Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

Riepilogo

Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l'imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l'analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.

Abstract

Il protocollo qui sviluppato offre uno strumento per consentire il tracciamento informatico della divisione Escherichia coli e dei livelli fluorescenti per diverse ore. Il processo inizia attraverso lo screening per le colonie che sopravvivono su supporti minimi, supponendo che solo Escherichia coli che ospita il plasmide corretto sarà in grado di prosperare nelle condizioni specifiche. Poiché il processo di costruzione di grandi circuiti genetici, che richiedono l'assemblaggio di molte parti del DNA, è impegnativo, i componenti del circuito sono spesso distribuiti tra più plasmidi a diversi numeri di copia che richiedono l'uso di diversi antibiotici. Le mutazioni nel plasmide possono distruggere la trascrizione dei geni di resistenza agli antibiotici e interiettare con la gestione delle risorse nella cellula che porta alla necrosi. La colonia selezionata è impostata su una piastra di Petri con fondo di vetro e alcuni piani di messa a fuoco sono selezionati per il tracciamento della microscopia sia in campo luminoso che in domini fluorescenti. Il protocollo mantiene lo stato attivo dell'immagine per più di 12 ore in condizioni iniziali che non possono essere regolamentate, creando alcune difficoltà. Ad esempio, le cellule morte iniziano ad accumularsi nel campo di messa a fuoco delle lenti dopo alcune ore di imaging, il che causa l'accumulo di tossine e la sfocatura e il decadimento del segnale. L'esaurimento dei nutrienti introduce nuovi processi metabolici e ostacola la risposta desiderata del circuito. La temperatura dell'esperimento abbassa l'effettività di induttori e antibiotici, il che può danneggiare ulteriormente l'affidabilità del segnale. Il gel multimediale minimo si restringe e si asciuga e, di conseguenza, la messa a fuoco ottica cambia nel tempo. Abbiamo sviluppato questo metodo per superare queste sfide in Escherichia coli, simile ai lavori precedenti che sviluppano metodi analoghi per altri microrganismi. Inoltre, questo metodo offre un algoritmo per quantificare il rumore stocastico totale nelle celle inaltere e alterate, scoprendo che i risultati sono coerenti con le previsioni dell'analizzatore di flusso come mostrato da un coefficiente di variazione simile (CV).

Introduzione

La biologia sintetica è un campo multidisciplinare emerso nell'ultimo decennio e mira a tradurre i principi di progettazione ingegneristica in progettazione biologica^{razionale 1,2,3,}nel tentativo di raggiungere l'integrazione e l'elaborazione multi-segnale nelle cellule viventi per comprendere la scienza di^{base 4,5,}applicazioni diagnostiche, terapeutiche e^{biotecnologiche 6,7,8,9,10}. La nostra capacità di quantificare la risposta input-output dei circuiti genetici sintetici è stata rivoluzionata dai recenti progressi nella tecnologia a cella singola, tra cui l'analizzatore di flusso e l'imaging di cellule vive utilizzando la microscopia automatica time-lapse¹¹. Un analizzatore di flusso viene spesso utilizzato per misurare la risposta di questi circuiti allo stato^{stazionario 1,12}e la microscopia invertita viene utilizzata per misurare la risposta dinamica dei circuiti genetici sintetici a livello di una singola cella³. Ad esempio, uno dei primi lavori in biologia sintetica ha comportato la costruzione di reti di oscillatori genetici in cellule viventi utilizzando cicli di feedback negativi con un ritardo^{di 3}. Successivamente, i circuiti genetici dell'oscillatore sono stati applicati per comprendere il controllo metabolico nell'ambiente dinamico delle cellule^{viventi 4}. La microscopia automatica time-lapse è un metodo per caratterizzare tali circuiti. Ipotizziamo che le cellule ospiti, Escherichia coli, si sincronizzino quando formano micro colonie, consentendo la misurazione del segnale e il calcolo del rumore senza tracciare relazioni esatte madre-figlia.

Il rumore è un aspetto fondamentale e intrinseco dei sistemi biologici spesso derivanti da più fonti. Si consideri, ad esempio, le reazioni biochimiche che coinvolgono segnali che provengono dal trasporto di vettori casuali discreti come la diffusione delle proteine¹³. Questi segnali si propagano con fluttuazioni casuali¹⁴. Altre fonti di rumore sono la disponibilità di risorse, la divisione cellulare e le variazioni delle condizioni ambientali come temperatura, umidità e pressione. I segnali biologici che si propagano nei circuiti genetici sintetici hanno spesso un rapporto segnale/rumore molto basso (SNR), che disturba le prestazioni di tali circuiti. Pertanto, la progettazione di circuiti genetici rimane uno degli aspetti più impegnativi dell'ingegneria^{genetica 15}. Ad esempio, a differenza della maggior parte degli approcci che calcolano solo l'espressione genica media (misurata sull'intera popolazione cellulare), la varianza del segnale misurato è considerata al fine di progettare un comportamento prevedibile attraverso reti geniche^{sintetiche 12}. Come tale, i livelli di variabilità o rumore nell'espressione proteica svolgono un ruolo dominante nella progettazione e nelle prestazioni dei circuiti genetici analogici e digitali^1,16,17.

Sono stati sviluppati molti approcci per quantificare la variabilità da cellula a cellula, tra cui in Escherichia coli^3,7,18. Questi metodi sono spesso utilizzati per studiare l'attivazione genica e le vie metaboliche, tuttavia con minore attenzione allo studio della dinamica del rumore stocastico, come la misurazione e la districazione di specifiche fonti di rumore, in particolare per i circuiti genetici nelle cellule viventi dove questa è una^{sfida fondamentale 19,20,21}. Diversi fattori, entrambi ereditati dal circuito stesso (intrinseco) e derivati dalle cellule ospiti (estrinsece), possono disturbare le prestazioni continue dei circuiti genetici. In questo documento, abbiamo sviluppato un protocollo che mira a quantificare il rumore totale nelle cellule di Escherichia coli, comprese le fonti di rumore intrinseche ed estrinsece^6,22. Quantificando il rumore totale e quindi valutando l'SNR²³, è possibile migliorare la progettazione dei circuiti genetici. Questo metodo può essere modificato per misurare separatamente le fonti di rumore indipendenti, monitorando diverse proteine^{fluorescenti 6,20}. Per il protocollo qui descritto, manteniamo le condizioni ambientali ben controllate e misuriamo continuamente l'attività delle cellule senza l'influenza di fattori esterni. Misuriamo il segnale dalle proteine fluorescenti in singole cellule nel tempo e contemporaneamente le immaginiamo sotto un substrato di agarosio. Le immagini risultanti vengono analizzate utilizzando il MATLAB personalizzato del laboratorio.

Idealmente, la misurazione continua dell'attività in tempo reale delle proteine fluorescenti all'interno di una cellula produrrà dati accurati attraverso la crescita e la divisione delle cellule. Tuttavia, è difficile acquisire tali dati. Ciò è dovuto alla degradazione delle proteine fluorescenti, note come foto-sbiancamento⁷, quando sono esposte a radiazioni nel processo di eccitazione. Inoltre, le cellule di Escherichia coli sono sensibili anche per l'eccitazione, che potrebbe portare alla fototossicità⁷. Entrambi i problemi limitano la quantità di cornici che possono essere acquisite e il tempo tra le acquisizioni. Anche il substrato e i tipi medi (ad esempio il brodo di licogenia) che viene utilizzato per far crescere le cellule durante l'imaging hanno un ruolo critico. Si consiglia vivamente di utilizzare un mezzo minimo, che riduce al minimo lo sfondo non fluorescente ed estende il tempo di divisione cellulare.

Inoltre, il campione deve essere preparato considerando i seguenti requisiti (1) Il basso tasso di divisione cellulare consente esposizioni meno frequenti per l'imaging da vicino del ciclo di divisione e la riduzione della probabilità di fototossicità e fotoblesaching. Abbiamo impostato il tempo di acquisizione su circa la metà del tempo di mitosi previsto (2) La bassa densità cellulare all'inizio dell'esperimento consente una migliore uniformità e tracciabilità della divisione. La densità cellulare è influenzata dal rapporto di diluizione delle cellule di Escherichia coli, che è un parametro significativo per il successo di questo protocollo e deve essere determinato per ogni laboratorio. Per stabilire il rapporto, ogni nuovo ceppo o supporto di Escherichia coli utilizzato dovrebbe essere dotato di grafici del tasso di crescita(figura complementare 1). Un rapporto appropriato è stato raggiunto se le cellule possono crescere senza ulteriori scosse dopo una breve incubazione da una densità iniziale di circa_600nm di OD = 0,1. Le cellule in questa fase si divideranno solo in base alla temperatura dell'ambiente (3) Restrizione del movimento cellulare: il movimento cellulare dipende fortemente dalla compattezza del substrato (tampone di agarosio). La compattezza del substrato dipende dalla quantità di agarosio totale e dal tempo di solidificazione del gel. I gel non possono essere lasciati solidificare durante la notte a temperatura ambiente, poiché l'Escherichia coli subirà la mitosi. Altri fattori che influenzano la stabilità del substrato includono la quantità di acqua nel campione e l'umidità. Ulteriori questioni sono discusse in dettaglio nei risultati rappresentativi. Questo protocollo fornisce molti dettagli e si sposta gradualmente da un passo all'altro. Il protocollo offre una lunga stabilità per gli esperimenti di imaging e fornisce uno strumento di elaborazione delle immagini di base.

Protocollo

1. Preparazione dei media e della cultura

1. Preparare una soluzione stock di 1.000x carbenicillina (50 mg/mL) o antibiotico pertinente.
   1. . Pesare 0,5 g di carbenicillina. Aggiungere 10 mL di sterile H₂O. Sciogliere completamente.
   2. Sterilizzare lo stock di carbenicillina attraverso un filtro siringa da 0,22 μm. Aliquota la soluzione antibiotica e conservare a -20 °C.
2. Per preparare piatti di brodo di lisogenia (LB), mescolare 5 g di triptone, 5 g di NaCl, 2,5 g di estratto di lievito e 7,5 g di agar Bacto con 0,5 L di sterile H₂O. Autoclave la soluzione a 121 °C per 20 min.
   1. Immergere parzialmente il gel-mix fuso in un bagno d'acqua a 50 °C. Aggiungere 1.000 μL di carbenicillina (50 mg/mL).
   2. Preparare le piastre di Petri in un ambiente sterile. Lasciare i piatti da impostare prima di conservarli in frigo.
3. Per i mezzi minimi M9, preparare soluzioni di stock separate delle seguenti: 5 sali M9 (56,4 g/L), 2 M di glucosio e 2% di casaminoacidi senza biotina. Autoclavare le soluzioni a 121 °C per 20 min.
4. Per preparare 5 piastre di Petri, mescolare 1125 mg di agar a bassa fusione e 400 mg di agar con 89,2 mL di mezzi minimi (1x M9). Aggiungere 10 ml di 2% di casaminoacidi (2% [vol/vol]) in un pallone Erlenmeyer da 250 mL.
   NOTA: Assicurarsi di versare il supporto sulle labbra interne del pallone.
5. Microonde la soluzione in brevi raffiche da 3 a 4 secondi. Ripetere fino a quando la soluzione non è chiara.
   NOTA: Assicurarsi di non raggiungere il punto di ebollizione.
6. Mettere il pallone Erlenmeyer da 250 mL in un bagno di acqua calda (60 °C) per mescolare ulteriormente per diffusione e lasciarlo raffreddare fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.
7. Accendere la fiamma sulla panca che versa la piastra.
8. Aggiungere rapidamente tutte le soluzioni nell'ordine seguente:
   800 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol])
   100 μL di tiammina (B1)
   1100 μL di glucosio (2M)
   100 μL di carbenicillina (50 mg/mL).
9. Ruotare il pallone Erlenmeyer per garantire una distribuzione uniforme di tutti gli ingredienti in tutto l'agar.
10. Aprire un piatto alla volta accanto alla fiamma e iniziare a versare.
    1. Lasciare le piastre in panchina per qualche minuto fino alla solidificazione iniziale.
    2. Capovolgere le piastre per evitare che la condensa dell'acqua gocciola sul gel.
    3. Lasciare solidificare le piastre a temperatura ambiente per circa 2 ore.
    4. Una volta che le piastre si sono solidificate e asciugate, possono essere conservate a 4 °C per circa 3 mesi.

2. Costruzione di ceppi batterici e plasmidi

NOTA:Il circuito genetico contiene una parte; una proteina fluorescente verde (GFP) guidata da un promotore P_tetO con conseguente espressione costitutiva. Tutti i plasmidi in questo lavoro sono stati costruiti utilizzando tecniche di clonazione molecolare di base e sono stati trasformati in Escherichia coli 10β, utilizzando un protocollo standard di shock^{termico 24}. Il costrutto finale è stato trasformato in ceppo di tipo selvatico Escherichia coli MG1655 per i test.

1. Trasformare il plasmide desiderato in cellule Escherichia coli MG1655 con il protocollo standard di shock termico²⁴.
2. Far crescere le cellule trasformate su una piastra di agar LB durante la notte a 37 °C.
   NOTA: È possibile mantenere le piastre di Petri dal passaggio 2.2 fino a 3 giorni per l'uso in microscopia.
3. Inoculare una singola colonia in 5 ml di brodo LB integrato con gli antibiotici pertinenti in un tubo di vetro.
4. Far crescere le cellule a 37 °C con una velocità di scuotimento di 250 giri/min nell'incubatrice per 2 ore fino a quando il liquido non è torbido.
5. Preparare 1 mL di soluzione di diluizione come segue:
   892 μL di supporti minimi (1x M9)
   8 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol])
   100 μL di 2% di casaminoacidi (0,2% [wt/vol])
   1 μL di tiammina (B1)
   11 μL di glucosio (2 M)
   1 μL di antibiotici pertinenti
   1. Mescolare e girare verso il basso.
6. Diluire la coltura cellulare (1:30) dal passo 2.4 in un tubo da 2 ml aggiungendo 30 μL di crescita di Escherichia coli a 1000 μL di soluzione di diluizione (fase 2.5).
7. Incubare il tubo per 1 h con scuotimento (250 giri/min) a 37 °C.
8. Crescere 40 μL - 60 μL su piastre M9 preparate nella fase 1.10. Incubare la piastra a 37 °C durante la notte.
   NOTA: La densità ottica (OD_600nm)per la placcatura deve essere di circa 0,1.
9. Posizionare fino a tre piastre inferiori in vetro da 35 mm sulla panca.
   NOTA: Assicurarsi che il vetro della piastra abbia lo spessore corretto per le lenti al microscopio utilizzate.
10. Preparare la coltura per la semina su piastre di gel, ripetere i passaggi da 2.3 a 2.6 per le colonie da piastre preparate a misure al microscopio passo 2.9.
11. Preparare la seguente soluzione per realizzare tre lastre al microscopio.
    1. Preriscaldare il bagno d'acqua a 60 °C.
    2. Mescolare 112,5 mg di agar a bassa fusione e 40 mg di agar con 8,92 ml di mezzi minimi (1x M9) e aggiungere 1 ml di 2% di casaminoacidi (0,2% [vol/vol]) in un pallone Erlenmeyer da 25 ml.
       NOTA: Assicurarsi di versare il supporto sulle labbra interne del pallone.
12. Microonde la soluzione in brevi raffiche da 2 a 3 secondi. Ripetere fino a quando la soluzione non è chiara.
    NOTA: Assicurarsi di non raggiungere il punto di ebollizione.
13. Mettere il pallone Erlenmeyer da 25 mL in un bagno d'acqua calda (60 °C) per mescolare ulteriormente per diffusione e lasciarlo raffreddare sul banco fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.

3. Preparazione di tamponi di agarosio

1. Panca pulita con 70% di etanolo. Allungare il nastro sulla panca pulita. Assicurarsi che il nastro sia liscio e livellato.
2. Preparare due coverlips: uno sul nastro e un secondo nelle vicinanze. Preparare una coverlid.
3. Rimuovere il pallone (preparato al passaggio 2.14) dal bagno d'acqua, pulire l'esterno del pallone e lasciarlo raffreddare fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.
4. Per realizzare la soluzione gel, mescolare rapidamente tutte le soluzioni nel seguente ordine:
   80 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol])
   1 mL di 2% di casaminoacidi (0,2% [wt/vol])
   10 μL di tiammina (B1)
   110 μL di glucosio (2 M)
   10 μL di antibiotici pertinenti.
5. Versare 1,5 mL di gel sul coperchio e coprirlo con il secondo pezzo facendo un "sandwich".
6. Riportare l'Erlenmeyer al bagno di acqua calda. Coprire il panino con il coperchio e impostare il timer per 20 minuti.
7. Allo stesso tempo, incubare il tubo dal passaggio 2.11 per 1 h a 37 °C con scuotimento (250 giri/min)
8. Dopo 20 minuti capovolgere il panino (passo 3.5), coprirlo e lasciare riposare per 1 h.
   NOTA: Per risultati migliori lasciare riposare il "sandwich" a 4 °C per tutta la durata del passaggio 3.8.
9. Seme Escherichia coli coltura dal passo 3.7 pipettando il campione sul piatto da 35 mm.
   NOTA: Pipettare 6 μL di cellule come piccole gocce separate dà i migliori risultati.
10. Lasciare asciugare le gocce, per almeno 15 minuti e fino a 30 minuti.
11. Esporre il gel solidificato del sandwich dal passaggio 3.8 facendo scorrere via il coverslip.
12. Tagliare il sandwich in piccoli cuscinetti singoli con punzone o punta in biopsia.
13. Appoggiarlo delicatamente sul campione (fase 3.9). Lasciare il piatto per 20 minuti in panchina.

4. Preparazione del campione per l'imaging di microscopia

1. Rimuovere il pallone dal bagno d'acqua dal passaggio 3.6. Pulire l'esterno del pallone e lasciare raffreddare a temperatura ambiente (25 °C).
   NOTA: Rimuovere il pallone al passaggio 4.1 circa 3 minuti prima della fine del timer.
2. Versare costantemente 3 mL del gel sul perimetro della piastra con un movimento circolare. Lasciare solidificare per qualche minuto.
3. Sigillare le piastre con nastro adesivo e perforare diversi fori con ago da 25 G. Capovolgere tutti i piatti per evitare che la condensa dell'acqua gocciola sul gel.
4. Incubare tutti i piatti a 4 °C per 30 min per consentire la piena solidificazione prevenendo la mitosi cellulare.
   NOTA: Lasciare campioni a 4 °C per misurazioni successive, non più di un giorno.
5. Avviare il microscopio per istruzioni del produttore.
6. Trova la messa a fuoco iniziale usando l'obiettivo di amplificazione più basso e attiva il sistema di messa a fuoco automatica (AFS).
7. Utilizzare l'olio se necessario, annegare l'obiettivo con olio e diffonderlo con attenzione spostando la piastra con un controller della piattaforma (non manualmente) e AFS può essere nuovamente inserito.
8. Utilizzate la sezione trasversale relativa in direzione Z, seguendo il suggerimento di default per le sezioni trasversali del passo Z.
   NOTA: Abbiamo scattato immagini a campo luminoso ogni 5 minuti e immagini fluorescenti ogni 20 minuti. A volte la messa a fuoco deve essere regolata durante i primi 30 minuti. Il preriscaldamento della scatola dell'incubatore di microscopio e dell'olio, mentre la refrigerazione del campione tende a contribuire a ridurre la perdita iniziale di messa a fuoco.

5. Analisi dei dati

NOTA: Per elaborare i dati della microscopia, abbiamo progettato un software basato su computer in MATLAB. Questo software facilita l'identificazione dei confini cellulari da immagini tiff a campo luminoso e segmenti e ordina le celle per area. L'output di questa analisi delle immagini può essere utilizzato come maschera su immagini tiff fluorescenti per derivare i livelli di intensità cellulare e annullare artefatti nel dominio fluorescente come l'alone cellulare a causa dei limiti di risoluzione del microscopio. Il software sviluppato è stato ispirato da opere^{simili 7,25,26,27,28,29,30 e} fornisce una soluzione elegante su misura per il laboratorio.

1. Definire innanzitutto i seguenti parametri in main_code.m.
   1. Definire la cartella delle immagini di acquisizione.
   2. Definisci il periodo di tempo dell'immagine- passo del tempo del canale del campo luminoso in pochi minuti.
   3. Definire la frequenza GFP - tasso di acquisizione delle immagini GFP.
   4. Definire la risoluzione del microscopio (cioè quanti pixel sono uguali a 1 μm).
   5. Definire l'intervallo del contenitore dell'istogramma - intervallo di area delle celle.
      NOTA: Il processo di classificazione dei dati in base all'area cellulare è simile ai principi di gating nell'analisi dei dati della citometria del flusso. Le porte sono posizionate attorno a popolazioni di cellule con caratteristiche comuni, di solito sparse in avanti e sparse lateralmente, per isolare e quantificare queste popolazioni di interesse. La microscopia consente di gate, indagare e quantificare diversi gruppi cellulari.
   6. Definire il kernel di convoluzione (3,3): questo parametro rileva i limiti delle celle mediante soglia globale (count_cells.m).
      NOTA: questa configurazione è necessaria solo quando si modifica il laboratorio o il microscopio. Il software richiede che il canale di campo luminoso di ingresso sia etichettato con l'indice c1, canale di fluorescenza etichettato come c2.
2. Eseguire main_code.m, che eseguirà automaticamente tutti gli altri script (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
   1. Il programma segmenta automaticamente le immagini dei campi luminosi (vedere figura complementare 2-4).
   2. Combina l'immagine di segmentazione con l'immagine fluorescente (GFP) per estrarre il livello di intensità per cella.
   3. Calcola il grafico della quantità di cellule per tempo e adatta in base alla crescita esponenziale.
   4. Calcolare la deviazione media e standard (STD) per ogni intervallo di area della cella.
   5. Calcolare il rapporto segnale/rumore (SNR) per ogni intervallo di area cellulare.
   6. Tracciare e adattare la distribuzione della quantità di cellule per intensità.
   7. Calcolare il coefficiente di varianza (CV) e confrontarlo con i dati dell'analizzatore di flusso.
      NOTA: il software fornirà come output le immagini di segmentazione finali per la regolazione conv_kernel in una nuova cartella "cartella/Segmentata". Il software darà come output i grafici in una nuova cartella "yourfolder/Graphs.
3. Per confrontare tra gli esperimenti, utilizzare compare_experiments.m.
   1. Definire le directory per i grafici salvati e l'indirizzo per la directory \CompareResult.
   2. Eseguire il file.

Risultati

Il software analizza le immagini del dominio di campo luminoso che sono bianche e nere. L'Escherichia coli sarà simile a forme oblunghe nere su uno sfondo bianco troppo bianco e la gamma dinamica di luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro (Figura 1). Nelle immagini fluorescenti le cellule possono avere un piccolo alone, ma le singole cellule con forme oblunghe possono ancora essere risolte. Un evento di mitosi deve essere rilevato per la prima volta dopo 30 minuti. La messa ...

Discussione

In questo lavoro, abbiamo sviluppato un protocollo che consente il tracciamento computerico delle cellule vive di Escherichia coli, seguendo livelli di divisione e fluorescenti per un periodo di ore. Questo protocollo ci permette di quantificare le dinamiche stocastiche dei circuiti genetici in Escherichia coli misurando il CV e l'SNR in tempo reale. In questo protocollo, abbiamo confrontato i comportamenti stocastica di due circuiti diversi come mostrato nella Figura 10. È stato dimos...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD - Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD - Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD - Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation