מבחני פוריות ופוריות משופרים עבור Aedes aegypti באמצעות 24 צלחות תרבית רקמה באר (צלחות EAgaL)

Summary

המתואר הוא זמן ושיטת חיסכון במקום לספור ביצים ולקבוע את שיעורי הצוהר של יתושים בודדים באמצעות 24 גם צלחות תרבית רקמה, אשר יכול להגדיל באופן משמעותי את קנה המידה ואת המהירות של פוריות ופוריות מבחני.

Abstract

יתושים מייצגים בעיה משמעותית בבריאות הציבור כווקטורים של פתוגנים שונים. עבור אותם מחקרים הדורשים הערכה של הפרמטרים כושר יתושים, במיוחד ייצור ביצים ושיעורי הצוהר ברמה האישית, שיטות קונבנציונליות יש לשים נטל משמעותי על החוקרים בשל אינטנסיביות עבודה גבוהה ודרישות חלל מעבדה. המתואר היא שיטה פשוטה באמצעות 24 צלחת תרבית רקמה היטב עם agarose בכל באר הדמיה דיגיטלית של כל באר כדי לקבוע את מספרי הביצים ואת קצבי הצוהר ברמה האישית עם דרישות זמן ומרחב מופחת באופן משמעותי.

Introduction

השליטה של יתושים כדי להגן על בני אדם מפני פתוגנים המועברים על ידי וקטורים היא מטרה חשובה לבריאות הציבור, בעיקר בשל היעדר חיסונים יעילים עבור רוב הפתוגנים הנישאים על ידי יתושים. מחקרים רבים שואפים להפחית את כושר היתושים בשילוב עם אסטרטגיה להפחתת אוכלוסייה ישימה בשטח^1,2,3. זה כולל מחקרים מקיפים ליצירת יתושים מהונדסים ו/או קווי נוקאאוט CRISPR/Cas9. גישות שינוי אוכלוסייה כאלה דורשות הערכה מפורטת של פרמטרי כושר אישיים⁴. טכניקות מעבדה קונבנציונליות כדי להעריך את הכושר של יתושים נקבה כולל את ההכלה האישית של יתושים נקבה מזווגת, שניזונו בדם במיכלי 100 מ"ל⁵, צינורות חרוטים שונה 50 מ"ל, או צינורות לגידול Drosophila שונה על ידי מתן משטחים לחים באמצעות כותנה לחה דיסקים נייר מסנן עבור oviposition (כלומר, ניירות ביצה)^1,2,6,7. שיטות כאלה דורשות מרחב גדול יחסית (למשל, 30 ס"מ x 30 ס"מ x 10 ס"מ: W x L x H עד 100 צינורות דרוסופילה) (איור 1),ומניפולציה של ניירות ביצה בודדים לספירת ביצים וזחלים בוקעים, אשר יכול להיות עבודה אינטנסיבית. כתב יד זה מציג שיטה לספור ביצי יתושים ולקבוע את קצב הפתח באמצעות 24 לוחות באר ו agarose כמשטח oviposition לעקוף את הנושאים האלה⁸.

במקביל, Ioshino et al.⁹ תיאר שיטה מפורטת באמצעות 12 ו 24 צלחות באר לבצע ספירת ביצים המתקבל נקבות בודדות. הפרוטוקול שלהם ייצג שיפור משמעותי משיטות קונבנציונליות בחיסכון בזמן ובמרחב⁹. עם זאת, הפרוטוקול שהם תיארו ממשיך להשתמש בנייר סינון רטוב כמשטח עבור oviposition, אשר דורש נפרש כל נייר בודדים כדי לקבל ספירות, כמו ביצים נמצאים לעתים קרובות מתחת או בקפלים. הפרוטוקול שלהם גם לא כלל שימוש בטכנולוגיות הדמיה או שיטה לספירת זחלים.

מוצג היא שיטה משופרת לבצע מבחני כושר עבור מספר הביצה (כלומר, פוריות) ואת קצב הצוהר (כלומר, פוריות) באמצעות agarose כמשטח oviposition בפורמט 24 צלחת תרבות רקמה היטב עבור Ae. aegypti כי oviposit על משטחים לחים. צלחות אלה נקראו "EAgaL" צלחות, מ Egg, אגא עלה,ו Larva. 24 צלחות באר אלה מספקות ליתושים בודדים משטח מינימלי להטיל ביצים, ובכך מפשטות ומפחיתות באופן דרסטי את הזמן והמאמץ הדרושים כדי לספור ולתחזק ביצים וזחלים בקעו במשך כמה ימים. צלחת EAgaL משתמשת agarose שקוף עבור פני השטח oviposition, אשר מבטל את הצורך בטיפול ניירות ביצה ומציאת הביצים הזחלים כאשר בקעו; צילום כל באר קובע תיעוד ארכיוני ארוך טווח של התוצאות ומפריד את תהליך הספירה הן בזמן והן בחלל מתהליך גידול /טיפול, שבו הזמן מוגבל לעתים קרובות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת צלחת

1. קידוח חורים ב-24 מכסי לוחות רקמות (4-6 חורים לבאר) באמצעות מקדחה ביתית עם סיבית של ~ 1.6 מ"מ (1/16 אינץ')(איור 2).
   הערה: חורים אלה מונעים עיבוי מים מן agarose לצבור על המכסה, שבו יתושים עשויים להטיל ביצים. הגודל הסטנדרטי של נקבת Ae. aegypti (זן "ליברפול") הוא ~ 3.11 מ"מ מוטת כנפיים. צמצום גודל החורים מומלץ בעת שימוש יתושים קטנים יותר כדי למנוע בריחה מהצלחת.
2. ביום שלפני הניסוי oviposition, לשטוף ולשטוף את הצלחות ביסודיות להשרות אותם 1-5% אקונומיקה במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף היטב תחת מים שעברו דה-יון ולייבש אותם.
   הערה: תהליך זה מקטין את הסיכוי של פטריות וחיידקים גדל על agarose.
3. ממיסים אגרוז ב-2% במים שעברו דה-יון ומוסיפים מיד 500 μL של ההתעוררות המותכת לכל באר של 24 לוחות הבאר באמצעות פיפטה של 1,000 μL(איור 3A,B). כאשר agarose מתחיל להתקרר ולסתום את קצה פיפטה, לחמם מחדש את agarose ולהשתמש קצה פיפטה חדש.
   הערה: הימנע מנגיעה בקירות הבאר עם קצה פיפטה כי זה עלול להשאיר חתיכת agarose על הקיר שבו נקבה עלולה להטיל ביצים, לסבך את תהליך ההדמיה והספירה.
4. לפני השימוש, ייבשו כל עיבוי על קירות הבאר במשך הלילה על ספסל מעבדה(איור 3C,D).
   הערה: ציר הזמן של בדיקת צלחת EAgaL מהזנת דם להדמיית זחל מתואר באיור 4, המיועד ליתושים במושבה (Ae ). aegypti "ליברפול" גדל תחת 14 שעות אור:10 שעות מחזור אור כהה, 27 °C (60 °F), 80% לחות יחסית, 500 זחלים ב 49.5 ס"מ x 29.2 ס"מ x 9.5 ס"מ מגש עם 2 L של מים), בתנאים חרקים. מומלץ כי כל מעבדה לבדוק את צלחת EAgaL עם יתושים בשימוש, במיוחד בעת שימוש זנים שונים, מינים שונים יתושים, כמו גם פרוטוקולי גידול שונים.

2. האכלת יתושים

הערה: זה קריטי להשתמש יתושים שגודלו בתנאים אחידים עבור כל קבוצות הטיפול וקבוצות הבקרה, כי תזונה זחל יש השפעה על הפרמטרים כושר יתושים^10,11. זחלים אחוריים בתנאים לא צפופים עם מספיק מזון. תן יתושים נקבה eclose בנוכחות זכרים, כך הזדווגות מובטחת, ובוגר לפחות 3 ימים.

1. הסר כל מקור מים ו/או סוכר מהיתושים הנשיים לפחות 16 שעות לפני האכלת הדם על מנת לשפר את האכלת הדם.
2. מחממים סירקולטור מים להאכלה מלאכותית ב-37 מעלות צלזיוס ומאכילים יתושים נקביים באמצעות דם בעלי חוליות המוצב במאכילים מלאכותיים למשך 15-30 דקות(איור 5A).
3. הרדמה של יתושים עם CO₂ או על קרח, מעבירים אותם לצלחת זכוכית על קרח, ובוחרים יתושים עםדם (איור 5B)למיכל המסופק עם 30% מי סוכרוז ליותר מ-72 שעות, כאשר הנקבות מסיימות את הפרשת הביצים.
   הערה: אם הנקבות מסופקות עם ריכוז נמוך יותר של מים סוכרוז, להסיר את מי סוכרוז וכל משטחים רטובים לאחר 48 שעות כדי למנוע את הנקבות ovipositing.

3. אוביופוזיציה

1. כשעה לפני העברת יתושים ללוחות, מוסיפים 2-3 טיפות (~ 80-120 μL) של מים לתוך כל צלחת גם באמצעות פיפטה העברה.
2. לפחות 72 שעות לאחר האכלת דם, נפילת יתושים עם CO₂ או על קרח, מעבירים אותם לצלחת זכוכית על קרח, ומניחים בנפרד כל יתוש על מכסה הפוך של 24 צלחת הבאר על הקרח(איור 6A).
   הערה: הליך זה הוחל מ Ioshino ואח^'9.
3. לאחר שכל 24 היתושים הונחו, כסו את המכסה בתחתית צלחת הפוכה(איור 6B),אבטחו את המכסה והצלחת עם גומייה חדשה ורעננה והניחו אותה בתא סביבתי (או בחדר גידול)(איור 6C)עד שהיתושים יתאוששו (כ-10-15 דקות) וסובבו את הצלחת ימינה למעלה(איור 6D).
4. אפשרו לנקבות היתושים להיכנס ל-24-48 שעות ולהסיר נקבות על ידי שחרורן מהצלחות לכלוב גדול.
   הערה: אם חשוב לעקוב אחר נקבות בודדות, המרדים אותן על ידי צינון הצלחות והסרתן בנפרד על קרח. התעכבות והפרשות כהות המפריעות לספירת הביציות נצפו כאשר הנקבות הועברו ללוחות לפני 72 שעות לאחר ארוחת הדם (PBM)(איור 7D).

4. ספירת ביצים

1. בדוק כל באר של צלחת 24 היטב, כמו לפעמים יתושים להטיל ביצים על הקיר של בארות בשולי משטח agarose / פלסטיק, שם הם קשים לפתור בתצלומים. באמצעות מברשת צבע רטוב, להזיז את הביצים שהוטלו על הקיר ואת קצה agarose על פני השטח השטוחים של agarose כך שכל הביצים נמצאים במישור אחיד ולא חופפים אחד עם השני.
   הערה: קצה ההתעוררות נמצא בדרך כלל מחוץ למישור המוקד של המצלמה בשל מתח פני השטח של פתרון agarose.
2. בעזרת מלקחיים, יש להסיר את כל הרגליים, הכנפיים וחלקיקים אחרים בבארות שעלולים להפריע לביצי ההדמיה (איור 7C).
3. הכנס נייר לבן מתחת לצלחת כדי להגביר את הניגודיות עם ביצי יתושים כהות לפני ההדמיה באמצעות תאורת סטריאומיקרוסקופ(איור 7A).
4. צלם תמונה של כל באר באמצעות מצלמה דיגיטלית קומפקטית במצב מיקרוסקופ, המאפשרת למשתמש להתמקד באובייקטים עד 1 ס"מ. יכולת זו מאפשרת למקם את המצלמה ישירות על הצלחת כדי לדמות ביצים ללא חצובה או מעמד(איור 7A). כדי להבחין בין ביצים בודדות שהוטלו בגושים, השתמש במצב עדין או עדין במיוחד כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה כך שניתן יהיה לראות פרטי תקריב.
   הערה: נקה את כרטיס הזיכרון של המצלמה לפני השימוש כדי למנוע בלבול בין תמונות חדשות לתמונות ישנות.
5. לאחר צילום כל באר של צלחת, צלם תמונה של הצלחת כולה עם תווית סדר הדמיה כדי להבחין בין כל לוח מאוחר יותר(איור 7E).
6. הוסף שכבה דקה ~ 5 טיפות מים (~ 200 μL) עם פיפטה העברה לכל באר כדי למנוע תקע agarose שלה ואת הביצים ייבוש כדי לגרום להתפתחות העובר ובקעה. שים לב למפלס המים בשעות הראשונות ולבדוק כל יום, כי ייתכנו אובדן מים עקב ספיגה על ידי agarose או אידוי. מוסיפים מים כאשר המפלס שלהם נמוך מדי עבור זחלים לבקוע.
   הערה: אידוי מים מתרחש באופן לא אחיד הן בתוך צלחת והן בתוך ערימה של צלחות. זה נצפתה כי ייבוש מתרחשת בסדר הבא: 1) בארות פינה (A1, A6, D1, D6) לייבש את המהיר ביותר; ואחריו 2) בארות בקצה החיצוני של הצלחת (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); ואחרון 3) בארות בפנים. כאשר צלחות מוערמות, הלוח העליון מתייבש המהיר ביותר.
7. העבר את התמונות למחשב עם ImageJ (פיג'י) ושנה את שמות הקבצים עבור ארגון קל יותר כגון "[מזהה לוח]_[מזהה טוב].jpg" (איור 8A,B).
8. צור קובץ גיליון אלקטרוני כדי לתעד מספרי ביציות (כלומר, פוריות) ומספרי זחלים ולחשב את קצב הפתח (כלומר, פוריות) (איור 9E).
9. פתחו את התמונות בעזרת ImageJ (פיג'י)¹² והשתמשו בכלי "multi-point" כדי לסמן כל ביצה(איור 9A-C); הגדלה או הגדלה באמצעות מקש "+" או "-" כדי לספור את הביצים בגושים. לאחר סימון כל הביצים, לחצו פעמיים על הסמל מרובה הנקודות כדי להעלות את מספר הסימנים (איור 9D). רשום את התוצאות בגיליון אלקטרוני.

5. הערכת פוריות

הערה: בעוד יומיים, זחלי instar הראשון עשוי להתחיל eclose בבארות. המתן 3-5 ימים נוספים לפני הדמיה/ספירה כדי להבטיח שכל הביצים הקיימות יבקעו.

1. הכינו מזון זחלים על ידי ערבוב 1/16 כף (~ 168 מ"ג) של מזון דגים טחון (כלומר, דיאטת זחל יתושים רגילה) ב 20 מ"ל של מים ומחכה חלקיקים מוצקים גדולים להתיישב (איור 10A-D). התחל להוסיף מזון (supernatant) לבארות המכילות זחלים בקעו ברגע שהם מופיעים, כי הם לא שורדים זמן רב ללא מזון.
   הערה: תוספת עודפת של חלקיקי מזון עלולה להפריע להדמיה ולספירה של זחלים שבקעו.
2. כ 5-8 ימים לאחר הוספת מים לבארות, לקרר את הצלחת על ידי כיסוי עם קרח כתוש במשך 15-20 דקות כדי להרדים זחלים.
3. צלם כל באר תוך שמירה על הצלחות על הקרח כפי שנעשה עם הביצים. לתמונות זחל, ספקו רקע כהה על-ידי הוספת חומר שחור מתחת ללוח כדי לסייע בשיפור הניגודיות. לאחר צילום כל באר של צלחת, לצלם תמונה של הצלחת כולה עם תווית סדר הדמיה להבחין כל צלחת מאוחר יותר.
   הערה: תמונות נלקחות בזמן שהצלחות על הקרח מכיוון שתנועת הזחל עלולה לסכן את הספירה. הצלחות ניתנות לשימוש חוזר; להקפיא ולהסיר את היתושים ו agarose לנקות לשימוש הבא. צלחת EAgaL אינה מתאימה לגידול זחלים לשלבים מתקדמים.
4. פתח תמונות עם ImageJ (פיג'י) והשתמש בכלי " multi-point " כדי לספורעל-ידילחיצה על כל זחל. במהלך 3-5 ימים תקופה כמה זחלים אולי התכווצו, במיוחד בארות עם מספרים נמוכים של זחלים. לכן, בעת הספירה, אל תכלול את הקציצים (כלומר, exuviae), שנראים כמו זחלים ראש בלבד עם קצת גוף, או זחלים מכווצים (איור 10E). רשום את התוצאות בגיליון האלקטרוני.

6. בצע ניתוח

1. לאחר שאספתי את כל הנתונים הדרושים לניתוח פוריות ופוריות, בצע ניתוח סטטיסטי מתאים וצור גרפים באמצעות תוכנה מועדפת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

יתושים הוזרקו עם dsRNA מיקוד טרנספורטר ברזל מועמד (FeT) או גן בקרה (EGFP), דם מוזן, ונמדד עבור פוריות ותפוקת פוריות באמצעות שיטת צלחת EAgaL, בעקבות ההליך המתואר לעיל.

יתושים שבהם הושתק ביטוי FeT בעקבות הזרקת dsRNA הראו ירידה משמעותית הן במספר הביצים והן בקצב הפתחים (איור 11A-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

צלחת EAgaL מפחיתה באופן דרסטי את העבודה, הזמן והמרחב לביצוע מבחני פוריות ופוריות אישיים ב- Aedes aegypti בהשוואה לשיטת FT. השוואה ראשונית בין שיטת FT ללוח EAgaL הביאה לזמנים קצרים יותר עבור כל השלבים (טכניקת ההדמיה הוחלה על שיטת FT) (טבלה 1). כנקודת התייחסות, הערכה של עלויות ההפעלה וההפע?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188