24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri

Özet

Açıklanan, yumurtaları saymak ve 24 kuyu doku kültürü plakası kullanarak bireysel sivrisineklerin kuluçka oranlarını belirlemek için zaman ve yerden tasarruf sağlayan bir yöntemdir, bu da doğurganlık ve doğurganlık testlerinin ölçeğini ve hızını önemli ölçüde artırabilir.

Özet

Sivrisinekler, çeşitli patojenlerin vektörleri olarak önemli bir halk sağlığı sorununu temsil eder. Sivrisinek fitness parametrelerinin, özellikle yumurta üretimi ve kuluçka oranlarının bireysel düzeyde değerlendirilmesini gerektiren çalışmalar için, geleneksel yöntemler yüksek iş yoğunluğu ve laboratuvar alanı gereksinimleri nedeniyle araştırmacılara önemli bir yük yüklemektedir. Açıklanan, yumurta sayılarını ve kuluçka oranlarını önemli ölçüde azaltılmış zaman ve alan gereksinimleri ile bireysel düzeyde belirlemek için her kuyuda agarose ve her kuyunun dijital görüntülemesine sahip 24 kuyu doku kültürü plakası kullanan basit bir yöntemdir.

Giriş

İnsanları vektör kaynaklı patojenlerden korumak için sivrisineklerin kontrolü, esas olarak sivrisinekler tarafından taşınan patojenlerin çoğu için etkili aşıların bulunmaması nedeniyle önemli bir halk sağlığı hedefidir. Birçok çalışma, sahada uygulanabilir bir nüfus azaltma stratejisi 1 ,^2,3ile birlikte sivrisinek kondisyonlarını azaltmayı amaçlamaktadır. Bu, transgenik sivrisinekler ve / veya CRISPR / Cas9 nakavt hatları oluşturmak için kapsamlı çalışmaları içerir. Bu tür popülasyon modifikasyon yaklaşımları, bireysel fitness parametrelerinin ayrıntılı bir değerlendirmesini gerektirir⁴. Dişi sivrisineklerin kondisyonunu değerlendirmek için geleneksel laboratuvar teknikleri, 100 mL kaplarda çift, kanla beslenen dişi sivrisineklerin^5,modifiye edilmiş 50 mL konik tüplerde veya yumurtlama için nemli pamuk ve filtre kağıt diskleri kullanılarak nemli yüzeyler sağlanarak modifiye edilen Drosophila yetiştirme tüplerinin (yani yumurta kağıtları)^1,2,6,7.'ninayrı ayrı muhafazasını içerir. Bu tür yöntemler nispeten geniş bir alan gerektirir (örneğin, 30 cm x 30 cm x 10 cm: 100 Drosophila tüpü için W x L x H) (Şekil 1) ve tek tek yumurta kağıtlarının, emek yoğun olabilecek yumurta ve kuluçka larvalarını saymak için manipülasyonu. Bu makale, sivrisinek yumurtalarını saymak ve bu sorunları atlatmak için bir yumurtlama yüzeyi olarak 24 kuyu plakası ve agarose kullanarak yumurtadan çıkma oranlarını belirlemek için bir yöntem sunar⁸.

Aynı anda, Ioshino ve ark.^9, bireysel dişilerden elde edilen yumurta sayımını gerçekleştirmek için 12 ve 24 kuyu plakaları kullanarak ayrıntılı bir yöntem tanımladı. Protokolleri, zaman ve mekandan tasarruf^9'dageleneksel yöntemlerden önemli bir gelişmeyi temsil etti. Bununla birlikte, tarif ettikleri protokol, ıslak filtre kağıdını yumurtlama için bir yüzey olarak kullanmaya devam eder, bu da yumurtalar genellikle altında veya kıvrımlarda bulunduğundan, sayımları almak için her bir kağıdın açılmasını gerektirir. Protokolleri ayrıca görüntüleme teknolojilerinin kullanımını veya larva sayımı için bir yöntemi içermede değildi.

Sunulan yumurta sayısı (yani, doğurganlık) ve yumurtadan çıkma oranı (yani doğurganlık) için uygunluk testlerini yapmak için geliştirilmiş bir yöntemdir, agarose'un nemli yüzeylerde ovipoz yapan Ae. aegypti için 24 kuyu doku kültürü plakası formatında bir yumurtlama yüzeyi olarak kullanılması. Bu plakalar E gg, Agarose ve Larva'dan "EAgaL"plakaları olarak adlandırıldı. Bu 24 kuyu plakası, bireysel sivrisineklere yumurta bırakmak için minimum bir yüzey sağlar, böylece yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları birkaç gün boyunca saymak ve sürdürmek için gereken zamanı ve çabayı basitleştirir ve büyük ölçüde azaltır. EAgaL plakası, yumurta kağıtlarını taşıma ve yumurtadan çıktığında yumurta ve larvaları bulma ihtiyacını ortadan kaldırır; her kuyunun fotoğraflandırılması, sonuçların uzun süreli arşivlenmiş bir kaydını oluşturur ve hem zaman hem de mekandaki sayım işlemini, zamanın genellikle sınırlı olduğu yetiştirme / taşıma işleminden ayırır.

Protokol

1. Plaka hazırlama

1. ~1,6 mm (1/16 giriş) uçlu bir ev matkabı kullanarak 24 kuyu doku kültürü plaka kapağında (kuyu başına 4−6 delik) delikler açın (Şekil 2).
   NOT: Bu delikler, sivrisineklerin yumurta bırakabileceği kapakta birikmesi için agarosedan su yoğuşmasını önler. Dişi Ae. aegypti'nin ("Liverpool" suşu) standart boyutu ~ 3.11 mm kanat açıklığıdır. Plakadan kaçmamak için daha küçük sivrisinekler kullanırken deliklerin boyutunun azaltılması önerilir.
2. Yumurtlama deneyinden bir gün önce plakaları iyice yıkayın ve durulayın ve oda sıcaklığında 30−60 dakika boyunca% 1−5 çamaşır suyuna batırın. Akan deiyonize suyun altında iyice durulayın ve kurutun.
   NOT: Bu işlem agarose üzerinde mantar ve bakteri büyüme şansını azaltır.
3. İyonize suda % 2 oranında agaroz eritin ve hemen 1.000 μL pipet kullanarak 24 kuyu plakasının her kuyusuna 500 μL erimiş agarose ekleyin (Şekil 3A,B). Agarose soğumaya ve pipet ucunu tıkamaya başladığında, agarose'yi yeniden ısıtın ve yeni bir pipet ucu kullanın.
   NOT: Kuyunun duvarlarına pipet ucuyla dokunmaktan kaçının, çünkü duvarda bir dişinin yumurta bırakabileceği bir agarose parçası bırakabilir, görüntüleme ve sayım işlemini zorlaştırabilir.
4. Kullanmadan önce, kuyu duvarlarındaki yoğuşmaları bir laboratuvar tezgahında bir gecede kurutun(Şekil 3C,D).
   NOT: EAgaL plaka tahlilinin kan beslemeden larva görüntülemeye kadar zaman çizelgesi Şekil 4'te tasvir edilir, bu da koloni sivrisinekleri içindir(Ae. aegypti "Liverpool" 14 saat ışık altında yetiştirilen:10 h karanlık ışık döngüsü, 27 °C, 80% bağıl nem, 500 larva 49.5 cm x 29.2 cm x 9.5 cm tepside 2 L su ile), böcek koşulları altında. Her laboratuvarın EAgaL plakasını, özellikle farklı suşlar, farklı sivrisinek türleri ve farklı yetiştirme protokolleri kullanırken kullanılan sivrisineklerle test ettiği önerilir.

2. Sivrisinek besleme

NOT: Tüm tedavi grupları ve kontrol grupları için tek tip koşullar altında yetiştirilen sivrisineklerin kullanılması önemlidir, çünkü larva beslenmesi sivrisinek fitness parametreleri üzerinde bir etkiye sahiptir^10,11. Yeterli yiyecek ile kalabalık olmayan koşullar altında arka larvalar. Dişi sivrisineklerin erkeklerin varlığında ekskose olmasına izin verin, böylece çiftleşme sağlanır ve en az 3 gün olgunlaşır.

1. Kan beslemeyi arttırmak için kan beslemeden en az 16 saat önce dişi sivrisineklerden herhangi bir su ve/ veya şeker kaynağını çıkarın.
2. Yapay beslenme için bir su sirkülatörünü 37 °C'de ısıtın ve yapay besleyicilere yerleştirilen omurgalı kanı kullanarak dişi sivrisinekleri 15−30 dk boyunca besleyin (Şekil 5A).
3. Sivrisinekleri CO₂ veya buz üzerinde uyuşturun, buz üzerinde bir cam tabağa aktarın ve kanla kaplanmış olanları seçin (Şekil 5B) dişiler atılımı ve yumurta gelişimini bitirdiğinde 72 saatten fazla% 30 sakkaroz suyu ile sağlanan bir kaba.
   NOT: Dişilere daha düşük bir sakkaroz suyu konsantrasyonu sağlanırsa, dişilerin ovipositing yapmasını önlemek için sakkaroz suyunu ve ıslak yüzeyleri 48 saat sonra çıkarın.

3. Yumurtlama

1. Sivrisinekleri plakalara aktarmadan yaklaşık 1 saat önce, bir transfer pipet kullanarak her tabağa 2−3 damla (~80−120 μL) su ekleyin.
2. Kan beslemeden sonra en az 72 saat, CO₂ veya buz üzerinde nakavt sivrisinekleri, buz üzerinde bir cam tabağa aktarın ve her sivrisinekleri ayrı ayrı buz üzerindeki 24 kuyu plakasının ters kapağına yerleştirin (Şekil 6A).
   NOT: Bu prosedür Ioshino ve ark.^9'danuygulanmıştır.
3. 24 sivrisinek de yerleştirildikten sonra, kapağı ters bir plaka tabanıyla kapatın (Şekil 6B), kapağı ve plakayı taze, yeni bir lastik bantla sabitleyin ve sivrisinekler iyileşene (~10−15 dk) ve plakayı sağ tarafa çevirene kadar bir çevre odasına (veya yetiştirme odasına) yerleştirin (Şekil 6C).
4. Dişi sivrisineklerin 24−48 saat boyunca ovipoz yapmasına izin verin ve dişileri plakalardan büyük bir kafese bırakarak çıkarın.
   NOT: Tek tek kadınları takip etmek önemliyse, plakaları soğutarak uyuşturun ve buz üzerinde ayrı ayrı çıkarın. Dişiler 72 saat kan unu sonrası (PBM) daha erken tabaklara aktarıldığında yumurta sayımını engelleyen gecikmiş yumurtlama ve koyu atılımlar gözlenmiştir(Şekil 7D).

4. Yumurta sayımı

1. 24 kuyu plakasının her kuyuyu kontrol edin, çünkü bazen sivrisinekler kuyuların duvarına ve fotoğraflarda çözülmesi zor olan agarose / plastik yüzeyin kenar boşluğuna yumurta bırakırlar. Islak bir boya fırçası kullanarak, agarose duvarına ve kenarına bırakılan yumurtaları agarozun düz yüzeyine taşıyın, böylece tüm yumurtalar düzgün bir düzlemdedir ve birbirleriyle örtüşmez.
   NOT: Agarose çözeltisinin yüzey gerilimi nedeniyle agarose'un kenarı genellikle kameranın odak düzleminin dışındadır.
2. Forseps kullanarak, kuyulardaki yumurtaları görüntülemeye engel olabilecek kırık bacakları, kanatları ve diğer parçacıkları çıkarın (Şekil 7C).
3. Stereomikroskop aydınlatıcı kullanarak görüntülemeden önce koyu sivrisinek yumurtaları ile kontrastı artırmak için plakanın altına beyaz kağıt yerleştirin (Şekil 7A).
4. Kullanıcının 1 cm'ye yakın nesnelere odaklanmasını sağlayan mikroskop modunda kompakt bir dijital kamera kullanarak her kuyunun bir görüntüsünü alın. Bu özellik, kameranın tripod veya stand olmadan yumurtaları görüntülemesi için doğrudan plakaya yerleştirilmesini sağlar (Şekil 7A). Kümeler halinde bırakılan yumurtaları ayırt etmek için, yakın çekim ayrıntıların görülebilmesi için yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalamak için ince veya süper ince modu kullanın.
   NOT: Yeni ve eski görüntüler arasındaki karışıklığı önlemek için kullanmadan önce kameranın bellek kartını temizleyin.
5. Bir plakanın her kuyusunun fotoğrafını çektikten sonra, daha sonra her plakayı ayırt etmek için bir görüntüleme sırası etiketi ile tüm plakanın bir görüntüsünü alın (Şekil 7E).
6. Agarose fişinin ve yumurtaların kurumasını önlemek ve embriyo gelişimini ve kuluçkalanmasını teşvik etmek için her kuyuya bir transfer pipet ile ince bir tabaka ~ 5 damla su (~ 200 μL) ekleyin. İlk birkaç saat su seviyelerine dikkat edin ve her gün kontrol edin, çünkü agarose veya buharlaşma tarafından emilimi nedeniyle su kaybı olabilir. Seviyesi larvaların yumurtadan çıkması için çok düşük olduğunda su ekleyin.
   NOT: Suyun buharlaşması hem bir plaka içinde hem de bir plaka yığını içinde eşit olmayan bir şekilde gerçekleşir. Kurutmanın aşağıdaki sırayla gerçekleştiği görülmüştür: 1) köşe kuyuları (A1, A6, D1, D6) en hızlı kurur; ardından plakanın dış kenarındaki 2) kuyular (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); ve son 3) kuyular içinde. Plakalar istiflendiğinde, üst plaka en hızlı kurur.
7. Görüntüleri ImageJ (Fiji) içeren bir bilgisayara aktarın ve "[plaka kimliği]_[iyi kimlik].jpg" ( Şekil8A,B)gibi daha kolay organizasyon için dosyaları yeniden adlandırın.
8. Yumurta numaralarını (yani doğurganlık) ve larva sayılarını kaydetmek ve tarama oranını (yani doğurganlık) hesaplamak için bir elektronik tablo dosyası oluşturun (Şekil 9E).
9. Görüntüleri ImageJ (Fiji)¹² ile açın ve her yumurtayı işaretlemek için "çok noktalı" aracını kullanın (Şekil 9A−C); yumurtaları kümeler halinde saymak için "+" veya "–" tuşunu kullanarak yakınlaştırma veya uzaklaştırma. Tüm yumurtaları işaretledikten sonra, işaret sayısını(Şekil 9D)getirmek için çok noktalı simgeyi çift tıklatın. Sonuçları bir elektronik tabloya kaydedin.

5. Doğurganlık değerlendirmesi

NOT: 2 gün içinde, ilk başlangıç larvaları kuyularda inclose olmaya başlayabilir. Tüm uygun yumurtaların yumurtadan çıktığından emin olmak için görüntülemeden/saymadan önce 3−5 gün daha bekleyin.

1. 20 mL suda 1/16 yemek kaşığı (~168 mg) öğütülmüş balık yemi (yani normal sivrisinek larva diyeti) karıştırarak ve büyük katı parçacıkların yerleşmesini bekleyerek larva yiyecekleri hazırlayın (Şekil 10A−D). Yumurtadan çıkmış larvaları içeren kuyulara yiyecek (süpernatant) eklemeye başlayın, çünkü yiyeceksiz uzun süre hayatta kalamazlar.
   NOT: Gıda parçacıklarının fazla eklenmesi, yumurtadan çıkmış larvaların görüntülenmesini ve sayımını engelleyebilir.
2. Kuyulara su ilave edildikten yaklaşık 5-8 gün sonra, larvaları uyuşturmak için 15−20 dakika boyunca ezilmiş buzla kaplayarak plakayı soğutun.
3. Yumurtalarda olduğu gibi tabakları buzda tutarken her kuyunun görüntülerini alın. Larva görüntüleri için, kontrastı artırmaya yardımcı olmak için plakanın altına siyah bir malzeme ekleyerek karanlık bir arka plan sağlayın. Bir plakanın her kuyusunun fotoğrafını çektikten sonra, daha sonra her plakayı ayırt etmek için bir görüntüleme sırası etiketiyle tüm plakanın bir görüntüsünü alın.
   NOT: Larva hareketi sayımı tehlikeye atabileceğinden, plakalar buz üzerindeyken görüntüler alınır. Plakalar yeniden kullanılabilir; bir sonraki kullanım için temizlemek için sivrisinekleri ve agarose'ları dondurun ve çıkarın. EAgaL plakası larvaları ileri aşamalara yetiştirmek için uygun değildir.
4. ImageJ (Fiji) ile görüntüleri açın ve her larvaya tıklayarak saymak için "çok noktalı" aracını kullanın. 3−5 günlük süre boyunca bazı larvalar, özellikle düşük sayıda larvaya sahip kuyularda erimiş olabilir. Bu nedenle, sayarken, biraz vücuda sahip sadece kafaya benzeyen döken kütikülleri (yani exuviae) veya küçülmüş larvaları hariç tutun (Şekil 10E). Sonuçları elektronik tabloya kaydedin.

6. Analiz yapın

1. Doğurganlık ve doğurganlık analizi için gerekli tüm verileri topladıktan sonra, uygun istatistiksel analizleri yapmak ve tercih edilen yazılımı kullanarak grafikler oluşturmak.

Sonuçlar

Sivrisineklere, yukarıda açıklanan prosedürü izleyerek, bir aday demir taşıyıcı (FeT) veya kontrol geni (EGFP) hedef alan dsRNA enjekte edildi ve EAgaL plaka yöntemi kullanılarak doğurganlık ve doğurganlık çıktısı için ölçüldü.

DSRNA enjeksiyonundan sonra FeT ekspresyonuna sessiz kalınan sivrisinekler hem yumurta sayısında hem de kuluçka oranında önemli bir azalma gösterdi (Şekil 11A−C). Tüm kontrol ve tedavi siv...

Tartışmalar

EAgaL plakası, FT yöntemine kıyasla Aedes aegypti'de bireysel doğurganlık ve doğurganlık tahlilleri yapmak için işgücünü, zamanı ve alanı büyük ölçüde azaltır. FT yöntemi ile EAgaL plakası arasındaki ön karşılaştırma, tüm adımlar için daha kısa sürelere neden oldu (FT yöntemine görüntüleme tekniği uygulandı) (Tablo 1). Referans olarak, tablo 2'debaşlangıç ve test başına (bir 24 kuyu EAgaL plakasına karşı 24 FT) maliyetlerin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188