Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)

Résumé

Décrit est une méthode permettant de gagner du temps et de l’espace pour compter les œufs et déterminer les taux d’éclosion des moustiques individuels à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire dans les puits, ce qui peut augmenter considérablement l’échelle et la vitesse des essais de fécondité et de fertilité.

Résumé

Les moustiques représentent un problème de santé publique important en tant que vecteurs de divers agents pathogènes. Pour les études qui nécessitent une évaluation des paramètres de condition physique des moustiques, en particulier la production d’œufs et les taux d’éclosion au niveau individuel, les méthodes conventionnelles ont imposé un fardeau substantiel aux chercheurs en raison de l’intensité de travail élevée et des exigences en matière d’espace de laboratoire. Décrit est une méthode simple utilisant 24 puits plaque de culture de tissus avec de l’agarose dans chaque puits et l’imagerie numérique de chaque puits pour déterminer le nombre d’œufs et les taux d’éclosion à un niveau individuel avec des besoins en temps et en espace considérablement réduits.

Introduction

La lutte contre les moustiques pour protéger les humains contre les agents pathogènes à transmission vectorielle est un objectif de santé publique important, principalement en raison du manque de vaccins efficaces pour la plupart des agents pathogènes transportés par les moustiques. De nombreuses études visent à réduire la condition physique des moustiques en conjonction avec une stratégie de réduction de la population applicable sur le terrain^1,2,3. Cela comprend des études approfondies pour créer des moustiques transgéniques et / ou des lignes knockout CRISPR / Cas9. De telles approches de modification de la population nécessitent une évaluation détaillée des paramètres de condition physique individuels⁴. Les techniques de laboratoire conventionnelles pour évaluer la valeur adaptative des moustiques femelles comprennent le confinement individuel des moustiques femelles accouplé et nourris au sang dans des contenants de 100 mL^5,des tubes coniques modifiés de 50 mL ou des tubes pour l’élevage de drosophiles modifiés en fournissant des surfaces humides en utilisant du coton humide et des disques en papier filtre pour la ponte (c.-à-d. les papiers d’œufs)^1,2,6,7. De telles méthodes nécessitent un espace relativement grand (p. ex., 30 cm x 30 cm x 10 cm : L x L x H pour un accès à 100 tubes de drosophile) (figure 1)et la manipulation de papiers d’œufs individuels pour compter les œufs et les larves à couver, ce qui peut nécessiter beaucoup de main-d’œuvre. Ce manuscrit présente une méthode pour compter les œufs de moustiques et déterminer les taux d’éclosion en utilisant 24 plaques de puits et de l’agarose comme surface de ponte pour contourner ces problèmes⁸.

Simultanément, Ioshino et al.⁹ ont décrit une méthode détaillée utilisant des plaques de 12 et 24 puits pour effectuer le comptage des œufs obtenus à partir de femelles individuelles. Leur protocole représentait une amélioration significative par rapport aux méthodes conventionnelles en économisant du temps et de l’espace^9. Cependant, le protocole qu’ils ont décrit continue d’utiliser du papier filtre humide comme surface pour la ponte, ce qui nécessite de déplier chaque papier individuel pour obtenir des comptes, car les œufs se trouvent souvent sous ou dans les plis. Leur protocole n’incluait pas non plus l’utilisation de technologies d’imagerie ou d’une méthode de comptage larvaire.

Présenté est une méthode améliorée pour effectuer des essais de condition physique pour le nombre d’œufs (c.-à-d. fécondité) et le taux d’éclosion (c.-à-d. fertilité) en utilisant l’agarose comme surface de ponte dans un format de plaque de culture tissulaire de 24 puits pour Ae. aegypti qui ovipose sur les surfaces humides. Ces plaques ont été nommées plaques « EAgaL », de Egg, Agarose et Larva. Ces plaques de 24 puits fournissent aux moustiques individuels une surface minimale pour pondre des œufs, simplifiant ainsi et réduisant considérablement le temps et les efforts nécessaires pour compter et maintenir les œufs et les larves écloses pendant quelques jours. La plaque EAgaL utilise de l’agarose translucide pour la surface de ponte, ce qui élimine la nécessité de manipuler des papiers d’œufs et de trouver les œufs et les larves lorsqu’ils éclosent; photographier chaque puits permet d’établir un enregistrement archivé à long terme des résultats et de séparer le processus de comptage dans le temps et dans l’espace du processus d’élevage et de manutention, où le temps est souvent limité.

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Protocole

1. Préparation des assiettes

1. Forez des trous dans 24 couvercles de plaques de culture tissulaire de puits (4−6 trous par puits) à l’aide d’une foreuse domestique avec un trépan d’environ 1,6 mm (1/16 in)(figure 2).
   REMARQUE: Ces trous empêchent la condensation de l’eau de l’agarose de s’accumuler sur le couvercle, où les moustiques peuvent pondre des œufs. La taille standard de la femelle Ae. aegypti (souche « Liverpool ») est d’environ 3,11 mm d’envergure. Il est recommandé de réduire la taille des trous lors de l’utilisation de moustiques plus petits pour éviter de s’échapper de la plaque.
2. La veille de l’expérience de ponte, lavez et rincez soigneusement les plaques et faites-les tremper dans de l’eau de Javel à 1−5 % pendant 30 à 60 minutes à température ambiante. Rincez abondamment sous de l’eau déionisée courante et séchez-les.
   REMARQUE: Ce processus réduit le risque de champignons et de bactéries se développant sur l’agarose.
3. Faire fondre l’agarose à 2 % dans de l’eau désionisée et ajouter immédiatement 500 μL de l’agarose fondue à chaque puits des 24 plaques de puits à l’aide d’une pipette de 1 000 μL(figure 3A,B). Lorsque l’agarose commence à refroidir et à obstruer la pointe de la pipette, réchauffez l’agarose et utilisez une nouvelle pointe de pipette.
   REMARQUE: Évitez de toucher les parois du puits avec la pointe de la pipette, car cela peut laisser un morceau d’agarose sur le mur où une femelle peut pondre des œufs, ce qui complique le processus d’imagerie et de comptage.
4. Avant utilisation, sécher toute condensation sur les parois du puits pendant la nuit sur un banc de laboratoire(figure 3C,D).
   REMARQUE : La chronologie de l’analyse sur plaque EAgaL, de l’alimentation sanguine à l’imagerie larvaire, est illustrée à la figure 4,qui concerne les moustiques des colonies(Ae. aegypti « Liverpool » élevé sous 14 h de lumière : 10 h cycle de lumière foncé, 27 °C, humidité relative de 80 %, 500 larves dans un plateau de 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm avec 2 L d’eau), dans des conditions insecticides. Il est recommandé que chaque laboratoire teste la plaque EAgaL avec les moustiques utilisés, en particulier lors de l’utilisation de différentes souches, de différentes espèces de moustiques, ainsi que de différents protocoles d’élevage.

2. Alimentation des moustiques

REMARQUE: Il est essentiel d’utiliser des moustiques élevés dans des conditions uniformes pour tous les groupes de traitement et les groupes témoins, car la nutrition larvaire a un impact sur les paramètres de condition physique des moustiques^10,11. Larves arrière dans des conditions peu fréquentées avec suffisamment de nourriture. Laissez les moustiques femelles s’enfermer en présence de mâles afin que l’accouplement soit assuré et mûrissent pendant au moins 3 jours.

1. Retirer toute source d’eau et/ou de sucre des moustiques femelles au moins 16 h avant l’alimentation par le sang afin d’améliorer l’alimentation par le sang.
2. Chauffer un circulateur d’eau pour l’alimentation artificielle à 37 °C et nourrir les moustiques femelles à l’aide de sang vertébré placé dans des mangeoires artificielles pendant 15 à 30 minutes(figure 5A).
3. Anesthésier les moustiques avec du CO₂ ou sur de la glace, les transférer dans un plat en verre sur la glace et sélectionner ceux qui sont engorgés de sang (Figure 5B) dans un récipient fourni avec 30% d’eau de saccharose pendant plus de 72 h, lorsque les femelles terminent l’excrétion et le développement des œufs.
   REMARQUE: Si les femelles reçoivent une concentration plus faible d’eau saccharose, retirez l’eau saccharose et toute surface humide après 48 h pour empêcher les femelles de ponte.

3. Ponte

1. Environ 1 h avant de transférer les moustiques dans les plaques, ajoutez 2−3 gouttes (~80−120 μL) d’eau dans chaque puits de plaque à l’aide d’une pipette de transfert.
2. Au moins 72 h après l’alimentation par le sang, éliminez les moustiques atteints de CO₂ ou sur la glace, transférez-les dans un plat en verre sur la glace et placez individuellement chaque moustique sur un couvercle inversé de la plaque de 24 puits sur la glace(figure 6A).
   NOTA : Cette procédure a été appliquée à partir de Ioshino et coll.⁹.
3. Une fois que les 24 moustiques ont été placés, couvrez le couvercle d’un fond de plaque inversé(figure 6B),fixez le couvercle et la plaque avec un nouvel élastique frais et placez-le dans une chambre environnementale (ou une salle d’élevage)(figure 6C)jusqu’à ce que les moustiques récupèrent (~10−15 min) et tournez la plaque vers le haut(figure 6D).
4. Laissez les moustiques femelles ponder pendant 24−48 h et enlevez les femelles en les libérant des plaques dans une grande cage.
   REMARQUE: S’il est important de garder une trace sur les femelles individuelles, anesthésiez-les en refroidissant les assiettes et retirez-les individuellement sur la glace. Une ponte retardée et des excrétions sombres qui nuisent au comptage des œufs ont été observées lorsque les femelles ont été transférées dans les plaques plus tôt que 72 h après la farine de sang (PBM) (figure 7D).

4. Comptage des œufs

1. Vérifiez chaque puits de la plaque de 24 puits, car parfois les moustiques pondent des œufs sur la paroi des puits et à la marge de la surface de l’agarose / plastique, où ils sont difficiles à résoudre sur les photos. À l’aide d’un pinceau humide, déplacez les œufs pondus sur le mur et le bord de l’agarose vers la surface plane de l’agarose afin que tous les œufs soient dans un plan uniforme et ne se chevauchent pas.
   REMARQUE: Le bord de l’agarose est généralement hors du plan focal de la caméra en raison de la tension superficielle de la solution d’agarose.
2. À l’aide d’une pince, retirez les jambes, les ailes et les autres particules cassées dans les puits qui peuvent interférer avec l’imagerie des œufs (Figure 7C).
3. Insérez du papier blanc sous la plaque pour augmenter le contraste avec les œufs de moustiques foncés avant l’imagerie à l’aide d’un illuminateur de stéréomicroscope(Figure 7A).
4. Prenez une image de chaque puits à l’aide d’un appareil photo numérique compact en mode microscope, ce qui permet à l’utilisateur de se concentrer sur des objets aussi proches que 1 cm. Cette capacité permet de placer la caméra directement sur la plaque pour imager les œufs sans trépied ni support(Figure 7A). Pour distinguer les œufs individuels pondus en touffes, utilisez le mode fin ou super-fin pour capturer des images haute résolution afin que les détails en gros plan puissent être vus.
   Remarque : Effacez la carte mémoire de l’appareil photo avant utilisation pour éviter toute confusion entre les nouvelles et les anciennes images.
5. Après avoir photographié chaque puits d’une plaque, prenez une image de la plaque entière avec une étiquette d’ordre d’imagerie pour distinguer chaque plaque plus tard(Figure 7E).
6. Ajouter une fine couche d’environ 5 gouttes d’eau (~200 μL) avec une pipette de transfert à chaque puits pour empêcher son bouchon d’agarose et les œufs de sécher et pour induire le développement et l’éclosion de l’embryon. Faites attention aux niveaux d’eau pendant les premières heures et vérifiez tous les jours, car il peut y avoir une perte d’eau due à l’absorption par l’agarose ou à l’évaporation. Ajouter de l’eau lorsque son niveau est trop bas pour que les larves éclosent.
   NOTA : L’évaporation de l’eau se produit de façon non uniforme à l’intérieur d’une plaque et à l’intérieur d’une pile de plaques. Il a été observé que le séchage se produit dans l’ordre suivant: 1) les puits d’angle (A1, A6, D1, D6) sèchent le plus rapidement; suivi de 2) puits au bord extérieur de la plaque (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); et le dernier 3) puits à l’intérieur. Lorsque les plaques sont empilées, la plaque supérieure sèche le plus rapidement.
7. Transférez les images sur un ordinateur avec ImageJ (Fidji) et renommez les fichiers pour faciliter l’organisation, tels que « [ID de plaque]_[ID de puits] .jpg »(Figure 8A,B).
8. Créer un fichier de feuille de calcul pour consigner le nombre d’œufs (c.-à-d. la fécondité) et le nombre de larves et calculer le taux d’éclosion (c.-à-d. la fertilité)(figure 9E).
9. Ouvrez les images avec ImageJ (Fidji)¹² et utilisez l’outil "multi-point" pour marquer chaque œuf(Figure 9A−C); zoom avant ou zoom arrière à l’aide de la touche "+" ou "–" pour compter les œufs en touffes. Après avoir marqué tous les œufs, double-cliquez sur l’icône multi-points pour afficher le nombre de repères(Figure 9D). Enregistrez les résultats dans une feuille de calcul.

5. Évaluation de la fécondité

REMARQUE : Dans 2 jours, les larves du premier stade peuvent commencer à s’écloser dans les puits. Attendez 3 à 5 jours de plus avant l’imagerie ou le comptage pour vous assurer que tous les œufs viables éclosent.

1. Préparer la nourriture larvaire en mélangeant 1/16 cuillère à soupe (~168 mg) de nourriture pour poissons de fond (c.-à-d. régime larvaire normal des moustiques) dans 20 mL d’eau et en attendant que de grosses particules solides se déposent(figure 10A−D). Commencez à ajouter de la nourriture (le surnageant) aux puits qui contiennent des larves écloses dès qu’elles apparaissent, car elles ne survivent pas longtemps sans nourriture.
   NOTA : L’ajout excessif de particules alimentaires peut nuire à l’imagerie et au comptage des larves écloses.
2. Environ 5 à 8 jours après l’ajout d’eau aux puits, refroidir la plaque en recouvrant de glace concassée pendant 15 à 20 minutes pour anesthésier les larves.
3. Prenez des images de chaque puits tout en gardant les assiettes sur la glace comme cela a été fait avec les œufs. Pour les images larvaires, fournissez un arrière-plan sombre en insérant un matériau noir sous la plaque pour aider à améliorer le contraste. Après avoir photographié chaque puits d’une plaque, prenez une image de la plaque entière avec une étiquette d’ordre d’imagerie pour distinguer chaque plaque plus tard.
   NOTA : Les images sont prises pendant que les plaques sont sur la glace parce que le mouvement des larves peut compromettre le comptage. Les plaques sont réutilisables; congeler et enlever les moustiques et l’agarose pour les nettoyer en cas d’utilisation prochaine. La plaque EAgaL ne convient pas à l’élevage des larves à des stades avancés.
4. Ouvrez les images avec ImageJ (Fidji) et utilisez l’outil "multi-points" pour compter en cliquant sur chaque larve. Au cours de la période de 3 à 5 jours, certaines larves peuvent avoir mué, en particulier dans les puits où le nombre de larves est faible. Par conséquent, lors du comptage, exclure les cuticules excrétées (c.-à-d. les exuviae), qui ressemblent à des larves à tête seule avec un peu de corps, ou à des larves rétrécies (figure 10E). Enregistrez les résultats dans la feuille de calcul.

6. Effectuer une analyse

1. Après avoir recueilli toutes les données nécessaires à l’analyse de la fécondité et de la fertilité, effectuer une analyse statistique appropriée et créer des graphiques à l’aide du logiciel préféré.

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Résultats

Les moustiques ont reçu une injection d’ARNdb ciblant un transporteur de fer candidat (FeT) ou un gène témoin (EGFP), nourris dans le sang, et mesurés pour la fécondité et la fertilité à l’aide de la méthode de la plaque EAgaL, suivant la procédure décrite ci-dessus.

Les moustiques chez lesquels l’expression de feT a été réduite au silence après l’injection d’ARNdb ont montré une réduction significative du nombre d’œufs et du taux d’éclosion

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Discussion

La plaque EAgaL réduit considérablement le travail, le temps et l’espace pour effectuer des tests individuels de fécondité et de fertilité dans Aedes aegypti par rapport à la méthode FT. La comparaison préliminaire entre la méthode FT et la plaque EAgaL a donné lieu à des temps plus courts pour toutes les étapes (la technique d’imagerie a été appliquée à la méthode FT)(tableau 1). À titre de référence, une estimation des coûts de démarrage et par essai (une pla...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188