24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

요약

설명된 것은 계란을 계산하고 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하여 개별 모기의 해치 비율을 결정하는 시간과 공간 절약 방법이며, 이는 실질적으로 fecundity 및 불임 검사의 규모와 속도를 증가시킬 수 있습니다.

초록

모기는 다양한 병원균의 벡터로서 중요한 공중 보건 문제를 나타냅니다. 모기 피트 니스 매개 변수의 평가를 필요로 하는 그 연구에 대 한, 특히 계란 생산 및 개별 수준에서 해치 속도, 기존의 방법은 높은 노동 강도 와 실험실 공간 요구 사항으로 인해 조사자에 상당한 부담을 넣어. 설명된 간단한 방법은 각 웰에 아가로즈를 가진 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하고, 각 웰의 디지털 이미징을 사용하여 시간과 공간 요구 사항이 크게 감소된 개별 수준에서 계란 수와 해치 비율을 결정합니다.

서문

벡터 매개 병원균으로부터 인간을 보호하기 위한 모기의 통제는 중요한 공중 위생 목표입니다, 주로 모기에 의해 운반된 병원체의 대부분을 위한 효과적인 백신의 부족 때문입니다. 많은 연구는 현장 적용 인구 감소 전략^1,2,3과함께 모기^체력을감소시키는 것을 목표로합니다. 여기에는 형질전환 모기 및/또는 CRISPR/Cas9 녹아웃 라인을 만드는 광범위한 연구가 포함됩니다. 이러한 인구 수정 접근 방식은 개별 피트니스 매개 변수^4에대한 상세한 평가가 필요합니다. 여성 모기의 적합성을 평가하는 종래의 실험실 기법은 100mL 용기^5,변형된 50mL 원추형 튜브 또는 드로소필라 사육을 위한 튜브의 개별 봉쇄를 포함하며, 배란용 습기가 많은 표면을 제공함으로써 변형된 드로소필라 의 튜브(즉, 계란 종이)^1,2,6,7. 이러한 방법은 상대적으로 큰 공간(예를 들어, 30cm x 30cm x 10cm: 최대 100개의 드로소필라 튜브에 대한 W x L x H)(도1)가필요하며, 계란을 계산하고 유충을 부화하기 위한 개별 계란 용지의 조작이 필요하며, 이는 노동 집약적일 수 있다. 이 원고는 모기 알을 계산하고 이러한 문제를 회피하기 위해 oviposition 표면으로 24 개의 우물 판과 아가로즈를 사용하여 해치 비율을 결정하는 방법을^{제시합니다 8.}

동시에, Ioshino^{외. 9는} 개별 여성에게서 얻은 계란 계수를 수행하기 위하여 12 및 24 의 우물 판을 사용하여 상세한 방법을 기술했습니다. 그들의 프로토콜은 시간과 공간^9를절약하는 기존의 방법에서 상당한 개선을 나타냈다. 그러나, 그(것)들이 기술한 프로토콜은 계란이 수시로 밑에 또는 주름에서 찾아낸다기 때문에, 수를 얻기 위하여 각 개별 종이를 전개하는 것을 요구하는 oviposition를 위한 표면으로 젖은 필터 종이를 계속 이용하기 위하여 계속합니다. 그들의 프로토콜은 또한 화상 진찰 기술의 사용 또는 애벌레 계산을 위한 방법을 포함하지 않았습니다.

제시는 달걀 번호 (즉, fecundity)와 해치 비율 (즉, 불임)에 대한 적합성 애서를 수행하는 향상된 방법입니다 (즉, 불임) agarose를 사용하여 oviposition 표면으로 24 잘 조직 배양 플레이트 포맷으로 ae. aegypti는 습한 표면에 배란하는 aegypti. 이 플레이트는 Egg, 아가 로즈 및 L아르바에서 "EAgaL"플레이트로 명명되었습니다. 이 24 개의 웰 플레이트는 개별 모기에게 알을 낳기 위한 최소한의 표면을 제공하므로 며칠 동안 계란과 부화 된 애벌레를 계산하고 유지하는 데 필요한 시간과 노력을 단순화하고 크게 줄입니다. EAgaL 플레이트는 oviposition 표면에 반투명 아가로즈를 사용하며, 부화 시 계란 을 처리하고 계란과 애벌레를 찾을 필요가 없습니다. 각 웰을 촬영하는 것은 결과에 대한 장기 보관 된 기록을 설정하고 시간이 제한된 양육 / 처리 프로세스에서 시간과 공간 모두에서 계산 프로세스를 분리합니다.

프로토콜

1. 플레이트 준비

1. ~1.6mm(1/16in)비트(도 2)를가진 가정용 드릴을 사용하여 24개의 잘 조직 배양 플레이트 뚜껑(웰당 4~6홀)에 구멍을 뚫는 구멍을 뚫는다.
   참고: 이 구멍은 모기가 알을 낳을 수 있는 뚜껑에 축적되는 아가로즈에서 물 응축을 방지합니다. 여성 Ae. aegypti ("리버풀"변형)의 표준 크기는 ~ 3.11 mm 날개 길이입니다. 접시에서 탈출하지 않도록 작은 모기를 사용할 때 구멍의 크기를 줄이는 것이 좋습니다.
2. oviposition 실험 전날, 접시를 철저히 씻고 헹구고 실온에서 30-60 분 동안 1-5 % 표백제에 담급니다. 탈이온화된 물을 철저히 헹구고 건조시다.
   참고 : 이 과정은 아가로즈에서 성장하는 곰팡이와 박테리아의 기회를 감소시킵니다.
3. 용융 아가로즈를 2%로 탈온된 물에 넣고 1,000 μL 파이펫(도3A,B)을사용하여 24개의 웰 플레이트의 각 웰에 용융 아가로즈의 500 μL을 즉시 첨가합니다. 아가로즈가 식히고 파이펫 팁을 막히기 시작하면 아가로즈를 다시 가열하고 새 파이펫 팁을 사용합니다.
   참고: 여성이 알을 낳을 수 있는 벽에 아가로즈 조각을 남길 수 있기 때문에 파이펫 팁으로 우물의 벽을 만지지 말고 이미징과 계산 과정을 복잡하게 만듭니다.
4. 사용하기 전에 실험실 벤치(그림 3C,D)에서하룻밤 동안 우물 벽에 응축을 말리십시오.
   참고: 혈액 공급에서 유충 영상에 이르는 EAgaL 플레이트 분석의 타임라인은 식민지모기(Ae. aegypti "Liverpool")가 14h 빛:10h 의 어두운 빛 주기, 27°C, 80% 상대 습도, 500 개의 유충49.5cm x 29.2 cm 이하 의 29.2 cm 이하 의 수액 조건인 도4에 묘사됩니다. 각 실험실은 특히 다른 균주, 다른 모기 종뿐만 아니라 다른 양육 프로토콜을 사용할 때 모기가 사용되는 EAgaL 플레이트를 테스트하는 것이 좋습니다.

2. 모기 먹이주기

참고: 애벌레 영양이 모기 피트니스 파라미터^10,11에영향을 미치기 때문에 모든 치료 그룹 및 대조군을 위해 균일한 조건하에서 사육된 모기를 사용하는 것이 중요합니다. 충분한 음식과 혼잡하지 않은 조건에서 후면 애벌레. 여성 모기가 짝짓기가 보장되고 적어도 3 일 동안 성숙되도록 남성의 면전에서 닫아 두십시오.

1. 혈액 공급을 강화하기 위하여 혈액 공급하기 전에 적어도 16 시간 전에 여성 모기에서 물 및/또는 설탕의 어떤 근원든지 제거하십시오.
2. 인공 공급에 대한 물 순환기를 37°C에서 가열하고 15-30 분(그림 5A)에대한 인공 공급에 배치 척추 혈액을 사용하여 여성 모기를 공급합니다.
3. CO₂ 또는 얼음으로 모기를 마취시키고, 얼음 에 유리 접시로 옮기고, 암컷이 배설및 계란 발달을 마칠 때 72 시간 이상 30 % 자당 수를 제공하는 용기에 혈액(그림 5B)으로채광된 모기를 선택합니다.
   참고: 암컷이 자당물의 농도가 낮을 경우, 48시간 이후에 자당수와 젖은 표면을 제거하여 암컷이 배란되는 것을 방지하십시오.

3. 오비포지션

1. 모기를 접시에 옮기기 전에 약 1시간 전에, 이송 파이펫을 사용하여 각 플레이트에 2-3 방울(~80-120 μL)의 물을 넣습니다.
2. 적어도 72 h 혈액 먹이 후, CO₂ 또는 얼음에 모기를 녹여, 얼음에 유리 접시에 전송, 개별적으로 얼음에 24 우물 접시의 반전 뚜껑에 각 모기를 배치(그림 6A).
   참고 : 이 절차는 Ioshino 외^9에서적용되었습니다.
3. 모든 24 개의 모기가 배치되면, 반전 플레이트 바닥(도 6B)로뚜껑을 덮고, 신선한, 새로운 고무 밴드와 함께 뚜껑과 접시를 고정하고 환경 챔버 (또는 양육 실)에 배치 (또는 양육 실)(도 6C)모기가 복구 할 때까지 (~10-15 분) 및 플레이트 오른쪽 을 위로 돌려(그림 6D).
4. 암컷 모기가 24-48h에 대한 배란을 허용하고 큰 케이지에 접시에서 그들을 해제하여 여성을 제거합니다.
   참고: 개별 여성을 추적하는 것이 중요하다면 판을 식히면 마취하고 얼음 위에 개별적으로 제거하십시오. 지연된 oviposition 및 계란 계산을 방해하는 어두운 배설물은 암컷이 72h 의 혈액 후 식사(PBM)(그림 7D)보다일찍 접시로 옮겨졌을 때 관찰되었다.

4. 계란 계수

1. 때때로 모기가 우물의 벽과 사진에서 해결하기 어려운 아가로즈 / 플라스틱 표면의 여백에 알을 낳는 것처럼 24 개의 우물각우물을 확인하십시오. 젖은 페인트 브러시를 사용하여 아가로즈의 벽과 가장자리에 놓인 알을 아가로즈의 평평한 표면으로 이동하여 모든 계란이 균일 한 평면에 있고 서로 겹치지 않도록합니다.
   참고: 아가로즈의 가장자리는 일반적으로 아가로즈 용액의 표면 장력으로 인해 카메라의 초점 평면에서 벗어났습니다.
2. 집게를 사용하여, 화상 진찰 계란을 방해할 수 있는 우물에 있는 부러진 다리, 날개 및 그밖 입자를 제거합니다(그림 7C).
3. 스테레오현미경 조명기(그림7A)를사용하여 이미징하기 전에 어두운 모기 계란과의 대비를 높이기 위해 접시 아래에 백서를 삽입합니다.
4. 현미경 모드에서 컴팩트한 디지털 카메라를 사용하여 각 웰의 이미지를 가져 가므로 사용자가 1cm 에 가까운 물체에 집중할 수 있습니다. 이 기능을 통해 카메라를 플레이트에 직접 배치하여 삼각대 나 스탠드없이 계란을 이미지할 수있습니다(그림 7A). 덩어리에 놓인 개별 계란을 구별하려면 미세하거나 미세한 모드를 사용하여 고해상도 이미지를 캡처하여 클로즈업 세부 사항을 볼 수 있습니다.
   참고: 새 이미지와 이전 이미지 간의 혼동을 방지하기 위해 사용하기 전에 카메라의 메모리 카드를 지웁습니다.
5. 플레이트의 각 웰을 촬영한 후, 이미징 주문 라벨로 플레이트 전체의 이미지를 촬영하여 나중에 각 플레이트를 구별합니다(그림7E).
6. 아가로즈 플러그와 알이 건조되는 것을 방지하고 배아 발달 및 부화를 유도하기 위해 각 우물에 이송 파이펫이 있는 얇은 층 ~5방울의 물(~200 μL)을 추가합니다. 처음 몇 시간 동안 수분에주의를 기울이고 아가로즈 또는 증발에 의한 흡수로 인한 수분 손실이 있을 수 있기 때문에 매일 확인하십시오. 유충이 부화하기에 는 레벨이 너무 낮을 때 물을 추가합니다.
   참고: 물의 증발은 접시 내에서 플레이트 내에서 그리고 플레이트 더미 내에서 균일하게 발생합니다. 건조는 다음과 같은 순서로 발생하는 것으로 관찰되었습니다 : 1) 코너 우물 (A1, A6, D1, D6)이 가장 빨리 건조; 플레이트의 바깥쪽 가장자리에 2) 우물 (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); 그리고 마지막 3) 내부 우물. 플레이트가 쌓이면 상단 플레이트가 가장 빨리 건조됩니다.
7. ImageJ (피지)와 컴퓨터에 이미지를 전송하고 "[플레이트 ID]_[잘 ID].jpg"[그림8A,B)와같은 쉬운 조직을 위해 파일이름을 변경합니다.
8. 스프레드시트 파일을 만들어 계란 번호(즉, fecundity)와 애벌레 숫자를 기록하고 해치 율(즉, 다산)을계산합니다(예: 도 9E).
9. ImageJ (피지)^12와 이미지를 열고 각 계란을 표시하는"멀티 포인트"도구를 사용(그림 9A−C); "+" 또는"–"덩어리로 계란을 계산하는 키"를 사용하여 확대 또는 축소. 모든 계란을 표시 한 후, 마크의 수를 제기하기 위해 멀티 포인트 아이콘을 두 번 클릭(그림 9D). 결과를 스프레드시트에 기록합니다.

5. 불임 평가

참고 : 2 일 만에 첫 번째 인스타 애벌레가 우물에서 닫히기 시작할 수 있습니다. 모든 실행 가능한 계란이 부화되도록 이미징 / 카운트 전에 3-5 일을 더 기다립니다.

1. 20mL의 물에 1/16 스푼(~168 mg)의 육수 사료(즉, 일반 모기 애벌레 다이어트)를 혼합하여 큰 고체 입자가 정착하기를 기다리며 애벌레 음식을 준비합니다(그림10A−D). 음식없이 오랫동안 살아남지 못하기 때문에 부화 된 애벌레가 있는 우물에 음식 (상체)을 추가하십시오.
   참고: 음식 입자를 과도하게 첨가하여 부화된 애벌레의 이미징 및 계수를 방해할 수 있습니다.
2. 우물에 물을 첨가한 후 약 5-8일 후에 는 15-20분 동안 분쇄된 얼음으로 덮어 유충을 마취시켜 접시를 식힙니다.
3. 계란과 마찬가지로 접시를 얼음 위에 두면서 각 우물의 이미지를 가져 가라. 애벌레 이미지의 경우, 대비를 향상시키기 위해 접시 아래에 검은 색 재료를 삽입하여 어두운 배경을 제공합니다. 접시의 각 웰을 촬영 한 후, 나중에 각 플레이트를 구별하는 이미징 주문 라벨전체 플레이트의 이미지를 가져 가라.
   참고: 절제운동이 계산을 손상시킬 수 있기 때문에 접시가 얼음 위에 있는 동안 이미지를 촬영합니다. 플레이트는 재사용 가능합니다. 동결 하 고 다음 사용을 위해 청소 모기와 아가로즈를 제거 합니다. EAgaL 플레이트는 애벌레를 고급 단계로 사육하는 데 적합하지 않습니다.
4. ImageJ (피지)와 이미지를 열고 각 애벌레를 클릭하여 계산하는"멀티 포인트"도구를사용합니다. 3-5 일 기간 동안 일부 애벌레는 특히 유충의 낮은 수와 우물에서, 몰이 되었을 수 있습니다. 따라서, 계산할 때, 몸의 약간머리 전용 애벌레처럼 보이는 창고 큐티클(즉, 엑설비아)을 제외하거나, 수축된 애벌레(도10E)를제외한다. 결과를 스프레드시트에 기록합니다.

6. 분석 수행

1. fecundity 및 불임 분석에 필요한 모든 데이터를 수집한 결과 적절한 통계 분석을 수행하고 선호하는 소프트웨어를 사용하여 그래프를 작성합니다.

결과

모기는 전술한 절차에 따라 후보철 수송기(FeT) 또는 대조군 유전자(EGFP), 혈액 공급, EAgaL 플레이트 방법을 이용한 fecundity 및 불임 출력을 측정한 dsRNA를 주입하였다.

DsRNA 주사에 따라 FeT 발현이 침묵된 모기는 계란 수와 해치 비율 모두에서 현저한 감소를나타냈다(도 11A-C). 모든 제어 및 치료 모기는 72 h PBM 후 EAgaL 플레이트에 배치되었다. 태?...

토론

EAgaL 플레이트는 FT 방법에 비해 Aedes aegypti에서 개별 적인 fecundity 및 불임 검사를 수행하기 위해 노동, 시간 및 공간을 크게 줄입니다. FT 방법과 EAgaL 플레이트 간의 예비 비교결과 모든 단계(영상 기술이 FT 방법에 적용되었다)(표1)에대한 짧은 시간.. 참고로, 시작 및 분석당 추정치(24개의 웰 EAgaL 플레이트 대 24FT)의 비용은 표 2에제공됩니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188