タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定

要約

この研究は、合成遺伝子回路の確率的挙動の分析と定量化のために 、大腸菌 の単一細胞の生画像化を可能にする顕微鏡法を提示する。

要約

ここで開発されたプロトコルは、数時間にわたって 大腸菌 部門と蛍光レベルのコンピュータ追跡を可能にするツールを提供しています。このプロセスは、正しいプラスミドを抱える 大腸菌 だけが特定の条件で繁栄することができると仮定して、最小限の媒体で生き残るコロニーのスクリーニングから始まります。多くのDNA部品の組み立てを必要とする大規模な遺伝子回路を構築するプロセスは困難であるため、回路部品は、多くの場合、いくつかの抗生物質の使用を必要とする異なるコピー番号で複数のプラスミド間で分布しています。プラスミドの突然変異は、抗生物質耐性遺伝子の転写を破壊し、壊死につながる細胞内の資源管理と介入する可能性がある。選択されたコロニーはガラス底のペトリ皿にセットされ、明るい分野および蛍光領域の両方の顕微鏡追跡のためにいくつかの焦点面が選ばれる。このプロトコルは、規制できない初期条件下で 12 時間以上画像のフォーカスを維持し、いくつかの困難を生み出します。例えば、死んだ細胞は、数時間のイメージングの後にレンズの焦点分野に蓄積し始め、毒素が蓄積し、信号がぼやけて減衰する原因となります。栄養素の枯渇は、新しい代謝プロセスを導入し、回路の所望の応答を妨げます。実験の温度は、誘導剤および抗生物質の有効性を低下させ、信号の信頼性をさらに損なう可能性がある。最小のメディアゲルが収縮し、乾燥し、その結果、光学的焦点は時間の経過とともに変化します。我々は、他の微生物に対する類似法を開発した以前の作品と同様に、 大腸菌でこれらの課題を克服するためにこの方法を開発しました。さらに、この方法は、変化しない細胞および変化した細胞の総確率的ノイズを定量化するアルゴリズムを提供し、同様の変動係数(CV)で示されるように、結果がフローアナライザ予測と一致していることを発見する。

概要

合成生物学は、過去10年間に出現した学際的な分野であり、工学設計原理を合理的な生物学的設計^1、2、3に変換し、基本科学^4、5、診断、治療およびバイオテクノロジーアプリケーション^{6、7、8、9、10}を理解するために、生体細胞における多信号統合と処理を達成することを目指しています。合成遺伝子回路の入力出力応答を定量化する当社の能力は、自動タイムラプス顕微鏡¹¹を用いたフローアナライザやライブセルイメージングを含む単細胞技術の最近の進歩によって革命化されている。フローアナライザは、定常状態^1、12においてこれらの回路の応答を測定するためによく使用され、反転顕微鏡は、単一細胞³のレベルでの合成遺伝子回路の動的応答を測定するために使用される。例えば、合成生物学の初期の研究の1つは、遅延³を伴う負のフィードバックループを使用して生きている細胞における遺伝的発振器ネットワークの構築を含んでいた。その後、生細胞⁴の動的環境における代謝制御を理解するために、遺伝的発振回路を適用した。自動時間経過顕微鏡は、このような回路を特徴付ける方法の1つです。我々は、宿主細胞である大腸菌がマイクロコロニーを形成する際に同期し、正確な母娘関係を追跡することなく、信号の測定とノイズの計算を可能にすることを仮説とする。

ノイズは、多くの場合、複数のソースから生じる生物学的システムの基本的な、固有の側面です。例えば、タンパク質¹³の拡散のような離散的なランダムキャリアの輸送に由来するシグナルを含む生化学的反応を考えてみましょう。これらの信号はランダムな変動¹⁴で伝播する。その他のノイズ源としては、資源の利用可能性、細胞分裂、温度、湿度、圧力などの環境条件の変動があります。合成遺伝子回路で伝播する生体信号は、多くの場合、このような回路の性能を乱す非常に低い信号対雑音比(SNR)を有する。したがって、遺伝子回路設計は、遺伝子工学¹⁵の最も困難な側面の1つです。例えば、平均遺伝子発現のみを計算する(細胞全体の母集団にわたって測定される)ほとんどのアプローチとは対照的に、測定されたシグナルの分散は、合成遺伝子ネットワーク¹²を介して予測可能な行動を設計するために考慮される。したがって、タンパク質発現における変動性またはノイズのレベルは、アナログおよびデジタル遺伝子回路^1、16、17の設計と性能において支配的な役割^を果たす。

大腸菌^3、7、18を含む細胞間変動を定量化するために多くのアプローチが開発されている。これらの方法は、遺伝子の活性化と代謝経路を研究するためによく使用されるが、特にこれが基本的な課題である生細胞における遺伝的回路に対して、特定のノイズ源の測定や分断のような確率的ノイズダイナミクスの研究にあまり焦点を当てずに^{使用される。}いくつかの要因は、回路自体に継承され(組み込み)、宿主細胞(外因)から派生し、遺伝的回路の連続的な性能を乱す可能性があります。本論文では、固有および外因性ノイズ源^6,22を含む大腸菌細胞の全雑音を定量化することを目的としたプロトコルを開発した。全ノイズを定量化し^、SNR23を評価することで、遺伝子回路の設計を改善することができます。この方法は、いくつかの蛍光タンパク質^6,20を監視することにより、独立したノイズ源を別々に測定するように改変することができる。ここで説明するプロトコルについては、環境条件を十分に制御し、外部要因の影響を受けることなく細胞の活性を継続的に測定します。一つの細胞内の蛍光タンパク質からのシグナルを時間の経過とともに測定し、同時にアガロース基板の下で画像化します。結果の画像は実験室のカスタムMATLABを使用して分析される。

理想的には、細胞内の蛍光タンパク質のリアルタイム活性を連続的に測定すると、細胞の増殖と分裂を通じて正確なデータが生成されます。しかし、そのようなデータを取得することは困難です。これは、励起プロセスで放射線にさらされたときの蛍光タンパク質(光漂白⁷⁾の分解によるものです。さらに、 大腸菌 細胞も興奮に敏感であり、光毒性7を引き起こしう^る。どちらの問題でも、取得できるフォトフレームの量と取得までの時間が制限されます。イメージング中に細胞を増殖させるために使用される基質および培地タイプ(例えば、リソゲニーブロス)も重要な役割を有する。蛍光性を最小限に抑え、細胞分裂時間を延長する最小限の培地を使用することを強くお勧めします。

さらに、サンプルは、以下の要件を考慮して調製する必要があります(1)低細胞分割率は、分割サイクルを密接にイメージングし、光毒性および光漂白の確率を低減するためのより少ない頻度の露出を可能にします。(2)実験の初めに、取得時間を約半分のマイルス化時間(2)低い細胞密度に設定することで、分裂の均一性と追跡性を向上させます。細胞密度は、このプロトコルの成功のための重要なパラメータであり、すべてのラボのために決定する必要がある 大腸菌 細胞の希釈比の影響を受けます。比率を確立するために、新しい 大腸菌 株または使用される媒体のそれぞれは、成長率グラフを取り付ける必要があります(補足図1)。OD_600nm = 0.1程度の初期密度から短いインキュベーション後に細胞が追加の揺れなしで成長できる場合、適切な比率が達成されました。この段階での細胞は、環境温度のみに応じて分裂する(3)細胞の動きの制限:細胞の動きは基質(アガロースパッド)の硬さに強く依存する。基材のハリは、総アガロースの量とゲル凝固時間に依存します。 エシェリヒア大腸菌 は有糸分裂を起じるように、ゲルを室温で一晩固化させることはできません。基板の安定性に影響を与える他の要因は、サンプルおよび湿度中の水の量を含む。その他の問題については、「代表結果」で詳しく説明します。このプロトコルは、多くの詳細を提供し、徐々に別のステップから移動します。このプロトコルは、イメージング実験に長い安定性を提供し、基本的な画像処理ツールを提供します。

プロトコル

1.メディアと文化の準備

1. 1,000xカルベニシリン(50mg/mL)または関連する抗生物質のストック溶液を調製する。
   1. .カルベニシリンの重量を0.5g。滅菌H_{2 O.}の10 mLを加える完全に溶解します。
   2. 0.22 μmシリンジフィルターを使用してカルベニシリンストックを殺菌します。抗生物質溶液をアリコートし、-20°Cで貯蔵する。
2. リソゲニーブロス(LB)プレートを調製するには、トリプトン5g、NaCl5g、酵母エキス2.5g、バクト寒天7.5g、0.5Lの無菌_H2O.オートクレーブで溶液を121°Cで20分間混ぜます。
   1. 溶融ゲル混合を50°Cの水浴に部分的に浸す。カルベニシリン(50mg/mL)を1,000μL加えます。
   2. 滅菌環境でペトリ皿を準備します。冷蔵庫に保管する前にプレートをセットしておきなさい。
3. M9の最小媒体の場合は、M9塩5x(56.4 g/L)、2Mグルコース、2%ビオチンフリーカザミノ酸の別々のストック溶液を調製してください。121°Cで20分間、ソリューションをオートクレーブします。
4. 5ペトリプレートを調製するには、低融解寒天の1125mgと寒天400mgを最小限の培地(1x M9)の89.2 mLと混合します。250 mL のエルレンマイヤーフラスコに2%カザミノ酸(2%[vol/vol])の10 mLを加えます。
   注:フラスコの内側の唇にメディアを注ぐことを確認してください。
5. 3~4秒の短いバーストで溶液をマイクロ波します。解がクリアになるまで繰り返します。
   注:沸点に達しないようにしてください。
6. 250 mL のエルレンマイヤーフラスコを温水浴(60°C)に入れて拡散してさらに混ぜ、温度が約45~50°Cになるまで冷まします。
7. プレートを注ぐベンチで炎を点灯します。
8. すべてのソリューションを次の順序ですばやく追加します。
   800 μL の 50% グリセロール (0.4% [vol/vol])
   チアミン(B1)の100 μL
   1100 μL のグルコース (2M)
   カルベニシリン100μL(50mg/mL)。
9. アーレンマイヤーフラスコを旋回して、寒天全体のすべての成分の均等な分布を確保します。
10. 炎の隣に一度に1枚のプレートを開け、注ぎ始めます。
    1. プレートを最初の固化するまで数分間ベンチに置いたままにしておきます。
    2. 水の凝縮がゲルに滴り落ちないように、プレートを逆さまにします。
    3. プレートを室温で約2時間固化したままにしておきます。
    4. プレートが固まり乾燥したら、4°Cで約3ヶ月間保存することができます。

2.細菌株およびプラスミドの構造

注:遺伝的回路は、1つの部分が含まれています。P_テトオ プロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質(GFP)で、構成的な発現を生じる。この研究における全てのプラスミドは、基本的な分子クローニング技術を用いて構築され、 エシェリヒア・コリ 10βに変換され、標準のヒートショックプロトコル²⁴を用いた。最終的な構造はテストのために 大腸菌 MG1655野生型株に変換されました。

1. 標準のヒートショックプロトコル²⁴で、所望のプラスミドを大腸菌MG1655細胞に変換する。
2. LB寒天プレート上の形質転換細胞を37°Cで一晩成長させます。
   注:ペトリ皿はステップ2.2から顕微鏡使用のために3日まで保つことが可能です。
3. 単一コロニーを5 mLのLBスープに接種し、関連する抗生物質をガラス管に含める。
4. 液体が濁るまで2時間インキュベーターで250rpmの揺れの速度で37°Cで細胞を成長させます。
5. 次のように希釈液の1 mLを準備します。
   最小メディアの892 μL(1x M9)
   グリセロール50%8 μL(0.4%[vol/vol])
   100 μL の 2% カザミノ酸 (0.2% [wt/vol])
   チアミン(B1)の1 μL
   11 μL のグルコース (2 M)
   関連する抗生物質の1 μL
   1. ミックスしてスピンダウンします。
6. ステップ2.4から2mLチューブに細胞培養液(1:30)を希釈し、30μLの 大腸菌 成長を希釈液1000μLに加えます(ステップ2.5)。
7. 37°Cで振る(250rpm)でチューブを1時間インキュベートします。
8. ステップ1.10で調製したM9プレート上で40 μL - 60 μLを成長させます。プレートを一晩37°Cでインキュベートします。
   注: めっきの光密度 (OD_600nm)は 0.1 前後である必要があります。
9. 35mmのガラス底板を3枚までベンチに置きます。
   メモ:プレートのガラスの厚さが、使用されている顕微鏡レンズに適していることを確認してください。
10. ゲルプレートに播種するための培養を準備し、ステップ2.9顕微鏡測定で調製したプレートからコロニーについてステップ2.3〜2.6を繰り返す。
11. 3つの顕微鏡プレートを作るために、次の溶液を準備します。
    1. 水浴を60°Cに予熱する。
    2. 低融解寒天の112.5mgと寒天40mgを8.92mLの最小限の培地(1x M9)と混ぜ、25mLのエルレンマイヤーフラスコに2%のカザミノ酸(0.2%[vol/vol])の1 mLを加えます。
       注:フラスコの内側の唇にメディアを注ぐことを確認してください。
12. 2~3秒の短いバーストで溶液をマイクロ波します。解がクリアになるまで繰り返します。
    メモ:沸点に達しないように注意してください。
13. 25 mL のエルレンマイヤーフラスコを温水浴(60°C)に入れて拡散してさらに混合し、温度が約45~50°Cになるまでベンチで冷却します。

3.アガロースパッドの作成

1. 70%エタノールのクリーンベンチ。クリーニングされたベンチの伸張テープ。テープが滑らかで、平らになっていることを確認します。
2. テープに1つ、近くに2つカバーリップを用意します。カバーリッドを準備します。
3. 水浴からフラスコ(ステップ2.14で準備)を取り出し、フラスコの外側をきれいに拭き取り、温度が約45〜50°Cになるまで冷却します。
4. ゲル溶液を作るために、次の順序ですべての溶液を素早く混ぜます:
   グリセロール50%80μL(0.4%[vol/vol])
   2%カザミノ酸の1 mL(0.2%[wt/vol])
   チアミン(B1)の10 μL
   110 μL のグルコース (2 M)
   関連する抗生物質の10 μL。
5. カバースリップにゲル1.5mLを注ぎ、2枚目の「サンドイッチ」で覆います。
6. エルレンマイヤーを湯風呂に戻します。蓋でサンドイッチを覆い、タイマーを20分間セットします。
7. 同時に、37°Cでステップ2.11から1時間(250rpm)でチューブをインキュベートする
8. 20分後にサンドイッチをひっくり返し(ステップ3.5)、それを覆い、1時間休ませます。
   注意:より良い結果のためにステップ3.8の間4 °Cで休むために「サンドイッチ」を残します。
9. 種子 エシェリヒア大腸菌 は、35ミリメートル皿にサンプルをピペットすることによってステップ3.7から培養します。
   注:細胞の6 μLを別々の小さな滴としてピペット処理すると、最良の結果が得られます。
10. 滴を少なくとも15分間、最大30分間乾燥させます。
11. ステップ3.8からサンドイッチの固化ゲルを、カバースリップを滑り落とすことによって露出させる。
12. 生検パンチまたはチップでサンドイッチを小さな個々のパッドにカットします。
13. サンプルにやさしく傾きます(ステップ3.9)。皿をベンチに20分間置いておきなさい。

4.顕微鏡イメージング用サンプルの準備

1. ステップ3.6から水浴からフラスコを取り除きます。フラスコの外側をきれいに拭き、室温(25°C)まで冷まします。
   メモ:タイマーが終了する約3分前にステップ4.1でフラスコを取り外します。
2. 円運動でプレート周囲にゲルの3mLを絶えず注ぎます。数分間固めるために残します。
3. テープでプレートをシールし、25 G針で穴を開けます。水の凝縮がゲルに滴り落ちるのを防ぐために、すべての皿を反転させます。
4. 4°Cで全ての料理を30分間インキュベートし、細胞の糸球菌を防ぎながら完全な固化を可能にします。
   注:連続測定のために4°Cにサンプルを残し、1日以下。
5. メーカーの指示に従って顕微鏡を起動します。
6. 最も低い増幅レンズを使用して初期フォーカスを見つけ、自動フォーカスシステム(AFS)をエンゲージします。
7. 必要に応じてオイルを使用し、オイルでレンズを溺れ、プラットフォームコントローラ(手動ではない)でプレートを移動することによって慎重に広げ、AFSは再び従事することができます。
8. Z ステップ断面の既定の提案に従って、Z 方向の相対断面を使用します。
   注:5分ごとに明るいフィールド画像と20分ごとに蛍光画像を撮影しました。場合によっては、最初の 30 分間にフォーカスを調整する必要があります。顕微鏡インキュベーターボックスとオイルを予熱しながら、サンプルを冷蔵しながら、焦点の初期損失を減らすのに役立つ傾向があります。

5.データ分析

メモ:顕微鏡データを処理するために、MATLABでコンピュータベースのソフトウェアを設計しました。このソフトウェアは、明るいフィールドのtiff画像とセグメントからの細胞境界の識別を容易にし、領域によって細胞をソートします。この画像解析の出力は、蛍光TIFF画像のマスクとして使用して、細胞の強度レベルを導出し、顕微鏡の分解能限界による細胞ハローなどの蛍光領域のアーチファクトを取り消すことができます。開発されたソフトウェアは、同様の作品7、25、26、27、28、29、30からインスピレーションを得て、ラボに合わせたエレガントなソリューションを提供します。

1. まず 、main_code.mで次のパラメータを定義します。
   1. 取得イメージのフォルダを定義します。
   2. イメージの時間の期間を定義する - 明るいフィールド チャネルの時間ステップ (分単位)。
   3. GFP イメージの取得速度 - GFP 周波数を定義します。
   4. 顕微鏡の解像度を定義します(つまり、1 μmのピクセル数)。
   5. ヒストグラムビン範囲 - セル領域範囲を定義します。
      注: 細胞領域に従ってデータを分類するプロセスは、フローサイトメトリーデータ分析における格数化の原理に似ています。ゲートは、通常は前方散乱し、側面が散乱し、関心のあるこれらの集団を分離して定量化するために、共通の特性を持つ細胞の集団の周りに配置されます。顕微鏡検査は、ゲート、調査、いくつかの細胞群を定量化することができます。
   6. 畳み込みカーネル (3,3) を定義する - このパラメータは、グローバルなしきい値(count_cells.m)によってセル境界を検出します。
      注: このセットアップは、ラボまたは顕微鏡を交換する場合にのみ必要です。ソフトウェアでは、入力明視野チャンネルにインデックスc1、c2とラベル付けされた蛍光チャネルが必要です。
2. main_code.m を実行すると、他のすべてのスクリプト (count_cells.m、 cell_growth_rate.m) が自動的に実行されます。
   1. プログラムは、明視野画像を自動的にセグメント化します( 補足図2-4を参照)。
   2. セグメンテーション画像と蛍光画像(GFP)を組み合わせて、細胞あたりの強度レベルを抽出します。
   3. 時間によって細胞の量のグラフを計算し、指数的な成長に応じてフィットします。
   4. 各セル領域の範囲の平均と標準偏差 (STD) を計算します。
   5. 各セル領域の範囲に対する信号対雑音比(SNR)を計算します。
   6. 強度別のセル量の分布をプロットして適合させます。
   7. 分散係数 (CV) を計算し、フローアナライザデータと比較します。
      注:ソフトウェアは、新しいフォルダ「あなたのフォルダ/セグメント化」でconv_kernelを調整するための最終的なセグメンテーション画像を出力として提供します。ソフトウェアは、新しいフォルダ「あなたのフォルダ/グラフ」内のグラフを出力として与えます。
3. 実験を比較するには 、compare_experiments.mを使用します。
   1. 保存されたグラフのディレクトリと \CompareResult ディレクトリのアドレスを定義します。
   2. ファイルを実行します。

結果

ソフトウェアは、オフホワイトとブラックの明るいフィールドドメイン画像を分析します。 大腸菌 は、オフホワイトの背景に黒い楕円形のように見え、輝度のダイナミックレンジは、その中心にスパイクを示す必要があります(図1)。蛍光画像では、細胞は小さなハローを有するが、楕円形の個々の細胞はまだ解決することができる。有糸分裂イベントは、最初?...

ディスカッション

本研究では、エ シェリヒア・コリ 生細胞のコンピュータトレースを可能にするプロトコルを開発し、時間の経過に従って分裂および蛍光レベルを追った。このプロトコルは、我々はリアルタイムでCVとSNRを測定することにより 、大腸菌 の遺伝的回路の確率的ダイナミクスを定量化することができます。このプロトコルでは、 図 10に示すように、2 つの異なる回路?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD - Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD - Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD - Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation