JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا العمل طريقة المجهر التي تسمح بالتصوير الحي لخلية واحدة من الإشريكية القولونية لتحليل وتكميم السلوك العشوائي للدوائر الجينية الاصطناعية.

Abstract

يقدم البروتوكول الذي تم تطويره هنا أداة لتمكين تتبع الكمبيوتر لقسم الإشريكية القولونية ومستويات الفلورسنت على مدى عدة ساعات. تبدأ العملية بالفحص بحثا عن المستعمرات التي تعيش على الحد الأدنى من الوسائط ، على افتراض أن الإشريكية القولونية التي تؤوي البلازميد الصحيح هي وحدها القادرة على الازدهار في الظروف المحددة. وبما أن عملية بناء دوائر جينية كبيرة، تتطلب تجميع العديد من أجزاء الحمض النووي، فإن مكونات الدائرة غالبا ما توزع بين البلازميدات المتعددة بأعداد نسخ مختلفة تتطلب استخدام العديد من المضادات الحيوية. الطفرات في البلازميد يمكن أن تدمر نسخ جينات مقاومة المضادات الحيوية وتتداخل مع إدارة الموارد في الخلية مما يؤدي إلى نخر. يتم تعيين مستعمرة مختارة على طبق بيتري الزجاج القاع ويتم اختيار عدد قليل من الطائرات التركيز لتتبع المجهر في كل من المجال مشرق والمجالات الفلورية. يحافظ البروتوكول على تركيز الصورة لأكثر من 12 ساعة في ظل ظروف أولية لا يمكن تنظيمها ، مما يخلق بعض الصعوبات. على سبيل المثال، تبدأ الخلايا الميتة في التراكم في مجال تركيز العدسات بعد بضع ساعات من التصوير، مما يؤدي إلى تراكم السموم وطمس الإشارة وتسوسها. استنفاد المواد الغذائية يدخل عمليات التمثيل الغذائي الجديدة وتعيق الاستجابة المرجوة من الدائرة. درجة حرارة التجربة يقلل من تأثير الحث والمضادات الحيوية، والتي يمكن أن تلحق المزيد من الضرر موثوقية الإشارة. يتقلص الحد الأدنى من هلام الوسائط ويجفف ، ونتيجة لذلك يتغير التركيز البصري بمرور الوقت. طورنا هذه الطريقة للتغلب على هذه التحديات في الإشريكية القولونية، على غرار الأعمال السابقة التي تطور أساليب مماثلة للكائنات الدقيقة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الطريقة خوارزمية لتحديد إجمالي الضوضاء العشوائية في الخلايا غير المعدلة والمتغيرة ، حيث وجدت أن النتائج تتسق مع توقعات محلل التدفق كما هو موضح في معامل مماثل للاختلاف (CV).

Introduction

علم الأحياء التركيبي هو مجال متعدد التخصصات ظهر في العقد الماضي ويهدف إلى ترجمة مبادئ التصميم الهندسي إلى تصميم بيولوجي عقلاني1،2،3 ،فيمحاولةلتحقيق التكامل والمعالجة متعددة الإشارات في الخلايا الحية لفهم العلوم الأساسية4و5والتطبيقات التشخيصية والعلاجية والتكنولوجيا الحيوية6و7و8و9و10. لقد أحدثت قدرتنا على قياس استجابة المدخلات والمخرجات من دوائر الجينات الاصطناعية ثورة بسبب التقدم الأخير في تكنولوجيا الخلية الواحدة ، بما في ذلك محلل التدفق وتصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر الآلي الفاصل الزمني11. غالبا ما يستخدم محلل التدفق لقياس استجابة هذه الدوائر في الحالة الثابتة1،12، ويستخدم المجهر المقلوب لقياس الاستجابة الديناميكية للدوائر الجينية الاصطناعية على مستوى خلية واحدة3. على سبيل المثال، واحدة من الأعمال المبكرة في البيولوجيا الاصطناعية تنطوي على بناء شبكات المذبذب الجيني في الخلايا الحية باستخدام حلقات التغذية المرتدة السلبية مع تأخير3. في وقت لاحق ، تم تطبيق دوائر المذبذب الجيني لفهم التحكم الأيضي في البيئة الديناميكية للخلايا الحية4. المجهر الآلي الفاصل الزمني هو أحد الطرق لتوصيف مثل هذه الدوائر. نحن نفترض أن الخلايا المضيفة، الإشريكية القولونية،مزامنة عند تشكيل المستعمرات الصغيرة، مما يسمح لقياس إشارة وحساب الضوضاء دون تتبع العلاقات الدقيقة الأم وابنتها.

الضوضاء هي أحد الجوانب الأساسية المتأصلة في النظم البيولوجية التي تنشأ في كثير من الأحيان من مصادر متعددة. النظر على سبيل المثال، التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تنطوي على الإشارات التي تنشأ من نقل ناقلات عشوائية منفصلة مثل نشر البروتينات13. هذه الإشارات تنتشر مع تقلبات عشوائية14. مصادر الضوضاء الأخرى هي توافر الموارد، وتقسيم الخلايا والاختلافات في الظروف البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة والضغط. غالبا ما يكون للإشارات البيولوجية التي تنتشر في دوائر الجينات الاصطناعية نسبة إشارة منخفضة جدا إلى الضوضاء (SNR) ، مما يزعج أداء هذه الدوائر. لذلك ، لا يزال تصميم الدائرة الوراثية أحد الجوانب الأكثر تحديا في الهندسة الوراثية15. على سبيل المثال ، على النقيض من معظم النهج التي تحسب فقط متوسط التعبير الجيني (تقاس على مجموع سكان الخلية) ، ويعتبر الفرق في إشارة قياس من أجل هندسة السلوك يمكن التنبؤ بها من خلال شبكات الجينات الاصطناعية12. على هذا النحو ، فإن مستويات التباين أو الضوضاء في التعبير البروتين تلعب دورا مهيمنا في تصميم وأداء الدوائر الجينية التناظرية والرقمية1،16،17.

وقد تم تطوير العديد من النهج لتحديد التباين من خلية إلى خلية، بما في ذلك في الإشريكية القولونية 3،7،18. وغالبا ما تستخدم هذه الأساليب لدراسة تنشيط الجينات ومسارات التمثيل الغذائي، ولكن مع تركيز أقل على دراسة ديناميات الضوضاء العشوائية، مثل قياس وتفكيك مصادر ضوضاء محددة، وخاصة بالنسبة للدوائر الوراثية في الخلايا الحية حيث هذا هو التحدي الأساسي19،20،21. عدة عوامل، سواء الموروثة إلى الدائرة نفسها (الجوهرية) والمستمدة من الخلايا المضيفة (extrinsic)، يمكن أن تعكر صفو الأداء المستمر للدوائر الوراثية. في هذه الورقة ، وضعنا بروتوكولا يهدف إلى تحديد إجمالي الضوضاء في خلايا الإشريكية القولونية ، بما في ذلك مصادر الضوضاء الجوهرية والقشرية6و22. من خلال تحديد إجمالي الضوضاء ومن ثم تقييم SNR23، يمكن تحسين تصميم دوائر الجينات. يمكن تعديل هذه الطريقة لقياس مصادر الضوضاء المستقلة بشكل منفصل ، من خلال مراقبة العديد من البروتينات الفلورية6،20. بالنسبة للبروتوكول الموصوف هنا ، نحافظ على الظروف البيئية تحت رقابة جيدة ونقيس باستمرار نشاط الخلايا دون تأثير العوامل الخارجية. نقيس الإشارة من البروتينات الفلورية في خلايا واحدة مع مرور الوقت ونصورها في وقت واحد تحت ركيزة الآغاروز. يتم تحليل الصور الناتجة باستخدام MATLAB المخصصة للمختبر.

من الناحية المثالية ، فإن القياس المستمر للنشاط في الوقت الحقيقي للبروتينات الفلورية داخل الخلية سينتج بيانات دقيقة من خلال نمو الخلايا وتقسيمها. ومع ذلك، فإنه من الصعب الحصول على هذه البيانات. ويرجع ذلك إلى تدهور البروتينات الفلورية ، والمعروفة باسم تبييض الصور7، عندما يتعرضون للإشعاع في عملية الإثارة. وعلاوة على ذلك، خلايا الإشريكية القولونية هي أيضا حساسة للإثارة، والتي قد تؤدي إلى السمية الضوئية7. وتحد المسألتان من كمية إطارات الصور التي يمكن الحصول عليها والوقت بين عمليات الاستحواذ. الركيزة والأنواع المتوسطة (مثل مرق الليوجيني) التي تستخدم لزراعة الخلايا أثناء التصوير لها أيضا دور حاسم. نوصي بشدة باستخدام الحد الأدنى من الوسط ، مما يقلل من الخلفية غير الفلورية ويطيل وقت تقسيم الخلية.

وعلاوة على ذلك، يجب إعداد العينة بالنظر إلى المتطلبات التالية (1) يسمح انخفاض معدل انقسام الخلايا بالتعرض بشكل أقل تواترا للتصوير عن كثب لدورة التقسيم وتقليل احتمال السمية الضوئية والbleaching. وضعنا وقت الاستحواذ على حوالي نصف وقت الانقسام المتوقع (2) كثافة الخلايا المنخفضة في بداية التجربة تسمح بتوحيد أفضل وتتبع الانقسام. تتأثر كثافة الخلايا بنسبة تخفيف خلايا الإشريكية القولونية، وهي معلمة مهمة لنجاح هذا البروتوكول وتحتاج إلى تحديد لكل مختبر. من أجل تحديد النسبة، ينبغي أن تكون مزودة كل سلالة جديدة من الإشريكية القولونية أو وسائل الإعلام المستخدمة مع الرسوم البيانية معدل النمو(الشكل التكميلي 1). تم تحقيق نسبة مناسبة إذا كانت الخلايا يمكن أن تنمو دون اهتزاز إضافي بعد حضانة قصيرة من كثافة أولية تبلغ حواليOD 600nm = 0.1. سوف تنقسم الخلايا في هذه المرحلة وفقا لدرجة حرارة البيئة فقط (3) تقييد حركة الخلية: حركة الخلية تعتمد بقوة على صلابة الركيزة (لوحة الآغاروز). يعتمد ثبات الركيزة على مقدار إجمالي الآغاروز ووقت التصلب الجلي. لا يمكن ترك المواد الهلامية لترسيخ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، كما القولونية Escherichia سيخضع الانقسام. وتشمل العوامل الأخرى التي تؤثر على استقرار الركيزة كمية المياه في العينة والرطوبة. يتم مناقشة قضايا إضافية بالتفصيل في نتائج الممثل. يوفر هذا البروتوكول العديد من التفاصيل وينتقل تدريجيا من خطوة إلى أخرى. يوفر البروتوكول استقرار طويل لتجارب التصوير ويوفر أداة أساسية لمعالجة الصور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الإعلام والثقافة

  1. إعداد محلول المخزون من 1000x كاربينسيلين (50 ملغم / مل) أو المضادات الحيوية ذات الصلة.
    1. . وزن 0.5 غرام من كاربينسيلين. إضافة 10 مل من العقيم H2O. تذوب تماما.
    2. تعقيم الأسهم كاربينسيلين من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. Aliquot محلول المضادات الحيوية وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. لإعداد لوحات مرق الليسوجيني (LB)، اخلط 5 غرام من التريبتون، 5 غرام من NaCl، 2.5 غرام من مستخلص الخميرة و 7.5 غرام من باكتو أغار مع 0.5 لتر من H2O. Autoclave المعقم الحل عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    1. غمر جزئيا مزيج الجل المنصهر في حمام مائي 50 درجة مئوية. أضف 1000 ميكرولتر من كاربينسيلين (50 ملغم/مل).
    2. إعداد أطباق بيتري في بيئة معقمة. اتركي الصحون لوضعها قبل تخزينها في الثلاجة.
  3. لوسائط M9 الحد الأدنى، وإعداد حلول المخزون منفصلة من ما يلي: أملاح M9 5x (56.4 غرام / لتر)، 2 م الجلوكوز و 2٪ أحماض كازامينو خالية من البيوتين. أوتوكلاف الحلول في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. لإعداد 5 لوحات بيتري، مزيج 1125 ملغ من أجار ذوبان منخفضة و 400 ملغ من أجار مع 89.2 مل من الحد الأدنى من وسائل الإعلام (1x M9). إضافة 10 مل من 2٪ أحماض كازامينو (2٪ [فول/فول]) في قارورة إرلينماير سعة 250 مل.
    ملاحظة: تأكد من صب الوسائط على الشفاه الداخلية للقارورة.
  5. الميكروويف الحل في رشقات نارية قصيرة من 3 إلى 4 ثوان. كرر حتى يصبح الحل واضحا.
    ملاحظة: تأكد من عدم الوصول إلى نقطة الغليان.
  6. ضع قارورة Erlenmeyer التي تبلغ سعة 250 مل في حمام ماء ساخن (60 درجة مئوية) لمزيد من المزيج عن طريق الانتشار، واتركه ليبرد حتى تنخفض درجة حرارته إلى حوالي 45-50 درجة مئوية.
  7. أشعل الشعلة على مقعد صب اللوحة.
  8. إضافة بسرعة جميع الحلول بالترتيب التالي:
    800 ميكرولتر من 50٪ جلسيرول (0.4٪ [فول/فول])
    100 ميكرولتر من الثيامين (B1)
    1100 ميكرولتر من الجلوكوز (2M)
    100 ميكرولتر من كاربينسيلين (50 ملغم/مل).
  9. قم بتدوير قارورة Erlenmeyer لضمان التوزيع حتى لجميع المكونات في جميع أنحاء أجار.
  10. فتح لوحة واحدة في وقت واحد بجانب اللهب والبدء في صب.
    1. اترك اللوحات على مقاعد البدلاء لبضع دقائق حتى التجسيد الأولي.
    2. بدوره لوحات رأسا على عقب لمنع تكثيف المياه من يقطر على هلام.
    3. ترك لوحات لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لحوالي 2 ساعة.
    4. بمجرد أن توطد اللوحات وتجفف ، يمكن تخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر تقريبا.

2. السلالات البكتيرية وبناء البلازميدات

ملاحظة: الدائرة الجينية تحتوي على جزء واحد; (أ) بروتين فلوري أخضر (GFP) يقوده مروجP tetO مما يؤدي إلى التعبير التأسيسي. تم بناء جميع البلازميدات في هذا العمل باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي الأساسية وتم تحويلها إلى الإشريكية القولونية 10β ، وذلك باستخدام بروتوكول صدمة الحرارة القياسية24. تم تحويل البناء النهائي إلى سلالة من النوع البري Escherichia coli MG1655 للاختبار.

  1. تحويل البلازميد المطلوب إلى خلايا الإشريكية القولونية MG1655 مع بروتوكول صدمة الحرارة القياسية24.
  2. تنمو الخلايا المحولة على لوحة أجار LB بين عشية وضحاها في 37°C.
    ملاحظة: من الممكن الحفاظ على أطباق بيتري من الخطوة 2.2 حتى 3 أيام لاستخدام المجهر.
  3. تلقيح مستعمرة واحدة في 5 مل من مرق LB تكملها المضادات الحيوية ذات الصلة في أنبوب زجاجي.
  4. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع سرعة اهتزاز 250 دورة في الدقيقة في الحاضنة لمدة 2 ساعة حتى يصبح السائل غائما.
  5. إعداد 1 مل من محلول التخفيف على النحو التالي:
    892 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط (1x M9)
    8 ميكرولتر من 50٪ جلسيرول (0.4٪ [فول/فول])
    100 ميكرولتر من 2٪ أحماض كازامينو (0.2٪ [wt/vol])
    1 ميكرولتر من الثيامين (B1)
    11 ميكرولتر من الجلوكوز (2 م)
    1 ميكرولتر من المضادات الحيوية ذات الصلة
    1. مزيج وتدور إلى أسفل.
  6. تمييع ثقافة الخلية (1:30) من الخطوة 2.4 إلى أنبوب 2 مل عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من نمو الإشريكية القولونية إلى 1000 ميكرولتر من محلول التخفيف (الخطوة 2.5).
  7. احتضان أنبوب لمدة 1 ساعة مع اهتزاز (250 دورة في الدقيقة) في 37 درجة مئوية.
  8. تنمو 40 ميكرولتر - 60 ميكرولتر على لوحات M9 أعدت في الخطوة 1.10. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يجب أن تكون الكثافة البصرية (OD600nm)للطلاء حوالي 0.1.
  9. ضع ما يصل إلى ثلاث لوحات قاع زجاجية مقاس 35 ملم على مقاعد البدلاء.
    ملاحظة: تأكد من أن زجاج اللوحة له السماكة الصحيحة لعدسات المجهر المستخدمة.
  10. إعداد الثقافة للبذر على لوحات هلام، كرر الخطوات 2.3 إلى 2.6 للمستعمرات من لوحة أعدت في الخطوة 2.9 قياسات المجهر.
  11. إعداد الحل التالي لجعل ثلاثة لوحات المجهر.
    1. سخني حمام الماء إلى 60 درجة مئوية.
    2. مزيج 112.5 ملغ من أجار ذوبان منخفضة و 40 ملغ من أجار مع 8.92 مل من الحد الأدنى من وسائل الإعلام (1x M9) وإضافة 1 مل من 2٪ أحماض كازامينو (0.2٪ [فول / فول]) في قارورة إرلينماير 25 مل.
      ملاحظة: تأكد من صب الوسائط على الشفاه الداخلية للقارورة.
  12. الميكروويف الحل في رشقات نارية قصيرة من 2 إلى 3 ثوان. كرر حتى يصبح الحل واضحا.
    ملاحظة: تأكد من عدم الوصول إلى نقطة الغليان.
  13. ضع قارورة Erlenmeyer سعة 25 مل في حمام ماء ساخن (60 درجة مئوية) لمزيد من الاختلاط عن طريق الانتشار ، واتركها تبرد على مقاعد البدلاء حتى تنخفض درجة حرارتها إلى حوالي 45-50 درجة مئوية.

3. إعداد منصات agarose

  1. مقاعد البدلاء نظيفة مع الإيثانول 70٪. شريط تمتد على مقاعد البدلاء تنظيفها. تأكد من أن الشريط ناعم ومستوي.
  2. إعداد اثنين من الأغطية: واحد على الشريط والثاني في مكان قريب. إعداد غطاء.
  3. إزالة قارورة (أعدت في الخطوة 2.14) من حمام الماء، ومسح الجزء الخارجي من قارورة نظيفة وتركها لتبرد حتى تنخفض درجة حرارتها إلى حوالي 45-50 درجة مئوية.
  4. لجعل الحل هلام، مزيج بسرعة جميع الحلول بالترتيب التالي:
    80 ميكرولتر من 50٪ جلسيرول (0.4٪ [فول/فول])
    1 مل من 2٪ أحماض كازامينو (0.2٪ [wt/vol])
    10 ميكرولتر من الثيامين (B1)
    110 ميكرولتر من الجلوكوز (2 م)
    10 ميكرولتر من المضادات الحيوية ذات الصلة.
  5. صب 1.5 مل من هلام على غطاء وتغطيتها مع قطعة الثانية صنع "ساندويتش".
  6. أعد الإرلينماير إلى حمام الماء الساخن. تغطية شطيرة مع غطاء وتعيين الموقت لمدة 20 دقيقة.
  7. في الوقت نفسه، احتضان الأنبوب من الخطوة 2.11 لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز (250 دورة في الدقيقة)
  8. بعد 20 دقيقة الوجه شطيرة (الخطوة 3.5)، وتغطية ذلك وترك للراحة لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: للحصول على نتائج أفضل ترك "ساندويتش" للراحة في 4 درجة مئوية لمدة الخطوة 3.8.
  9. بذور Escherichia القولونية الثقافة من الخطوة 3.7 عن طريق الأنابيب العينة على طبق 35 ملم.
    ملاحظة: Pipetting 6 ميكرولتر من الخلايا كما قطرات صغيرة منفصلة يعطي أفضل النتائج.
  10. السماح لقطرات لتجف، لمدة 15 دقيقة على الأقل وحتى 30 دقيقة.
  11. فضح هلام متوطد من شطيرة من الخطوة 3.8 عن طريق انزلاق غطاء بعيدا.
  12. قطع شطيرة إلى منصات فردية صغيرة مع لكمة خزعة أو تلميح.
  13. العجاف بلطف على العينة (الخطوة 3.9). اترك الطبق لمدة 20 دقيقة على مقاعد البدلاء.

4. إعداد العينة للتصوير المجهري

  1. إزالة قارورة من حمام مائي من الخطوة 3.6. مسح الجزء الخارجي من قارورة نظيفة والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة (25 °C).
    ملاحظة: إزالة القارورة في الخطوة 4.1 حوالي 3 دقائق قبل انتهاء المؤقت.
  2. صب 3 مل من الجل باستمرار إلى محيط لوحة في حركة دائرية. يترك لترسيخ لبضع دقائق.
  3. ختم لوحات مع الشريط وثقب عدة ثقوب مع إبرة 25 G. الوجه جميع الأطباق لمنع تكثيف المياه يقطر على هلام.
  4. احتضان جميع الأطباق في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح التصلب الكامل مع منع الانقسام الخلوي.
    ملاحظة: اترك العينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لإجراء قياسات متتالية، لا تزيد عن يوم واحد.
  5. بدء تشغيل المجهر لكل إرشادات الشركة المصنعة.
  6. العثور على التركيز الأولي باستخدام عدسة التضخيم أدنى وإشراك نظام التركيز التلقائي (AFS).
  7. استخدام النفط إذا لزم الأمر، يغرق العدسة مع النفط ونشرها بعناية عن طريق تحريك لوحة مع وحدة تحكم منصة (وليس يدويا) وAFS يمكن أن تشارك مرة أخرى.
  8. استخدم المقطع العرضي النسبي في اتجاه Z، بعد الاقتراح الافتراضي للأقسام العرضية لخطوة Z.
    ملاحظة: لقد أخذنا صورا ميدانية ساطعة كل 5 دقائق وصورا فلورية كل 20 دقيقة. في بعض الأحيان يجب تعديل التركيز خلال أول 30 دقيقة. تسخين صندوق حاضنة المجهر والزيت ، في حين أن تبريد العينة يميل إلى المساعدة في تقليل الخسارة الأولية للتركيز.

5. تحليل البيانات

ملاحظة: من أجل معالجة بيانات المجهر، قمنا بتصميم برنامج قائم على الكمبيوتر في MATLAB. هذا البرنامج يسهل تحديد حدود الخلية من الصور tiff حقل مشرق وشرائح وفرز الخلايا حسب المنطقة. يمكن استخدام إخراج تحليل الصورة هذا كقناع على صور tiff الفلورية لاشتقاق مستويات كثافة الخلية وإلغاء القطع الأثرية في مجال الفلورسنت مثل هالة الخلية بسبب حدود دقة المجهر. وقد استوحى البرنامج المطور من أعمال مماثلة7و25و26و27و28و29و30 ويوفر حلا أنيقا مصمما خصيصا للمختبر.

  1. أولا، حدد المعلمات التالية في main_code.m.
    1. تعريف مجلد الصور اكتساب.
    2. تحديد الفترة الزمنية للصورة - خطوة وقت قناة الحقل الساطع بالدقائق.
    3. تحديد تردد GFP - معدل الحصول على صور GFP.
    4. حدد دقة المجهر (أي عدد وحدات البكسل التي تساوي 1 ميكرومتر).
    5. تحديد نطاق بن المدرج التكراري - نطاق منطقة الخلية.
      ملاحظة: عملية تصنيف البيانات وفقا لمنطقة الخلية مشابهة لمبادئ gating في تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي. يتم وضع البوابات حول مجموعات من الخلايا ذات الخصائص المشتركة ، وعادة ما تكون مبعثرة إلى الأمام وجانبية متناثرة ، لعزل وتحديد هذه المجموعات السكانية ذات الاهتمام. يسمح الفحص المجهري ببوابة العديد من مجموعات الخلايا والتحقيق فيها وتحديدها كميا.
    6. تعريف نواة الالتواء (3،3) - هذه المعلمة بالكشف عن حدود الخلية عن طريق العتبات العمومية(count_cells.m).
      ملاحظة: هذا الإعداد مطلوب فقط عند تغيير المختبر أو المجهر. يتطلب البرنامج قناة حقل مشرق الإدخال لتكون وصفت مع مؤشر c1، قناة مضان المسمى c2.
  2. تشغيل main_code.m، والتي سيتم تشغيل كافة البرامج النصية الأخرى تلقائيا (count_cells.m cell_growth_rate.m).
    1. يقوم البرنامج تلقائيا بتقسيم صور الحقول الساطعة (انظر الشكل التكميلي 2-4).
    2. اجمع بين صورة التقسيم والصورة الفلورية (GFP) لاستخراج مستوى الكثافة لكل خلية.
    3. حساب الرسم البياني لكمية الخلايا حسب الوقت وتناسب وفقا للنمو الأسي.
    4. حساب المتوسط والانحراف المعياري (STD) لكل نطاق منطقة الخلية.
    5. حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) لكل نطاق منطقة الخلية.
    6. رسم وتناسب توزيع كمية الخلايا حسب الكثافة.
    7. حساب معامل التباين (CV) ومقارنته ببيانات محلل التدفق.
      ملاحظة: سوف تعطي البرامج كما إخراج الصور التجزئة النهائية لضبط conv_kernel في مجلد جديد "مجلد / مجزأة". سوف تعطي البرمجيات كما إخراج الرسوم البيانية في مجلد جديد "مجلد / الرسوم البيانية.
  3. للمقارنة بين التجارب، استخدم compare_experiments.m.
    1. تعريف الدلائل للرسومات البيانية المحفوظة وعنوان الدليل \CompareResult.
    2. تشغيل الملف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يقوم البرنامج بتحليل صور مجال المجال الساطعة التي تكون بيضاء وسوداء. فإن Escherichia القولونية تبدو وكأنها أشكال مستطيلة سوداء على خلفية بيضاء قبالة ومجموعة ديناميكية من الإنارة يجب أن تظهر ارتفاع في مركزها(الشكل 1). في صور الفلورسنت الخلايا قد يكون لها هالة صغيرة ولكن الخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا العمل، قمنا بتطوير بروتوكول يمكن تتبع الكمبيوتر من الخلايا الحية الإشريكية القولونية، بعد مستويات الانقسام والفلورسنت على مدى فترة من الساعات. يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد الديناميكيات العشوائية للدوائر الجينية في الإشريكية القولونية من خلال قياس السيرة الذاتية وSNR ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

نشكر السيد جيل غيلبرت (كلية الهندسة الكهربائية، تكنيون) على مساعدته في قانون MATLAB. نشكر الدكتور Ximing لي (كلية الهندسة الطبية الحيوية ، Technion) للمساعدة في التدقيق في هذه المقالة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل مؤسسة عائلة نيوباور ووزارة العلوم الإسرائيلية، منحة 2027345.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35mm glass dishmattekP35G-0.170-14-Cthickness corresponding with microscope lense.
Agarose Lonza5004LB preperation
AHL Sigma-AldrichK3007inducer
Bacto tryptone BD - Becton, Dickinson and Company 211705LB preperation
CarbInvitrogen10177-012antibiotic
CarbFormediumCAR0025antibiotic
Casamino acids BD - Becton, Dickinson and Company 223050minimal media solution
eclipse Tinikoninverted microscope
GlucoseSigma-AldrichG5767minimal media solution
GlyserolBio-Lab000712050100minimal media substrate
Immersol 518Fzeiss4449600000000immersion oil
M9 salt solution Sigma-AldrichM6030minimal media solution
NaClBio-Lab214010LB preperation
Noble agarSigma-AldrichA5431minimal media substrate
parafilm tapeBemisPM-996refered to as tape in text
Seaplaque GTG AgaroseLonza50111minimal media substrate
thaymine B1Sigma-AldrichT0376 minimal media solution
Yeast ExtractBD - Becton, Dickinson and Company 212750LB preperation

References

  1. Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
  2. Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
  3. Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
  4. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
  5. Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
  6. Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
  7. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
  8. Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
  10. Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
  11. Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
  12. Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
  13. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  14. Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
  15. Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
  16. Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
  17. Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
  18. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  19. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  20. Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
  21. Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
  22. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
  23. Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
  24. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
  25. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
  26. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
  27. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
  28. Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
  29. Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
  30. Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
  31. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
  32. Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
  33. Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).
  34. Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
  35. Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
  36. Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
  37. Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
  38. Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
  39. Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved