Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Riepilogo

Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.

Abstract

Le zanzare rappresentano un problema significativo di salute pubblica come vettori di vari agenti patogeni. Per quegli studi che richiedono una valutazione dei parametri di fitness delle zanzare, in particolare la produzione di uova e i tassi di schiusa a livello individuale, i metodi convenzionali hanno gravato in modo sostanziale sugli investigatori a causa dell'elevata intensità di lavoro e dei requisiti di spazio di laboratorio. Descritto è un metodo semplice che utilizza 24 piastre di coltura tissutale del pozzo con agarosio in ogni pozzo e imaging digitale di ogni pozzo per determinare il numero di uova e i tassi di schiusa a livello individuale con requisiti di tempo e spazio sostanzialmente ridotti.

Introduzione

Il controllo delle zanzare per proteggere gli esseri umani da agenti patogeni trasmesse da vettori è un importante obiettivo di salute pubblica, principalmente a causa della mancanza di vaccini efficaci per la maggior parte degli agenti patogeni trasportati dalle zanzare. Molti studi mirano a ridurre la forma fisica delle zanzare in combinazione con una strategia di riduzione della popolazione^{applicabile sul campo 1,2,3}. Ciò include studi approfonditi per creare zanzare transgeniche e / o linee knockout CRISPR / Cas9. Tali approcci di modifica della popolazione richiedono una valutazione dettagliata dei singoli parametri di idoneità⁴. Le tecniche di laboratorio convenzionali per valutare l'idoneità delle zanzare femminili includono il contenimento individuale di zanzare femminili accoppiate e alimentate a sangue in contenitori da 100 ml^5,tubi conici modificati da 50 ml o tubi per l'allevamento di Drosophila modificati fornendo superfici umide utilizzando cotone umido e dischi di carta filtrante per l'ovideposizione (cioè carte d'uovo)^1,2,6,7. Tali metodi richiedono uno spazio relativamente grande (ad esempio, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H per un massimo di 100 tubi Drosophila) (Figura 1),e la manipolazione di singole carte uovo per il conteggio di uova e larve da cova, che possono essere laboriose. Questo manoscritto presenta un metodo per contare le uova di zanzara e determinare i tassi di schiusa utilizzando 24 piastre di pozzo e agarosio come superficie di ovideposizione per^{aggirare questi problemi 8}.

Contemporaneamente, Ioshino et^al. Il loro protocollo rappresentava un miglioramento significativo rispetto ai metodi convenzionali nel risparmiare tempo e^{spazio 9}. Tuttavia, il protocollo che hanno descritto continua a utilizzare carta filtrante bagnata come superficie per l'ovideposizione, che richiede lo spiegamento di ogni singola carta per ottenere conteggi, poiché le uova si trovano spesso sotto o in pieghe. Il loro protocollo inoltre non includeva l'uso di tecnologie di imaging o un metodo per il conteggio larvale.

Presentato è un metodo migliorato per eseguire test di fitness per il numero di uova (cioè fecondità) e il tasso di schiusa (cioè la fertilità) usando l'agarosio come superficie di ovideposizione in un formato di piastra di coltura tissutale di 24 po 'per Ae. aegypti che oviposit su superfici umidi. Queste tavole sono state chiamate piatti "EAgaL", da Egg, Agarose e Larva. Questi 24 piastre di pozzo forniscono alle singole zanzare una superficie minima per deporre le uova, semplificando e riducendo drasticamente il tempo e lo sforzo necessari per contare e mantenere le uova e le larve tratteggiate per alcuni giorni. La piastra EAgaL utilizza agarosio traslucido per la superficie di ovideposizione, che elimina la necessità di maneggiare le carte uovo e trovare le uova e le larve quando schiuse; fotografare ogni pozzo stabilisce una registrazione archiviata a lungo termine dei risultati e separa il processo di conteggio sia nel tempo che nello spazio dal processo di allevamento / movimentazione, dove il tempo è spesso limitato.

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Protocollo

1. Preparazione della piastra

1. Praticare fori in 24 coperchi di piastre di coltura tissutale bene (4−6 fori per pozzo) utilizzando un trapano domestico con un bit ~1,6 mm (1/16 in)(Figura 2).
   NOTA: Questi fori impediscono la condensa dell'acqua dall'agarosio per accumularsi sul coperchio, dove le zanzare possono deporre le uova. La dimensione standard della femmina Ae. aegypti ("Liverpool" strain) è di ~ 3,11 mm di apertura alare. Si consiglia di ridurre le dimensioni dei fori quando si utilizzano zanzare più piccole per evitare la fuga dalla piastra.
2. Il giorno prima dell'esperimento di ovideposizione, lavare e risciacquare accuratamente le piastre e immergerle in candeggina all'1−5% per 30−60 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare accuratamente sotto l'acqua deionizzata corrente e asciugarli.
   NOTA: Questo processo riduce la possibilità che funghi e batteri crescono sull'agarosio.
3. Sciogliere l'agarosio al 2% in acqua deionizzata e aggiungere immediatamente 500 μL dell'agarosio fuso ad ogni pozzo delle 24 piastre del pozzo utilizzando una pipetta da 1.000 μL(Figura 3A,B). Quando l'agarosio inizia a raffreddarsi e ostruire la punta della pipetta, surriscaldare l'agarosio e utilizzare una nuova punta di pipetta.
   NOTA: Evitare di toccare le pareti del pozzo con la punta della pipetta perché può lasciare un pezzo di agarosio sul muro dove una femmina può deporre le uova, complicando il processo di imaging e conteggio.
4. Prima dell'uso, asciugare qualsiasi condensa sulle pareti del pozzo durante la notte su un banco da laboratorio(Figura 3C,D).
   NOTA: La sequenza temporale del saggio della piastra EAgaL dall'alimentazione del sangue all'imaging larvale è raffigurata nella figura 4, che è per le zanzare colonia(Ae. aegypti "Liverpool" allevato sotto 14 h di luce:10 h ciclo di luce scura, 27 °C, 80% umidità relativa, 500 larve in un vassoio di 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm con 2 L di acqua), in condizioni insetti. Si raccomanda a ciascun laboratorio di testare la piastra EAgaL con le zanzare utilizzate, specialmente quando si utilizzano ceppi diversi, diverse specie di zanzare e diversi protocolli di allevamento.

2. Alimentazione delle zanzare

NOTA: È fondamentale utilizzare zanzare allevate in condizioni uniformi per tutti i gruppi di trattamento e gruppi di controllo, perché la nutrizione larvale ha un impatto sui parametri di fitness delle zanzare^10,11. Larve posteriori in condizioni poco affollate con cibo sufficiente. Lascia che le zanzare femminili echino in presenza di maschi in modo che l'accoppiamento sia assicurato e maturi per almeno 3 giorni.

1. Rimuovere qualsiasi fonte di acqua e /o zucchero dalle zanzare femminili almeno 16 ore prima dell'alimentazione del sangue al fine di migliorare l'alimentazione del sangue.
2. Riscaldare un circolatore d'acqua per l'alimentazione artificiale a 37 °C e nutrire le zanzare femminili utilizzando sangue vertebrato posto in alimentatori artificiali per 15−30 min(Figura 5A).
3. Anestetizzare le zanzare con CO₂ o sul ghiaccio, trasferirle in un piatto di vetro sul ghiaccio e selezionarne di ornate di sangue (Figura 5B) in un contenitore dotato di acqua di saccarosio al 30% per più di 72 ore, quando le femmine terminano l'escrezione e lo sviluppo delle uova.
   NOTA: Se alle femmine viene fornita una concentrazione inferiore di acqua di saccarosio, rimuovere l'acqua di saccarosio e le eventuali superfici umide dopo 48 ore per evitare che le femmine ovipositing.

3. Ovideposizione

1. Circa 1 h prima di trasferire le zanzare alle piastre, aggiungere 2−3 gocce (~80−120 μL) di acqua in ogni piastra bene usando una pipetta di trasferimento.
2. Almeno 72 ore dopo l'alimentazione del sangue, abbattere le zanzare con CO₂ o sul ghiaccio, trasferirle in un piatto di vetro sul ghiaccio e posizionare individualmente ogni zanzara su un coperchio rovesciato del piatto di 24 pozzetti sul ghiaccio(Figura 6A).
   NOTA: Questa procedura è stata applicata da Ioshino et^al.
3. Una volta posizionate tutte le 24 zanzare, coprire il coperchio con un fondo piastra rovesciato(Figura 6B),fissare il coperchio e la piastra con un nuovo elastico fresco e posizionare in una camera ambientale (o in una stanza di allevamento)(Figura 6C)fino a quando le zanzare non si riprendono (~ 10−15 min) e ruotano il lato destro della piastra verso l'alto(Figura 6D).
4. Lasciare che le zanzare femminili ovoposi per 24−48 h e rimuovere le femmine rilasciandole dai piatti in una grande gabbia.
   NOTA: Se è importante tenere traccia delle singole femmine, anestetizzarle raffrezzandole e rimuoverle singolarmente sul ghiaccio. L'ovideposizione ritardata e le escrezioni scure che interferiscono con il conteggio delle uova sono state osservate quando le femmine sono state trasferite nelle piastre prima di 72 ore dopo la farina di sangue (PBM) (Figura 7D).

4. Conteggio delle uova

1. Controlla ogni pozzo della piastra del pozzo 24, poiché a volte le zanzare depongono le uova sulla parete dei pozzi e a margine della superficie agarosio / plastica, dove sono difficili da risolvere nelle fotografie. Usando un pennello bagnato, spostare le uova deposte sul muro e sul bordo dell'agarosio sulla superficie piatta dell'agarosio in modo che tutte le uova si trovano su un piano uniforme e non si sovrappongano tra loro.
   NOTA: Il bordo dell'agarosio è in genere fuori dal piano focale della fotocamera a causa della tensione superficiale della soluzione di agarosio.
2. Utilizzando le forcep, rimuovere eventuali gambe rotte, ali e altre particelle nei pozzi che possono interferire con l'imaging delle uova (Figura 7C).
3. Inserire carta bianca sotto la piastra per aumentare il contrasto con le uova di zanzara scure prima dell'imaging utilizzando un illuminatore stereomicroscopico (Figura 7A).
4. Scatta un'immagine di ogni pozzo utilizzando una fotocamera digitale compatta in modalità microscopio, che consente all'utente di concentrarsi su oggetti fino a 1 cm. Questa capacità consente di posizionare la fotocamera direttamente sulla piastra per immagini le uova senza treppiede o supporto (Figura 7A). Per distinguere le singole uova deposte in ciuffi, utilizzare la modalità fine o super fine per catturare immagini ad alta risoluzione in modo da poter visualizzare i dettagli ravvicinati.
   NOTA: cancellare la scheda di memoria della fotocamera prima dell'uso per evitare confusione tra immagini nuove e vecchie.
5. Dopo aver fotografato ogni pozzo di una lastra, scattare un'immagine dell'intera lastra con un'etichetta dell'ordine di imaging per distinguere ogni lastra in un secondo momento (Figura 7E).
6. Aggiungere uno strato sottile ~ 5 gocce d'acqua (~ 200 μL) con una pipetta di trasferimento ad ogni pozzo per evitare che il suo tappo di agarosio e le uova si asciughino e per indurre lo sviluppo e la schiusa dell'embrione. Prestare attenzione ai livelli dell'acqua per le prime ore e controllare ogni giorno, perché potrebbe esserci perdita d'acqua dovuta all'assorbimento da parte dell'agarosio o all'evaporazione. Aggiungere acqua quando il suo livello è troppo basso per far schiudere le larve.
   NOTA: L'evaporazione dell'acqua avviene in modo non uniforme sia all'interno di una piastra che all'interno di una pila di piastre. È stato osservato che l'essiccazione avviene nel seguente ordine: 1) i pozzi d'angolo (A1, A6, D1, D6) si asciugano più velocemente; seguito da 2) pozzi sul bordo esterno della piastra (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); e ultimi 3) pozzi all'interno. Quando le piastre sono impilate, la piastra superiore si asciuga più velocemente.
7. Trasferire le immagini in un computer con ImageJ (Fiji) e rinominare i file per un'organizzazione più semplice, ad esempio "[ID piastra]_[ID pozzo].jpg" (Figura 8A,B).
8. Creare un file di foglio di calcolo per registrare i numeri delle uova (ad esempio, fecondità) e i numeri larvali e calcolare la velocità di tratteggio (cioè la fertilità)(Figura 9E).
9. Aprite le immagini con ImageJ (Fiji)^{12 e} usate lo strumento "multi-punto" per contrassegnare ogni uovo (Figura 9A−C); zoom-in o zoom-out usando "+" o "–" tasto per contare le uova in ciuffi. Dopo aver segnato tutte le uova, fare doppio clic sull'icona a più punti per riportare il numero di segni (Figura 9D). Registrare i risultati in un foglio di calcolo.

5. Valutazione della fertilità

NOTA: In 2 giorni, le prime larve instar possono iniziare a precludersi nei pozzi. Attendere altri 3−5 giorni prima dell'imaging/conteggio per assicurarsi che tutte le uova vitali si schiudano.

1. Preparare il cibo larvale mescolando 1/16 cucchiaio (~168 mg) di cibo macinato per pesci (cioè una normale dieta larvale di zanzara) in 20 mL di acqua e in attesa che si stabiliscino grandi particelle solide(Figura 10A−D). Inizia ad aggiungere cibo (il supernatante) ai pozzi che contengono larve tratteggiate non appena appaiono, perché non sopravvivono a lungo senza cibo.
   NOTA: L'aggiunta eccessiva di particelle alimentari può interferire con l'imaging e il conteggio delle larve tratteggiate.
2. Circa 5-8 giorni dopo l'aggiunta di acqua ai pozzi, raffreddare il piatto coprendo con ghiaccio schiacciato per 15−20 minuti per anestetizzare le larve.
3. Scatta immagini di ogni pozzo mantenendo i piatti sul ghiaccio come è stato fatto con le uova. Per le immagini larvali, fornire uno sfondo scuro inserendo un materiale nero sotto la piastra per aiutare a migliorare il contrasto. Dopo aver fotografato ogni pozzo di una piastra, scatta un'immagine dell'intera piastra con un'etichetta dell'ordine di imaging per distinguere ogni lastra in seguito.
   NOTA: Le immagini vengono scattate mentre le piastre sono sul ghiaccio perché il movimento larvale può compromettere il conteggio. Le piastre sono riutilizzabili; congelare e rimuovere le zanzare e l'agarosio per pulire per il prossimo utilizzo. La piastra EAgaL non è adatta per allevare larve a stadi avanzati.
4. Apri le immagini con ImageJ (Fiji) e usa lo strumento "multi-punto" per contare facendo clic su ogni larva. Nel periodo di 3−5 giorni alcune larve potrebbero essere state fuse, specialmente nei pozzi con un basso numero di larve. Pertanto, durante il conteggio, escludere le cuticole del capannone (cioè le exuviae), che sembrano larve solo per la testa con un po 'di corpo, o larve rimpicciolite(Figura 10E). Registrare i risultati nel foglio di calcolo.

6. Eseguire analisi

1. Dopo aver raccolto tutti i dati necessari per l'analisi della fecondità e della fertilità, eseguire analisi statistiche appropriate e creare grafici utilizzando il software preferito.

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Risultati

Le zanzare sono state iniettate con dsRNA che prende di mira un trasportatore di ferro candidato (FeT) o un gene di controllo (EGFP), alimentato dal sangue e misurato per la fecondità e la produzione di fertilità utilizzando il metodo della piastra EAgaL, seguendo la procedura sopra descritta.

Le zanzare in cui l'espressione fet è stata silenziata a seguito dell'iniezione di dsRNA hanno mostrato una significativa riduzione sia del numero di uova che del tasso di schiusa (

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Discussione

La piastra EAgaL riduce drasticamente il lavoro, il tempo e lo spazio per condurre test individuali di fecondità e fertilità in Aedes aegypti rispetto al metodo FT. Il confronto preliminare tra il metodo FT e la piastra EAgaL ha comportato tempi più brevi per tutte le fasi (la tecnica di imaging è stata applicata al metodo FT)(tabella 1). Come riferimento, nella tabella 2 sono fornite una stima dei costi di avviamento e di dosaggio (una piastra EAgaL da 24 pozzi contro 24 TT...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188