מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

Summary

עבודה זו מציגה שיטת מיקרוסקופיה המאפשרת הדמיה חיה של תא יחיד של Escherichia coli לניתוח וכימות של ההתנהגות הסטוקסטית של מעגלי גנים סינתטיים.

Abstract

הפרוטוקול שפותח כאן מציע כלי המאפשר מעקב ממוחשב אחר חטיבת קולי Escherichia ורמות פלואורסצנט על פני מספר שעות. התהליך מתחיל בסינון מושבות ששורדות על מדיה מינימלית, בהנחה שרק Escherichia coli מחסה פלסמיד הנכון יוכל לשגשג בתנאים הספציפיים. מכיוון שתהליך בניית מעגלים גנטיים גדולים, הדורש הרכבה של חלקי דנ"א רבים, הוא מאתגר, רכיבי מעגלים מופצים לעתים קרובות בין פלסמידים מרובים במספרי העתק שונים הדורשים שימוש במספר אנטיביוטיקה. מוטציות בפלסמיד יכולות להרוס את שעתוק הגנים של עמידות לאנטיביוטיקה ולהצטלב עם ניהול משאבים בתא המוביל לנמק. המושבה שנבחרה ממוקמת על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית וכמה מישורי מיקוד נבחרים למעקב אחר מיקרוסקופיה הן בתחומים בהירים והן בתחומים פלואורסצנטיים. הפרוטוקול שומר על מוקד התמונה במשך יותר מ -12 שעות בתנאים ראשוניים שלא ניתן לווסת, ויוצר כמה קשיים. לדוגמה, תאים מתים מתחילים להצטבר בשדה המיקוד של העדשות לאחר כמה שעות של הדמיה, מה שגורם לרעלים להצטבר והאות לטשטש ולהתנוון. דלדול של חומרים מזינים מציג תהליכים מטבוליים חדשים לעכב את התגובה הרצויה של המעגל. טמפרטורת הניסוי מורידה את ההשפעה של גורם ואנטיביוטיקה, אשר יכול לפגוע עוד יותר את האמינות של האות. ג'ל המדיה המינימלי מתכווץ ומתייבש, וכתוצאה מכך המיקוד האופטי משתנה עם הזמן. פיתחנו שיטה זו כדי להתגבר על אתגרים אלה Escherichia coli, בדומה לעבודות קודמות פיתוח שיטות אנלוגיות עבור מיקרו אורגניזמים אחרים. בנוסף, שיטה זו מציעה אלגוריתם לכימות הרעש הסטוצ'סטי הכולל בתאים ללא שינוי ושינוי, ומוצאת כי התוצאות עולות בקנה אחד עם תחזיות מנתח זרימה כפי שמוצג על ידי מקדם דומה של וריאציה (CV).

Introduction

ביולוגיה סינתטית היא תחום רב תחומי שהתגלה בעשור האחרון ומטרתו לתרגם עקרונות תכנון הנדסי לתכנון ביולוגי רציונלי^1,2,3 , במאמץ להשיג^{אינטגרציה}ועיבוד רב-תחומי בתאים חיים להבנת המדע הבסיסי^4,5, יישומים אבחון, טיפולי וביוטכנולוגי^6,7,8,9,10. היכולת שלנו לכמת את תגובת פלט הקלט של מעגלי גנים סינתטיים עברה מהפכה על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה חד-תאית, כולל מנתח הזרימה והדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן לשגות¹¹. מנתח זרימה משמש לעתים^קרובותכדי למדוד את התגובה של מעגלים אלה במצב יציב 1^,12, מיקרוסקופיה הפוכה משמשת למדידת התגובה הדינמית של מעגלי גנים סינתטיים ברמה של תא יחיד³. לדוגמה, אחת העבודות המוקדמות בביולוגיה סינתטית כללה בניית רשתות מתנד גנטיות בתאים חיים באמצעות לולאות משוב שליליות עם עיכוב³. מאוחר יותר, מעגלי המתנד הגנטי הוחלו כדי להבין שליטה מטבולית בסביבה הדינמית של תאים^{חיים 4}. מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן לשגות היא שיטה אחת לאפיין מעגלים כאלה. אנו משערים כי התאים המארחים, Escherichia coli, לסנכרן בעת יצירת מושבות מיקרו, המאפשר מדידה של אות וחישוב של רעש מבלי לעקוב אחר יחסי אם ובת מדויקים.

רעש הוא היבט בסיסי, אינהרנטי של מערכות ביולוגיות הנובעות לעתים קרובות ממקורות מרובים. קחו לדוגמה, תגובות ביוכימיות המערבות אותות שמקורם בהובלת נשאים אקראיים נפרדים כגון דיפוזיה של חלבונים¹³. אותות אלה מתפשטים עם תנודות אקראיות¹⁴. מקורות רעש אחרים הם זמינות משאבים, חלוקת תאים ושינויים בתנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות ולחץ. אותות ביולוגיים המתפשטים במעגלי גנים סינתטיים לעיתים קרובות יש אות נמוך מאוד יחס רעש (SNR), אשר מפריע לביצועים של מעגלים כאלה. לכן, תכנון מעגל גנטי נשאר אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של^{הנדסה גנטית 15}. לדוגמה, בניגוד לרוב הגישות המחשבות רק את ביטוי הגנים הממוצע (הנמדד על פני אוכלוסיית התאים כולה), השונות של האות הנמדד נחשבת על מנת להנדס התנהגות צפויה באמצעות רשתות גנים סינתטיות¹². ככזה, רמות השונות או הרעש בביטוי החלבון ממלאות תפקיד דומיננטי בעיצוב וביצועים של מעגלי גנים אנלוגיים ודיגיטליים^1,16,17.

גישות רבות פותחו כדי לכמת את השונות בין תא לתא, כולל ב Escherichia coli^3,7,18. שיטות אלה משמשות לעתים קרובות לחקר הפעלת גנים ומסלולים מטבוליים, אולם עם פחות התמקדות בחקר דינמיקת רעש סטוכסטי, כמו מדידה והתנתקות של מקורות רעש ספציפיים, במיוחד עבור מעגלים גנטיים בתאים חיים שבהם זהו אתגר בסיסי^19,20,21. מספר גורמים, שניהם תורשתיים למעגל עצמו (מהותי) ונגזרים מהתאים המארחים (חיצוניים), יכולים להפריע לביצועים המתמשכים של מעגלים גנטיים. במאמר זה, פיתחנו פרוטוקול שמטרתו לכמת את הרעש הכולל בתאי קולי Escherichia, כולל מקורות רעש מהותיים ו extrinsic^6,22. על ידי כימות הרעש הכולל ולאחר מכן הערכת SNR²³, העיצוב של מעגלי גנים ניתן לשפר. שיטה זו ניתנת לשינוי כדי למדוד מקורות רעש עצמאיים בנפרד, על ידי ניטור מספר חלבונים פלואורסצנטיים^6,20. עבור הפרוטוקול המתואר כאן, אנו שומרים על התנאים הסביבתיים מבוקרים היטב ומודדים ללא הרף את פעילות התאים ללא השפעה של גורמים חיצוניים. אנו מודדים את האות מחלבונים פלואורסצנטיים בתאים בודדים לאורך זמן ובו זמנית מדימויים אותם תחת מצע אגרוז. התמונות המתקבלות מנותחות באמצעות MATLAB המותאם אישית של המעבדה.

באופן אידיאלי, מדידה רציפה של הפעילות בזמן אמת של חלבונים פלואורסצנטיים בתוך התא תייצר נתונים מדויקים באמצעות הצמיחה והחלוקה של התאים. עם זאת, זה מאתגר לרכוש נתונים כאלה. זאת בשל השפלה של חלבונים פלואורסצנטיים, המכונה הלבנת תמונות⁷, כאשר הם נחשפים לקרינה בתהליך העירור. יתר על כן, תאי קולי Escherichia רגישים גם עבור עירור, אשר עלול להוביל phototoxicity⁷. שתי הבעיות מגבילות את כמות מסגרות התמונות שניתן להשיג ואת הזמן בין רכישות. מצע וסוגים בינוניים (למשל, מרק lysogeny) המשמש לגידול התאים במהלך ההדמיה יש גם תפקיד קריטי. מומלץ מאוד להשתמש במדיום מינימלי, הממזער רקע שאינו פלואורסצנטי ומאריך את זמן חלוקת התאים.

יתר על כן, המדגם צריך להיות מוכן בהתחשב בדרישות הבאות (1) שיעור חלוקת תאים נמוך מאפשר חשיפות תכופות פחות עבור הדמיה צמודה מחזור החלוקה והפחתת ההסתברות של phototoxicity ו photobleaching. הגדרנו את זמן הרכישה לכמחצית מזמן המיטוזיס החזוי (2) צפיפות תאים נמוכה בתחילת הניסוי מאפשרת אחידות ויכולת מעקב טובות יותר של החלוקה. צפיפות התאים מושפעת מיחס הדילול של תאי קולי Escherichia, המהווה פרמטר משמעותי להצלחת פרוטוקול זה ויש לקבוע אותו עבור כל מעבדה. על מנת לקבוע את היחס, כל זן קולי חדש של Escherichia או מדיה בשימוש צריך להיות מצויד גרפים קצב הצמיחה (איור משלים 1). יחס מתאים הושג אם תאים יכולים לגדול ללא רעידות נוספות לאחר דגירה קצרה מתוך צפיפות ראשונית של כ OD_600nm = 0.1. תאים בשלב זה יתחלקו בהתאם לטמפרטורת הסביבה בלבד (3) הגבלת תנועת התאים: תנועת התאים תלויה מאוד בתקיפות המצע (כרית agarose). מוצקות המצע תלויה בכמות ההתעוררות הכוללת ובזמן התמצקות הג'ל. ג'לים לא ניתן להשאיר כדי לחזק את הלילה בטמפרטורת החדר, כמו קולי Escherichia יעבור מיטוזה. גורמים אחרים המשפיעים על יציבות המצע כוללים את כמות המים במדגם והלחות. נושאים נוספים נידונים בפירוט בתוצאות הנציגות. פרוטוקול זה מספק פרטים רבים ועובר בהדרגה משלב אחד למשנהו. הפרוטוקול מציע יציבות ארוכה לניסויי הדמיה ומספק כלי בסיסי לעיבוד תמונה.

Protocol

1. הכנת מדיה ותרבות

1. הכן פתרון מלאי של 1,000x קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל) או אנטיביוטיקה רלוונטית.
   1. . שוקל 0.5 גרם של קרבניצילין. הוסף 10 מ"ל של סטרילי H₂O. להתמוסס לחלוטין.
   2. לעקר מניית קרבניצילין באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. Aliquot פתרון אנטיביוטי ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
2. כדי להכין מרק lysogeny (LB) צלחות, לערבב 5 גרם של טריפטון, 5 גרם של NaCl, 2.5 גרם של תמצית שמרים ו 7.5 גרם של אגר Bacto עם 0.5 L של H סטרילי₂O. Autoclave הפתרון ב 121 °C (60 °F) במשך 20 דקות.
   1. שקועים חלקית בתערובת הג'ל המותכת באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס. הוסף 1,000 μL של קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל).
   2. מכינים מנות פטרי בסביבה סטרילית. השאירו את הצלחות כדי להגדיר לפני אחסון אותם במקרר.
3. למדיה מינימלית M9, הכינו פתרונות מלאי נפרדים של הדברים הבאים: 5x מלחי M9 (56.4 גרם לליטר), 2 מ' גלוקוז ו-2% חומצות קאסאמינו נטולות ביוטין. מובלעת אוטומטית את הפתרונות ב 121 °C (69 °F) במשך 20 דקות.
4. להכנת 5 צלחות פטרי, מערבבים 1125 מ"ג של אגר נמס נמוך ו 400 מ"ג אגר עם 89.2 מ"ל של מדיה מינימלית (1x M9). הוסיפו 10 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (2% [vol/vol]) בבקבוק ארלנמאייר של 250 מ"ל.
   הערה: הקפד לשפוך את המדיה על השפתיים הפנימיות של הבקבוק.
5. מיקרוגל הפתרון בצרורות קצרים של 3 עד 4 שניות. חזור על הפעולה עד שהפתרון יתבהר.
   הערה: הקפד לא להגיע לנקודת רתיחה.
6. מניחים את הבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל באמבט מים חמים (60 מעלות צלזיוס) כדי לערבב עוד יותר על ידי דיפוזיה, ולהשאיר אותו להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.
7. הדליקו את הלהבה על ספסל היציקה.
8. הוסף במהירות את כל הפתרונות בסדר הבא:
   800 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol])
   100 μL של תיאמין (B1)
   1100 μL של גלוקוז (2M)
   100 μL של קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל).
9. מערבולת בקבוק ארלנמייר כדי להבטיח הפצה שווה של כל החומרים ברחבי אגר.
10. פותחים צלחת אחת בכל פעם ליד הלהבה ומתחילים לשפוך.
    1. השאירו את הצלחות על הספסל במשך כמה דקות עד התגבשות ראשונית.
    2. הופכים את הצלחות כדי למנוע עיבוי מים לטפטף על הג'ל.
    3. השאירו את הצלחות כדי לחזק בטמפרטורת החדר במשך כ 2 שעות.
    4. לאחר הצלחות יש מוצק ומיובש, הם יכולים להיות מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 3 חודשים.

2. זני חיידקים ובניית פלסמידים

הערה: המעגל הגנטי מכיל חלק אחד; חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המונע על ידי מקדם P_tetO וכתוצאה מכך ביטוי מכונן. כל הפלסמידים בעבודה זו נבנו בטכניקות שיבוט מולקולריות בסיסיות והפכו לאשריצ'יה קולי 10β, באמצעות פרוטוקול זעזוע חום סטנדרטי²⁴. המבנה הסופי הפך Escherichia coli MG1655 סוג הבר זן לבדיקה.

1. להפוך את הפלסמיד הרצוי לתאי Escherichia coli MG1655 עם פרוטוקול זעזוע חום סטנדרטי²⁴.
2. לגדל את התאים שהשתנו על צלחת אגר LB לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן לשמור על מנות פטרי משלב 2.2 עד 3 ימים לשימוש מיקרוסקופי.
3. לחסן מושבה אחת לתוך 5 מ"ל של מרק LB בתוספת אנטיביוטיקה רלוונטית בצינור זכוכית.
4. לגדל תאים ב 37 °C (69 °F) עם 250 סל"ד רועד מהירות באינקובטור במשך 2 שעות עד הנוזל מעונן.
5. הכן 1 מ"ל של פתרון דילול כדלקמן:
   892 μL של מדיה מינימלית (1x M9)
   8 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol])
   100 μL של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [wt/vol])
   1 μL של תיאמין (B1)
   11 μL של גלוקוז (2 מטר)
   1 μL של אנטיביוטיקה רלוונטית
   1. מערבבים ומסתובבים.
6. לדלל את תרבות התא (1:30) משלב 2.4 לתוך צינור 2 מ"ל על ידי הוספת 30 μL של צמיחת קולי Escherichia ל 1000 μL של פתרון דילול (שלב 2.5).
7. דגירה הצינור במשך 1 שעה עם רועד (250 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס.
8. לגדול 40 μL - 60 μL על לוחות M9 מוכן בשלב 1.10. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
   הערה: הצפיפות האופטית (OD_600nm)לציפוי צריכה להיות סביב 0.1.
9. מניחים עד שלוש צלחות זכוכית 35 מ"מ התחתון על הספסל.
   הערה: ודא שלזכוכית הצלחת יש את העובי הנכון עבור עדשות המיקרוסקופ המשמשות.
10. הכינו את התרבות לזריעת צלחות ג'ל, חזרו על שלבים 2.3 עד 2.6 למושבות מהצלחת שהוכנו במדידות מיקרוסקופ בשלב 2.9.
11. הכינו את הפתרון הבא להכנת שלוש לוחות מיקרוסקופ.
    1. מחממים את אמבט המים ל 60 מעלות צלזיוס.
    2. יש לערבב 112.5 מ"ג של אגר נמס נמוך ו-40 מ"ג אגר עם 8.92 מ"ל של מדיה מינימלית (1x M9) ולהוסיף 1 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [vol/vol]) בבקבוק ארלנמייר של 25 מ"ל.
       הערה: הקפד לשפוך את המדיה על השפתיים הפנימיות של הבקבוק.
12. מיקרוגל הפתרון בצרורות קצרים של 2 עד 3 שניות. חזור על הפעולה עד שהפתרון יתבהר.
    הערה: הקפד לא להגיע לנקודת רתיחה.
13. מניחים את הבקבוק ארלנמאייר 25 מ"ל באמבט מים חמים (60 מעלות צלזיוס) לערבוב נוסף על ידי דיפוזיה, ולהשאיר אותו להתקרר על הספסל עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.

3. הכנת רפידות agarose

1. ספסל נקי עם 70% אתנול. סרט מתיחה על הספסל הנקי. ודא שהקלטת חלקה ומפולסת.
2. הכינו שני כיסויים: אחד בקלטת והשני בקרבת מקום. הכינו כיסוי.
3. הסר בקבוקון (מוכן בשלב 2.14) מאמבט מים, לנגב את החלק החיצוני של הבקבוק נקי ולהשאיר אותו להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.
4. כדי להפוך את פתרון הג'ל, לערבב במהירות את כל הפתרונות בסדר הבא:
   80 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol])
   1 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [wt/vol])
   10 μL של תיאמין (B1)
   110 μL של גלוקוז (2 M)
   10 μL של אנטיביוטיקה רלוונטית.
5. יוצקים 1.5 מ"ל של הג'ל על העטיפה ומכסים אותו בחתיכה השנייה מכינים "כריך".
6. החזירו את הארלנמייר לאמבטיית המים החמים. מכסים את הכריך עם המכסה ומגדירים טיימר במשך 20 דקות.
7. במקביל, דגירה הצינור משלב 2.11 עבור 1 שעה ב 37 °C (69 °F) עם רועד (250 סל"ד)
8. לאחר 20 דקות להפוך את הכריך (שלב 3.5), לכסות אותו ולהשאיר לנוח במשך 1 שעה.
   הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר להשאיר את "כריך" לנוח ב 4 מעלות צלזיוס למשך שלב 3.8.
9. זרע Escherichia coli תרבות משלב 3.7 על ידי pipeting המדגם על צלחת 35 מ"מ.
   הערה: Pipeting 6 μL של תאים כמו טיפות קטנות נפרדות נותן את התוצאות הטובות ביותר.
10. אפשר את הטיפות להתייבש, לפחות 15 דקות ועד 30 דקות.
11. לחשוף את הג'ל המוצק של הכריך משלב 3.8 על ידי החלקת הכיסוי משם.
12. חותכים כריך לרפידות בודדות קטנות עם פונץ' ביופסיה או טיפ.
13. להישען אותו בעדינות על המדגם (שלב 3.9). השאירו את המנה במשך 20 דקות על הספסל.

4. הכנת המדגם להדמיית מיקרוסקופיה

1. הסר את הבקבוק מאמבט מים משלב 3.6. לנגב את החלק החיצוני של הבקבוק נקי ולתת מגניב לטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
   הערה: הסר את הבקבוק בשלב 4.1 כ-3 דקות לפני סיום שעון העצר.
2. יוצקים 3 מ"ל של הג'ל כל הזמן להיקף הצלחת בתנועה מעגלית. השאירו להתמצק במשך כמה דקות.
3. לאטום צלחות עם קלטת לנקב כמה חורים עם מחט 25 G. הופכים את כל הכלים כדי למנוע עיבוי מים נוטף על הג'ל.
4. דגירה כל הכלים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לאפשר התמצקות מלאה תוך מניעת מיטוזה התא.
   הערה: השאירו דגימות ב-4°C למדידות רצופות, לא יותר מיום אחד.
5. הפעל את המיקרוסקופ לפי הוראות היצרן.
6. מצא את המוקד הראשוני באמצעות עדשת ההגברה הנמוכה ביותר ונהל מערכת מיקוד אוטומטית (AFS).
7. השתמש בשמן במידת הצורך, להטביע את העדשה עם שמן ולהפיץ אותו בזהירות על ידי הזזת הצלחת עם בקר פלטפורמה (לא באופן ידני) ו AFS יכול להיות מעורב שוב.
8. השתמש חתך יחסית בכיוון Z, בעקבות הצעת ברירת המחדל עבור חתכים שלב Z.
   הערה: צילמנו תמונות שדה בהירות כל 5 דקות ותמונות פלואורסצנטיות כל 20 דקות. לפעמים המיקוד צריך להיות מותאם במהלך 30 הדקות הראשונות. חימום מראש של קופסת החממה והשמן של המיקרוסקופ, תוך קירור המדגם נוטה לסייע בהפחתת אובדן המיקוד הראשוני.

5. ניתוח נתונים

הערה: כדי לעבד נתוני מיקרוסקופיה, עיצבנו תוכנה מבוססת מחשב ב- MATLAB. תוכנה זו מאפשרת זיהוי של גבולות התא מתמונות tiff שדה בהיר ומקטעים וממיין תאים לפי אזור. הפלט של ניתוח תמונה זה יכול לשמש כמסכה על תמונות טיפ פלואורסצנטיות כדי להפיק רמות עוצמת תא ולבטל חפצים בתחום הפלואורסצנטי כגון הילה של התא עקב מגבלות רזולוציית מיקרוסקופ. התוכנה שפותחה נוצרה בהשראת עבודות^{דומות 7,25,26,27,28,29,30} ומספק פתרון אלגנטי המותאם למעבדה.

1. תחילה, הגדר את הפרמטרים הבאים main_code.m.
   1. הגדר את התיקיה של תמונות הרכישה.
   2. הגדר את פרק הזמן של התמונה - שלב זמן ערוץ שדה בהיר בדקות.
   3. הגדר את תדירות GFP - קצב הרכישה של תמונות GFP.
   4. הגדר את רזולוציית המיקרוסקופ (כלומר, כמה פיקסלים שווים ל- μm אחד).
   5. הגדר טווח סל היסטוגרמה - טווח אזור תאים.
      הערה: תהליך סיווג הנתונים לפי אזור התא דומה לעקרונות של גטינג בניתוח נתוני cytometry זרימה. שערים ממוקמים סביב אוכלוסיות של תאים בעלי מאפיינים משותפים, בדרך כלל מפוזרים קדימה וצדדים מפוזרים, כדי לבודד ולכמת אוכלוסיות אלה של עניין. מיקרוסקופיה מאפשרת שער, לחקור ולכמת מספר קבוצות תאים.
   6. הגדר ליבת קונבולוציה (3,3) - פרמטר זה מזהה גבולות תאים על ידי סף כללי (count_cells.m).
      הערה: התקנה זו נדרשת רק בעת שינוי המעבדה או המיקרוסקופ. התוכנה דורשת את ערוץ שדה בהיר הקלט להיות מסומן עם אינדקס c1, ערוץ פלואורסצנטי שכותרתו c2.
2. הפעל main_code.m, אשר יפעיל את כל קבצי ה- Script האחרים באופן אוטומטי (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
   1. התוכנית מקטעת באופן אוטומטי תמונות שדה בהיר (ראה איור משלים 2.4).
   2. שלב את תמונת הפילוח עם תמונת פלואורסצנט (GFP) כדי לחלץ את רמת העוצמה לכל תא.
   3. חשב את הגרף של כמות התאים לפי זמן והתאם בהתאם לצמיחה מעריכית.
   4. חשב את הממוצע וסטיית התקן (STD) עבור כל טווח אזור תאים.
   5. חשב את יחס האות לרעש (SNR) עבור כל טווח אזור תא.
   6. התווה והתאם את התפלגות כמות התאים לפי עוצמה.
   7. חשב את מקדם השונות (CV) והשווה לנתוני מנתח הזרימה.
      הערה: התוכנה תעניק כפלט את תמונות הפילוח הסופיות להתאמת conv_kernel בתיקיה חדשה "folder/Segmented". התוכנה תיתן כפלט את הגרפים בתיקיה חדשה "folder /Graphs שלך.
3. על מנת להשוות בין ניסויים, להשתמש compare_experiments.m.
   1. הגדר ספריות עבור הגרפים השמורים והכתובת עבור הספריה \CompareResult.
   2. הפעל את הקובץ.

תוצאות

התוכנה מנתחת תמונות תחום שדה בהיר כי הם מחוץ לבן ושחור. קולי Escherichia ייראה כמו צורות מלבניות שחורות על רקע לבן מחוץ למגוון דינמי של זוהר צריך להראות ספייק במרכזו (איור 1). בתמונות פלואורסצנטיות תאים עשויים להיות הילה קטנה, אך עדיין ניתן לפתור תאים בודדים עם צורות מלבניות....

Discussion

בעבודה זו פיתחנו פרוטוקול המאפשר מעקב ממוחשב אחר תאים חיים של Escherichia coli, בעקבות חלוקה ורמות פלואורסצנטיות על פני תקופה של שעות. פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת את הדינמיקה הסטוצ'סטית של מעגלים גנטיים ב Escherichia coli על ידי מדידת CV ו SNR בזמן אמת. בפרוטוקול זה השווינו את ההתנהגויות הסטוצ'סטיו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD - Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD - Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD - Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation