bildgebung mit einem Stereomikroskop-Beleuchtungsgerät zu erhöhen (Abbildung 7A).
4. Nehmen Sie ein Bild von jedem Brunnen mit einer kompakten Digitalkamera im Mikroskop-Modus, die es dem Benutzer ermöglicht, sich auf Objekte in der Nähe von 1 cm zu konzentrieren. Diese Funktion ermöglicht es, die Kamera direkt auf dem Teller zu platziert werden, um Eier ohne Stativ oder Ständer abzubilden (Abbildung 7A). Um einzelne In Klumpen gelegte Eier zu unterscheiden, verwenden Sie den feinen oder superfeinen Modus, um hochauflösende Bilder zu erfassen, so dass Nahaufnahmen sichtbar werden können.
   HINWEIS: Löschen Sie die Speicherkarte der Kamera vor der Verwendung, um Verwechslungen zwischen neuen und alten Bildern zu vermeiden.
5. Nachdem Sie jeden Brunnen einer Platte fotografiert haben, nehmen Sie ein Bild der gesamten Platte mit einem bildgebenden Auftragsetikett auf, um jede Platte später zu unterscheiden(Abbildung 7E).
6. Fügen Sie jedem Brunnen eine dünne Schicht von 5 Tropfen Wasser (ca. 200 L) mit einer Transferpipette hinzu, um zu verhindern, dass ihr Agarose-Stecker und die Eier trocknen, und um die Entwicklung und Dasbrüchierung des Embryos zu induzieren. Achten Sie auf die Wasserstände für die ersten Stunden und überprüfen Sie jeden Tag, da es Wasserverlust durch Absorption durch die Agarose oder Verdunstung geben kann. Fügen Sie Wasser hinzu, wenn der Pegel zu niedrig ist, damit die Larven schlüpfen können.
   HINWEIS: Die Verdunstung von Wasser erfolgt ungleichmäßig sowohl innerhalb einer Platte als auch innerhalb eines Plattenstapels. Es wurde beobachtet, dass die Trocknung in der folgenden Reihenfolge erfolgt: 1) Eckbrunnen (A1, A6, D1, D6) trocknen am schnellsten; gefolgt von 2) Brunnen am äußeren Rand der Platte (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); und letzten 3) Brunnen im Inneren. Wenn Platten gestapelt werden, trocknet die obere Platte am schnellsten.
7. Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer mit ImageJ (Fidschi) und benennen Sie die Dateien für eine einfachere Organisation um, z. B. "[Platten-ID]_[well ID].jpg" (Abbildung 8A,B).
8. Erstellen Sie eine Tabellenkalkulationsdatei, um Eierzahlen (d. h. Fruchtbarkeit) und Larvenzahlen aufzuzeichnen und die Schraffurrate (d. h. Fruchtbarkeit) zu berechnen (Abbildung 9E).
9. Öffnen Sie die Bilder mit ImageJ (Fiji)¹² und verwenden Sie das "Multi-Point"-Tool, um jedes Ei zu markieren (Abbildung 9A-C); Zoom-in oder Zoom-out mit "+" oder "-" Taste, um die Eier in Klumpen zu zählen. Nachdem Sie alle Eier markiert haben, doppelklicken Sie auf das Mehrpunktsymbol, um die Anzahl der Markierungen(Abbildung 9D)anzuzeigen. Zeichnen Sie die Ergebnisse in einer Kalkulationstabelle auf.

5. Fertilitätsbewertung

HINWEIS: In 2 Tagen können die ersten Instar-Larven beginnen, sich in den Brunnen zu schließen. Warten Sie noch 3 bis 5 Tage, bevor Sie sich bildgeben/zählen, um sicherzustellen, dass alle lebensfähigen Eier schlüpfen.

1. Bereiten Sie Larvenfutter vor, indem Sie 1/16 Esslöffel (ca. 168 mg) gemahlener Fischfutter (d. h. normale Mückenlarvendiät) in 20 ml Wasser mischen und darauf warten, dass sich große feste Partikel absetzen(Abbildung 10A-D). Beginnen Sie, Nahrung (der Überstand) zu den Brunnen hinzuzufügen, die geschlüpfte Larven enthalten, sobald sie erscheinen, weil sie nicht lange ohne Nahrung überleben.
   HINWEIS: Eine übermäßige Zugabe von Lebensmittelpartikeln kann die Bildgebung und das Zählen von geschlüpften Larven beeinträchtigen.
2. Etwa 5–8 Tage nach Zugabe von Wasser in die Brunnen, kühlen Sie die Platte durch Bedecken mit zerkleinertem Eis für 15-20 min, um Larven zu besanten.
3. Nehmen Sie Bilder von jedem Brunnen, während Die Teller auf Eis zu halten, wie mit den Eiern getan wurde. Für Larvenbilder, bieten einen dunklen Hintergrund durch Einfügen eines schwarzen Materials unter der Platte, um den Kontrast zu verbessern. Nachdem Sie jeden Brunnen einer Platte fotografiert haben, nehmen Sie ein Bild der gesamten Platte mit einem bildgebenden Auftragsetikett auf, um die einzelnen Platten später zu unterscheiden.
   HINWEIS: Bilder werden aufgenommen, während die Platten auf Eis sind, weil die Larvenbewegung die Zählung beeinträchtigen kann. Die Platten sind wiederverwendbar; die Mücken und Agarose einfrieren und entfernen, um sie für den nächsten Gebrauch zu reinigen. Die EAgaL-Platte eignet sich nicht für die Aufzucht von Larven in fortgeschrittene Stadien.
4. Öffnen Sie Bilder mit ImageJ (Fidschi) und verwenden Sie das "Multi-Point"-Tool, um zu zählen, indem Sie auf jede Larve klicken. Während des Zeitraums von 3 bis 5 Tagen können einige Larven geschmolzen sein, vor allem in Brunnen mit geringer Anzahl von Larven. Daher, beim Zählen, schließen Sie die Schuppen-Kinekulen (d.h. Exuviae), die wie Kopf-nur Larven mit ein wenig Körper aussehen, oder geschrumpfte Larven (Abbildung 10E). Zeichnen Sie die Ergebnisse in der Kalkulationstabelle auf.

6. Analyse durchführen

1. Nachdem alle notwendigen Daten für die Fecundity- und Fruchtbarkeitsanalyse gesammelt wurden, führen Sie geeignete statistische Analysen durch und erstellen Sie Diagramme mit bevorzugter Software.

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Ergebnisse

Mücken wurden mit dsRNA injiziert, die auf einen Kandidateneisentransporter (FeT) oder ein Kontrollgen (EGFP) abzielten, das mit Blut gefüttert wurde, und nach dem oben beschriebenen Verfahren auf Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeitsleistung gemessen.

Mücken, bei denen die FeT-Expression nach der dsRNA-Injektion zum Schweigen gebracht wurde, zeigten eine signifikante Verringerung sowohl der Eizahl als auch der Schraffurrate (Abbildung 11A- C). Alle...

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Diskussion

Die EAgaL-Platte reduziert Arbeit, Zeit und Raum drastisch, um individuelle Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests in Aedes aegypti im Vergleich zur FT-Methode durchzuführen. Ein vorläufiger Vergleich zwischen der FT-Methode und der EAgaL-Platte führte zu kürzeren Zeiten für alle Schritte (imaging technique wurde auf die FT-Methode angewendet) (Tabelle 1). Als Referenz ist in Tabelle 2eine Schätzung der Anlauf- und Pro-Assay-Kosten (eine 24-Well-EAgaL-Platte gege...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188