Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo

Resumo

Este trabalho apresenta um método de microscopia que permite a imagem viva de uma única célula de Escherichia coli para análise e quantificação do comportamento estocástico de circuitos genéticos sintéticos.

Resumo

O protocolo desenvolvido aqui oferece uma ferramenta para permitir o rastreamento computacional da divisão Escherichia coli e níveis fluorescentes ao longo de várias horas. O processo começa por triagem de colônias que sobrevivem em meios mínimos, assumindo que apenas Escherichia coli abrigando o plasmídeo correto será capaz de prosperar nas condições específicas. Uma vez que o processo de construção de grandes circuitos genéticos, exigindo a montagem de muitas partes de DNA, é desafiador, os componentes do circuito são frequentemente distribuídos entre vários plasmídeos em diferentes números de cópias que requerem o uso de vários antibióticos. Mutações no plasmídeo podem destruir a transcrição dos genes de resistência a antibióticos e interjeição com o gerenciamento de recursos na célula que leva à necrose. A colônia selecionada é definida em uma placa de Petri de fundo de vidro e alguns planos de foco são selecionados para rastreamento de microscopia em domínios de campo brilhante e fluorescentes. O protocolo mantém o foco da imagem por mais de 12 horas em condições iniciais que não podem ser reguladas, criando algumas dificuldades. Por exemplo, as células mortas começam a se acumular no campo de foco das lentes após algumas horas de imagem, o que faz com que as toxinas se acumulem e o sinal desfoque e decadeia. O esgotamento dos nutrientes introduz novos processos metabólicos e dificulta a resposta desejada do circuito. A temperatura do experimento reduz a eficácia dos indutores e antibióticos, o que pode danificar ainda mais a confiabilidade do sinal. O gel de mídia mínimo encolhe e seca, e como resultado o foco óptico muda ao longo do tempo. Desenvolvemos esse método para superar esses desafios na Escherichia coli,semelhante aos trabalhos anteriores que desenvolvem métodos análogos para outros microrganismos. Além disso, este método oferece um algoritmo para quantificar o ruído estocástico total em células não alteradas e alteradas, descobrindo que os resultados são consistentes com previsões de analisador de fluxo, como mostrado por um coeficiente semelhante de variação (CV).

Introdução

A biologia sintética é um campo multidisciplinar que surgiu na última década e tem como objetivo traduzir princípios de design de engenharia em design biológico racional^1,2,3, em um esforço para alcançar a integração multiprofissional e o processamento em células vivas para a compreensão da ciência básica^4,5, aplicações diagnósticas, terapêuticas e biotecnológicas^6,7,8,9,10. Nossa capacidade de quantificar a resposta de entrada-saída de circuitos genéticos sintéticos foi revolucionada pelos recentes avanços na tecnologia unicelular, incluindo o analisador de fluxo e imagens de células vivas usando microscopia automatizada de lapso de tempo¹¹. Um analisador de fluxo é frequentemente usado para medir a resposta desses circuitos no estado estável^1,12, e a microscopia invertida é usada para medir a resposta dinâmica de circuitos genéticos sintéticos ao nível de uma única célula³. Por exemplo, um dos primeiros trabalhos em biologia sintética envolveu a construção de redes osciladoras genéticas em células vivas usando loops de feedback negativos com um atraso³. Posteriormente, os circuitos osciladores genéticos foram aplicados para entender o controle metabólico no ambiente dinâmico das células vivas⁴. A microscopia de lapso de tempo automatizado é um método para caracterizar tais circuitos. Temos a hipótese de que as células hospedeiras, Escherichia coli,sincronizam ao formar micro colônias, permitindo a medição do sinal e o cálculo do ruído sem rastrear relações exatas entre mãe e filha.

O ruído é um aspecto fundamental e inerente dos sistemas biológicos, muitas vezes decorrentes de múltiplas fontes. Considere, por exemplo, reações bioquímicas envolvendo sinais originários do transporte de portadores aleatórios discretos, como a difusão de proteínas¹³. Estes sinais se propagam com flutuações aleatórias¹⁴. Outras fontes de ruído são disponibilidade de recursos, divisão celular e variações em condições ambientais como temperatura, umidade e pressão. Sinais biológicos que se propagam em circuitos genéticos sintéticos muitas vezes têm uma relação sinal-ruído muito baixa (SNR), o que perturba o desempenho de tais circuitos. Portanto, o design do circuito genético continua sendo um dos aspectos mais desafiadores da engenharia genética¹⁵. Por exemplo, ao contrário da maioria das abordagens que calculam apenas a expressão genética média (medida sobre toda a população celular), a variância do sinal medido é considerada para projetar comportamentos previsíveis através de redes genéticas sintéticas¹². Como tal, os níveis de variabilidade ou ruído na expressão proteica desempenham um papel dominante no design e desempenho dos circuitos genéticos analógicos e digitais^1,16,17.

Muitas abordagens foram desenvolvidas para quantificar a variabilidade célula-celular, inclusive em Escherichia coli^3,7,18. Esses métodos são frequentemente usados para estudar a ativação genética e vias metabólicas, porém com menos foco no estudo da dinâmica do ruído estocástico, como medir e desembaraçar fontes específicas de ruído, especialmente para circuitos genéticos em células vivas onde este é um desafio fundamental^19,20,21. Vários fatores, ambos herdados ao próprio circuito (intrínseco) e derivados das células hospedeiras (extrínsecos), podem perturbar o desempenho contínuo dos circuitos genéticos. Neste artigo, desenvolvemos um protocolo que visa quantificar o ruído total nas células Escherichia coli, incluindo as fontes de ruído intrínsecas e extrínsecas^6,22. Quantificando o ruído total e avaliando o SNR^23,o design dos circuitos genéticos pode ser melhorado. Este método pode ser modificado para medir fontes de ruído independentes separadamente, monitorando várias proteínas fluorescentes^6,20. Para o protocolo aqui descrito, mantemos as condições ambientais bem controladas e medimos continuamente a atividade das células sem a influência de fatores externos. Medimos o sinal de proteínas fluorescentes em células únicas ao longo do tempo e simultaneamente as imagem sob um substrato agarose. As imagens resultantes são analisadas usando o MATLAB personalizado do laboratório.

Idealmente, a medição contínua da atividade em tempo real de proteínas fluorescentes dentro de uma célula produzirá dados precisos através do crescimento e divisão das células. No entanto, é desafiador adquirir tais dados. Isso se deve à degradação das proteínas fluorescentes, conhecidas como foto-branqueamento^7,quando são expostas à radiação no processo de excitação. Além disso, as células Escherichia coli também são sensíveis à excitação, o que pode levar à fototoxicidade⁷. Ambas as questões limitam a quantidade de quadros fotográficos que podem ser adquiridos e o tempo entre as aquisições. Os tipos de substrato e médio (por exemplo, caldo de lysogeny) que é usado para cultivar as células durante a imagem também têm um papel crítico. Recomendamos fortemente o uso de meio mínimo, que minimiza o fundo não fluorescente e amplia o tempo de divisão celular.

Além disso, a amostra precisa ser preparada considerando os seguintes requisitos (1) A baixa taxa de divisão celular permite exposições menos frequentes para imagens próximas do ciclo de divisão e redução da probabilidade de fototoxicidade e fotobleaching. Estabelecemos o tempo de aquisição para cerca de metade do tempo de mitose previsto (2) A baixa densidade celular no início do experimento permite uma melhor uniformidade e rastreabilidade da divisão. A densidade celular é afetada pela razão de diluição das células Escherichia coli, que é um parâmetro significativo para o sucesso deste protocolo e precisa ser determinada para cada laboratório. Para estabelecer a razão, cada nova cepa de Escherichia coli ou mídia utilizada deve ser equipada com gráficos de taxa de crescimento(Figura Suplementar 1). Uma razão apropriada foi alcançada se as células podem crescer sem agitação adicional após uma curta incubação de uma densidade inicial de cerca de OD_600nm = 0,1. As células nesta fase se dividirão de acordo com a temperatura do ambiente apenas (3) Restrição do movimento celular: o movimento celular depende fortemente da firmeza do substrato (agarose pad). A firmeza do substrato depende da quantidade de agarose total e do tempo de solidificação do gel. Os géis não podem ser deixados para solidificar durante a noite à temperatura ambiente, pois a Escherichia coli sofrerá mitose. Outros fatores que afetam a estabilidade do substrato incluem a quantidade de água na amostra e a umidade. Questões adicionais são discutidas detalhadamente nos Resultados Representativos. Este protocolo fornece muitos detalhes e gradualmente passa de um passo para outro. O protocolo oferece estabilidade longa para experimentos de imagem e fornece uma ferramenta básica de processamento de imagens.

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Protocolo

1. Preparação de mídia e cultura

1. Prepare a solução de estoque de 1.000x Carbenicillin (50 mg/mL) ou antibiótico relevante.
   1. . Pesar 0,5 g de carbenicilina. Adicione 10 mL de estéril H₂O. Dissolva completamente.
   2. Esterilize o estoque de carbenicilina através de um filtro de seringa de 0,22 μm. Aliquot a solução antibiótica e armazene a -20 °C.
2. Para preparar placas de caldo de lysogeny (LB), misture 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extrato de levedura e 7,5 g de ágar Bacto com 0,5 L de estéril H₂O. Autoclave a solução a 121 °C por 20 min.
   1. Submerse parcialmente a mistura de gel derretido em um banho de água de 50 °C. Adicione 1.000 μL de carbenicilina (50 mg/mL).
   2. Prepare pratos de Petri em um ambiente estéril. Deixe os pratos para definir antes de guardá-los na geladeira.
3. Para a mídia mínima M9, prepare soluções separadas de estoque dos seguintes: sais 5x M9 (56,4 g/L), 2 M de glicose e 2% de casaminoás sem biotina. Autoclave as soluções a 121 °C por 20 min.
4. Para preparar 5 placas de Petri, misture 1125 mg de ágar de baixa fusão e 400 mg de ágar com 89,2 mL de mídia mínima (1x M9). Adicione 10 mL de 2% de casaminoácidos (2% [vol/vol]) em um frasco de 250 mL Erlenmeyer.
   NOTA: Certifique-se de derramar a mídia nos lábios internos do frasco.
5. Micro-ondas a solução em rajadas curtas de 3 a 4 segundos. Repita até que a solução esteja clara.
   NOTA: Certifique-se de não atingir o ponto de ebulição.
6. Coloque o frasco de 250 mL Erlenmeyer em um banho de água quente (60 °C) para misturar ainda mais por difusão, e deixe esfriar até que sua temperatura caia para cerca de 45-50°C.
7. Acenda a chama no banco de rolar pratos.
8. Adicione rapidamente todas as soluções na seguinte ordem:
   800 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
   100 μL de tiamina (B1)
   1100 μL de glicose (2M)
   100 μL de Carbenicilina (50 mg/mL).
9. Gire o frasco de Erlenmeyer para garantir a distribuição uniforme de todos os ingredientes em todo o ágar.
10. Abra uma placa de cada vez ao lado da chama e comece a derramar.
    1. Deixe as placas no banco por alguns minutos até a solidificação inicial.
    2. Vire as placas de cabeça para baixo para evitar que a condensação da água escorra sobre o gel.
    3. Deixe as placas solidificarem à temperatura ambiente por cerca de 2h.
    4. Uma vez que as placas tenham solidificado e seco, elas podem ser armazenadas a 4 °C por cerca de 3 meses.

2. Estirpes bacterianas e plasmídeos construção

NOTA:O circuito genético contém uma parte; uma Proteína Fluorescente Verde (GFP) impulsionada por um promotor P_tetO resultando em expressão constitutiva. Todos os plasmídeos deste trabalho foram construídos utilizando técnicas básicas de clonagem molecular e foram transformados em Escherichia coli 10β, utilizando um protocolo padrão de choque térmico²⁴. A construção final foi transformada em escherichia coli MG1655 para testes.

1. Transforme o plasmídeo desejado em células Escherichia coli MG1655 com o protocolo de choque térmico padrão²⁴.
2. Cresça as células transformadas em uma placa de ágar LB durante a noite a 37°C.
   NOTA: É possível manter as placas de Petri da etapa 2.2 até 3 dias para uso de microscopia.
3. Inocular uma única colônia em 5 mL de caldo LB complementado com os antibióticos relevantes em um tubo de vidro.
4. Cresça células a 37 °C com velocidade de agitação de 250 rpm na incubadora por 2h até que o líquido esteja nublado.
5. Prepare 1 mL de solução de diluição da seguinte forma:
   892 μL de mídia mínima (1x M9)
   8 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
   100 μL de 2% de ácidos Casamino (0,2% [wt/vol])
   1 μL de tiamina (B1)
   11 μL de glicose (2 M)
   1 μL de antibióticos relevantes
   1. Misture e gire para baixo.
6. Diluir a cultura celular (1:30) da etapa 2.4 em um tubo de 2 mL adicionando 30 μL de crescimento de Escherichia coli a 1000 μL de solução de diluição (passo 2.5).
7. Incubar o tubo por 1h com agitação (250 rpm) a 37 °C.
8. Cresça 40 μL - 60 μL em placas M9 preparadas na etapa 1.10. Incubar a placa a 37 °C durante a noite.
   NOTA: A Densidade Óptica (OD_600nm) para chapeamento deve ser em torno de 0,1.
9. Coloque até três placas de fundo de vidro de 35 mm no banco.
   NOTA: Certifique-se de que o vidro da placa tenha a espessura correta das lentes do microscópio utilizadas.
10. Prepare a cultura para semeadura em placas de gel, repita as etapas 2.3 a 2.6 para colônias de chapas preparadas nas medições do microscópio passo 2.9.
11. Prepare a seguinte solução para fazer três placas de microscópio.
    1. Pré-aqueça o banho de água a 60 °C.
    2. Misture 112,5 mg de ágar de baixa fusão e 40 mg de ágar com 8,92 mL de mídia mínima (1x M9) e adicione 1 mL de 2% de álinoácidos (0,2% [vol/vol]) em um frasco Erlenmeyer de 25 mL.
       NOTA: Certifique-se de derramar a mídia nos lábios internos do frasco.
12. Micro-ondas a solução em rajadas curtas de 2 a 3 segundos. Repita até que a solução esteja clara.
    NOTA: Certifique-se de não atingir o ponto de ebulição.
13. Coloque o frasco de 25 mL Erlenmeyer em um banho de água quente (60 °C) para misturar ainda mais por difusão, e deixe esfriar no banco até que sua temperatura caia para cerca de 45-50 °C.

3. Preparação de almofadas de agarose

1. Banco limpo com 70% de etanol. Estique a fita no banco limpo. Certifique-se de que a fita está lisa e nivelada.
2. Prepare dois coverlips: um na fita e outro nas proximidades. Prepare um coverlid.
3. Retire o frasco (preparado na etapa 2.14) do banho de água, limpe o exterior do frasco limpo e deixe esfriar até que sua temperatura caia para cerca de 45-50 °C.
4. Para fazer a solução de gel, misture rapidamente todas as soluções na seguinte ordem:
   80 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
   1 mL de 2% de casaminoácidos (0,2% [wt/vol])
   10 μL de tiamina (B1)
   110 μL de glicose (2 M)
   10 μL de antibióticos relevantes.
5. Despeje 1,5 mL do gel na tampa e cubra-o com a segunda peça fazendo um "sanduíche".
6. Devolva o Erlenmeyer ao banho de água quente. Cubra o sanduíche com a tampa e reserve o temporizador por 20 minutos.
7. Ao mesmo tempo, incubar o tubo da etapa 2.11 para 1 h a 37 °C com agitação (250 rpm)
8. Depois de 20 minutos vire o sanduíche (passo 3.5), cubra-o e deixe descansar por 1h.
   NOTA: Para melhores resultados deixe o "sanduíche" descansar a 4 °C durante a etapa 3.8.
9. Semente Escherichia coli cultura a partir do passo 3.7 por pipetting a amostra para o prato de 35 mm.
   NOTA: A tubulação de 6 μL de células como pequenas gotas separadas dá os melhores resultados.
10. Deixe as gotas secarem, por pelo menos 15 minutos e até 30 minutos.
11. Exponha o gel solidificado do sanduíche do passo 3.8 deslizando o deslizamento de tampas para longe.
12. Corte o sanduíche em pequenas almofadas individuais com soco ou ponta de biópsia.
13. Incline-o suavemente sobre a amostra (passo 3.9). Deixe o prato por 20 minutos no banco.

4. Preparando a amostra para imagens de microscopia

1. Retire o frasco do banho de água do passo 3.6. Limpe o lado de fora do frasco limpo e deixe esfriar até a temperatura ambiente (25 °C).
   NOTA: Remova o frasco na etapa 4.1 cerca de 3 minutos antes do temporizador terminar.
2. Despeje 3 mL do gel constantemente para o perímetro da placa em um movimento circular. Deixe se solidificar por alguns minutos.
3. Placas de vedação com fita adesiva e furar vários furos com agulha de 25 G. Vire todos os pratos para evitar que a condensação da água escorra no gel.
4. Incubar todos os pratos a 4 °C por 30 min para permitir a solidificação total, evitando a mitose celular.
   NOTA: Deixe as amostras a 4 °C para medições sucessivas, não mais do que um dia.
5. Inicie o microscópio por instruções do fabricante.
6. Encontre o foco inicial usando a lente de amplificação mais baixa e engaje o sistema de foco automático (AFS).
7. Use óleo se necessário, afogue a lente com óleo e espalhe-a cuidadosamente movendo a placa com um controlador de plataforma (não manualmente) e o AFS pode ser ativado novamente.
8. Use seção transversal relativa na direção Z, seguindo a sugestão padrão para seções transversais de etapaS Z.
   NOTA: Tiramos imagens de campo brilhantes a cada 5 minutos e imagens fluorescentes a cada 20 minutos. Às vezes, o foco precisa ser ajustado durante os primeiros 30 minutos. Pré-aquecimento da caixa da incubadora de microscópio e óleo, enquanto a refrigeração da amostra tende a ajudar a reduzir a perda inicial de foco.

5. Análise de dados

NOTA: Para processar dados de microscopia, projetamos um software baseado em computador no MATLAB. Este software facilita a identificação de limites celulares a partir de imagens e segmentos de tiff de campo brilhante e classifica as células por área. A saída desta análise de imagem pode ser usada como uma máscara em imagens de tiff fluorescentes para derivar níveis de intensidade celular e cancelar artefatos no domínio fluorescente, como halo celular devido a limites de resolução de microscópio. O software desenvolvido foi inspirado em trabalhos similares^{7,25,26,27,28,29,30} e fornece uma solução elegante sob medida para o laboratório.

1. Primeiro, defina os seguintes parâmetros em main_code.m.
   1. Defina a pasta das imagens de aquisição.
   2. Defina o período de tempo da imagem - passo de tempo do canal de campo brilhante em minutos.
   3. Defina a frequência GFP - taxa de aquisição de imagens GFP.
   4. Defina a resolução do microscópio (ou seja, quantos pixels são iguais a 1 μm).
   5. Defina o alcance da caixa de histograma - alcance da área celular.
      NOTA: O processo de classificação dos dados de acordo com a área celular é semelhante aos princípios de gating na análise de dados de citometria de fluxo. Os portões são colocados ao redor de populações de células com características comuns, geralmente dispersas e laterais dispersas, para isolar e quantificar essas populações de interesse. A microscopia permite portão, investigar e quantificar vários grupos celulares.
   6. Definir o kernel de convolução (3,3) - este parâmetro detecta limites celulares por limiar global(count_cells.m).
      NOTA: Esta configuração só é necessária ao alterar o laboratório ou o microscópio. O software requer que o canal de campo brilhante de entrada seja rotulado com índice c1, canal de fluorescência rotulado como c2.
2. Execute main_code.m, que executará todos os outros scripts automaticamente(count_cells.m, cell_growth_rate.m).
   1. Programa segmenta automaticamente imagens de campo brilhante (ver Figura Suplementar 2-4).
   2. Combine a imagem de segmentação com imagem fluorescente (GFP) para extrair nível de intensidade por célula.
   3. Calcule o gráfico da quantidade de células por tempo e encaixe de acordo com o crescimento exponencial.
   4. Calcule a média e o desvio padrão (DST) para cada faixa de área celular.
   5. Calcule a relação sinal/ruído (SNR) para cada faixa de área celular.
   6. Plote e encaixe a distribuição da quantidade de células por intensidade.
   7. Calcule o coeficiente de Variância (CV) e compare com os dados do analisador de fluxo.
      NOTA: O software dará como saída as imagens finais de segmentação para ajustar conv_kernel em uma nova pasta "sua pasta/Segmentada". O software dará como saída os gráficos em uma nova pasta "sua pasta/gráficos.
3. Para comparar entre experimentos, use compare_experiments.m.
   1. Defina diretórios para os gráficos salvos e o endereço do diretório \CompareResult.
   2. Execute o arquivo.

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Resultados

O software analisa imagens de domínio de campo brilhante que são off-white e preto. A Escherichia coli vai parecer formas oblongas pretas em um fundo off-white e alcance dinâmico de luminância deve mostrar um pico em seu centro(Figura 1). Em imagens fluorescentes, as células podem ter um pequeno halo, mas células individuais com formas oblongas ainda podem ser resolvidas. Um evento de mitose deve ser detectado pela primeira vez após 30 minutos. O foco do microscópio deve per...

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Discussão

Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo que permite o rastreamento computacional de células vivas Escherichia coli, seguindo níveis de divisão e fluorescentes durante um período de horas. Este protocolo nos permite quantificar a dinâmica estocástica dos circuitos genéticos em Escherichia coli medindo o CV e o SNR em tempo real. Neste protocolo, comparamos os comportamentos estocásticos de dois circuitos diferentes, como mostrado na Figura 10. Foi demonstrado que plasmídeos c...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD - Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD - Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD - Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation