使用 24 个井组织培养板 （EAgaL 板） 改进 了伊蚊 的丰度和生育率测定

摘要

描述的是一种节省时间和空间的方法，使用24个井组织培养板来计算卵子和确定单个蚊子的孵化率，从而大大提高肥大和生育检测的规模和速度。

摘要

蚊子作为各种病原体的媒介，是一个严重的公共卫生问题。对于那些需要评估蚊子适应参数的研究，特别是鸡蛋的产生和个别水平的孵化率，由于高劳动强度和实验室空间要求，传统方法给调查人员带来了沉重的负担。描述是一个简单的方法，使用24个井组织培养板与每个井的糖和数字成像每个井，以确定鸡蛋数量和孵化率在个别水平，大大减少了时间和空间的要求。

引言

控制蚊子以保护人类免受病媒传播病原体的伤害是一项重要的公共卫生目标，主要是因为缺乏对蚊子携带的大多数病原体的有效疫苗。许多研究旨在减少蚊子的适应与一个领域适用的人口减少策略^1，2，3。这包括广泛的研究，以创建转基因蚊子和/或CRISPR/Cas9淘汰赛线。这种人口调整方法需要详细评估个别的健身参数^4。评估雌性蚊子健康状况的传统实验室技术包括:在100毫升容器⁵中单独密封配对、供血喂养的雌性蚊子，修改50毫升圆锥管，或使用湿棉和过滤纸盘（即蛋纸^{）1、2、6、7}进行湿润表面改造的果蝇饲养管。这种方法需要相对较大的空间（例如，30厘米×30厘米x10厘米:W×L x H，最多100个果蝇管）（图1），以及操作单个蛋纸来计算卵子和孵化幼虫，这可能是劳动密集型的。这份手稿提出了一种计算蚊子卵子的方法，并用24个油井板确定孵化率，并作为卵子表面来规避这些问题^。

同时，Ioshino等人⁹ 描述了一种使用12个和24个井板进行从女性个体获得的卵子计数的详细方法。他们的协议代表了在节省时间和空间⁹的传统方法的重大改进。然而，他们描述的协议继续使用湿滤纸作为渗透的表面，这需要展开每个单个纸张来获得计数，因为鸡蛋经常在下面或褶皱中发现。他们的协议也不包括使用成像技术或幼虫计数的方法。

呈现的是一种改进的方法，用于执行卵号（即丰度）和孵化率（即生育率）的健身检测，使用 agarose 作为 24 井组织培养板格式的卵剂表面，用于 Ae. aegypti， 在潮湿表面上渗出。这些板块被命名为"EAgaL"板块，来自 Egg、 阿加玫瑰和 Larva。这24个井板为单个蚊子提供最小的表面产卵，从而简化和大大减少了计算和维持卵子和孵化幼虫几天所需的时间和精力。EAgaL板使用半透明的糖脂作为卵泡表面，无需处理蛋纸，并在孵化时找到卵子和幼虫:拍摄每口井都建立了结果的长期存档记录，并将时间和空间中的计数过程与时间通常有限的饲养/处理过程区分开来。

研究方案

1. 板准备

1. 使用约 1.6 毫米（1/16 在）位（图 2）的家用钻孔在 24 个井组织培养板盖（每口井 4 −6 孔）中钻孔。
   注意:这些孔防止水凝结从糖脂积聚在盖子上，蚊子可能会在那里产卵。雌性 Ae.aegypti（" 利物浦"菌株）的标准尺寸为~3.11毫米翼展。建议使用较小的蚊子避免从盘子中逃出时缩小孔的大小。
2. 在渗漏实验前一天，在室温下彻底清洗和冲洗盘子，并将它们浸泡在1−5%漂白剂中，时间为30−60分钟。在运行除离子水下彻底冲洗并干燥。
   注意:这个过程减少了真菌和细菌在蔗糖上生长的机会。
3. 熔化在除离子水中2%的糖分，并立即使用1，000μL移液器（图3A，B）在24个井板的每口井中加入500微升的熔融糖。当阿加罗斯开始冷却和堵塞移液器尖端时，重新加热阿加罗斯，并使用新的移液器尖端。
   注意:避免用移液器尖碰触井壁，因为它可能会在墙上留下一块糖，女性可以在那里产卵，使成像和计数过程复杂化。
4. 使用前，在实验室长凳上隔夜将井壁上的冷凝物干燥（图3C，D）。
   注:EAgaL板检测从血液喂养到幼虫成像的时间表在 图4中描述，图4是给群落蚊子（Ae.。。 在 昆虫条件下，在14小时光下饲养的"利物浦":10h暗光循环，27°C，80%相对湿度，500幼虫在49.5厘米×29.2厘米x9.5厘米托盘与2升水）。建议每个实验室测试 EAgaL 板与蚊子正在使用，特别是当使用不同的菌株，不同的蚊子种类，以及不同的饲养协议。

2. 蚊子喂养

注:对于所有治疗组和对照组，使用在统一条件下饲养的蚊子至关重要，因为幼虫营养对蚊子的适应参数^10、11有影响。后幼虫在不拥挤的条件下有足够的食物。让雌性蚊子在雄性蚊子面前脱毛，确保交配，并成熟至少3天。

1. 在喂血前至少16小时从雌性蚊子身上取出任何水源和/或糖分，以增强血液喂养能力。
2. 在37°C下加热水循环器进行人工喂养，用放置在人工喂食器中的脊椎动物血液喂养雌性蚊子15−30分钟（图5A）。
3. 麻醉蚊子_{与二氧化碳} 或冰上，将它们转移到冰上的玻璃盘，并选择那些用血液（图5B）注入容器提供30%蔗糖水超过72小时，当女性完成排泄和卵子发育。
   注意:如果女性的蔗糖水浓度较低，在48小时后取出蔗糖水和任何潮湿的表面，以防止雌性卵巢。

3. 异位

1. 在将蚊子转移到盘子前约1小时，使用转移移液器将2−3滴（约80−120微L）的水加入每个板井中。
2. 喂血后至少72小时，_{用二氧化碳}击倒蚊子或在冰上，将它们转移到冰上的玻璃盘上，并将每只蚊子单独放在冰上24个井板的倒盖上（图6A）。
   注:此程序已从石野等人^9。
3. 放置所有 24 只蚊子后，用倒板底部（图 6B）盖住盖子，用新的橡皮筋固定盖子和盘子，放在环境室（或饲养室）（图 6C）中，直到蚊子恢复（约 10−15 分钟），并将板向右转（图 6D）。
4. 允许雌性蚊子以24−48小时的速度渗出，通过将雌性蚊子从盘子中释放到一个大笼子里来清除雌性蚊子。
   注意:如果跟踪个别女性很重要，请通过冷却盘子来麻醉她们，并在冰上单独取出它们。当女性在血餐后72小时（PBM）（图7D）之前被转移到盘子里时，观察到了延迟的输卵和干扰卵子计数的暗排泄物。

4. 鸡蛋计数

1. 检查24口井板的每口井，因为有时蚊子会在井壁和井面边缘产卵，在照片中很难解决。使用湿漆刷，将放在墙上和糖缘上的鸡蛋移到蔗糖的平坦表面，使所有鸡蛋均匀地处于均匀平面，并且互不重叠。
   注意:由于 agarose 溶液的表面张力，agarose 的边缘通常出自相机的焦点平面。
2. 使用钳子，去除井中任何可能干扰成像卵的断腿、翅膀和其他颗粒（图7C）。
3. 使用立体显微镜照明器（图 7A）在成像前在盘子下插入白纸，以增加与黑蚊子蛋的对比度。
4. 使用显微镜模式下的紧凑型数码相机拍摄每口油井的图像，使用户能够聚焦在近 1 厘米的物体上。此功能允许摄像机直接放置在盘子上，在没有三脚架或支架的情况下对鸡蛋进行成像 （图 7A）。要区分在团块中产下的单独卵子，请使用精细或超细模式捕获高分辨率图像，以便查看特写细节。
   注意:在使用前清除相机的存储卡，以防止新旧图像之间的混淆。
5. 拍摄每口板的油井后，用成像顺序标签拍摄整个板的图像，以便稍后区分每个板（图 7E）。
6. 在每口井中加入一层薄薄的~5滴水（约200微L），用转移移液器，以防止其糖塞和卵子干燥，并诱导胚胎发育和孵化。注意头几个小时的水位，每天检查，因为可能因吸收糖或蒸发而造成水损失。当幼虫水位过低，幼虫无法孵化时，加入水。
   注意:水的蒸发在盘子内和板内均匀发生。据观察，干燥按以下顺序发生:1） 角井（A1、A6、D1、D6）干燥速度最快:其次是2）板外边缘的井（A2-A5，B1，B6，C1，C6，D2-D5）:和最后3）井里面。当板堆叠时，顶部板最快干燥。
7. 将图像传输到带有 ImageJ （斐济） 的计算机，并重命名文件以简化组织，例如"[板 ID][井 ID] .jpg"（图 8A，B）。
8. 创建电子表格文件以记录卵子编号（即粪便）和幼虫数量，并计算孵化率（即生育率）（图 9E）。
9. 打开图像J（斐济^）12， 并使用"多点"工具标记每个鸡蛋（图9A−C）:使用"+"或"-"键放大或缩小，以将鸡蛋数在团块中。标记所有鸡蛋后，双击 多点图标 以增加标记数（图 9D）。将结果记录在电子表格中。

5. 生育评估

注:在2天内，第一个星内幼虫可能开始在井中关闭。等待3−5天以上，然后成像/计数，以确保所有可行的鸡蛋孵化。

1. 将1/16汤匙（约168毫克）的地面鱼类食物（即正常的蚊幼虫饮食）混合在20mL的水中，等待大固体颗粒沉淀（图10A−D）来准备幼虫食物。一旦孵化出的幼虫出现，就开始在含有孵化幼虫的井中加入食物（超自然物），因为它们没有食物就不能存活很长时间。
   注意:过量添加食物颗粒可能会干扰孵化幼虫的成像和计数。
2. 在水加入油井后约5-8天，用碎冰覆盖板冷却板15−20分钟，以麻醉幼虫。
3. 拍摄每口油井的图像，同时保持板在冰上，就像鸡蛋一样。对于幼虫图像，请在板下插入黑色材料，以增强对比度，从而提供深色背景。拍摄每口板的油井后，用成像顺序标签拍摄整个板的图像，以便稍后区分每个板。
   注意:图像是在板块在冰上时拍摄的，因为幼虫运动可能会损害计数。板可重复使用:冷冻和去除蚊子和阿加罗斯清洁为下一次使用。EAgaL板不适合饲养幼虫到高级阶段。
4. 打开图像J（斐济），并使用"多点"工具通过点击每个幼虫计数。在3−5天的时间里，一些幼虫可能已经被割毛，特别是在幼虫数量少的井里。因此，在计数时，排除棚角质层（即外皮），这些角质层看起来像只有头部的幼虫，有一点点身体，或缩小的幼虫（图10E）。在电子表格中记录结果。

6. 执行分析

1. 收集了粪便和生育分析的所有必要数据后，执行适当的统计分析，并使用首选软件创建图表。

结果

蚊子被注射dsRNA针对候选铁运输机（FeT）或控制基因（EGFP），血液喂养，并测量的丰度和生育能力输出使用EAgaL板法，按照上述程序。

在 dsRNA 注射后，FeT 表达沉默的蚊子的卵子数量和孵化率均显著降低（图 11A−C）。所有控制和治疗蚊子都放置在EAgaL板后72小时PBM。沉默的蚊子也表现出延迟排泄和小而浅色的鸡蛋（图12A，B）?...

讨论

与英国《金融时报》的方法相比，EAgaL板块大幅减少了在伊蚊进行个体生育和生育检测的劳动、时间和空间。FT 方法与 EAgaL 板之间的初步比较导致所有步骤的使用时间缩短（成像技术应用于 FT 方法）（表 1）。作为参考，在表 2中提供了启动和每次检测（一个 24 井 EAgaL 板与 24 个 FTs）成本的估计值。

使用 EAgaL 板时需要考虑一些问题。最...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188