Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

Resumen

Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la toma de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y cuantificación del comportamiento estocástico de los circuitos genéticos sintéticos.

Resumen

El protocolo desarrollado aquí ofrece una herramienta para permitir el seguimiento por computadora de la división Escherichia coli y los niveles fluorescentes durante varias horas. El proceso comienza por la detección de colonias que sobreviven en medios mínimos, suponiendo que sólo Escherichia coli que alberga el plásmido correcto será capaz de prosperar en las condiciones específicas. Dado que el proceso de construcción de grandes circuitos genéticos, que requieren el montaje de muchas partes del ADN, es un desafío, los componentes del circuito a menudo se distribuyen entre plásmidos múltiples en diferentes números de copia que requieren el uso de varios antibióticos. Las mutaciones en el plásmido pueden destruir la transcripción de los genes de resistencia a los antibióticos e interpelar con el manejo de los recursos en la célula que conduce a la necrosis. La colonia seleccionada está situada en una placa Petri con fondo de cristal y algunos planos de enfoque se seleccionan para el seguimiento de microscopía tanto en campos brillantes como en dominios fluorescentes. El protocolo mantiene el enfoque de imagen durante más de 12 horas en condiciones iniciales que no se pueden regular, creando algunas dificultades. Por ejemplo, las células muertas comienzan a acumularse en el campo de enfoque de las lentes después de unas horas de imágenes, lo que hace que las toxinas se acumulen y la señal se desenfoque y decaiga. El agotamiento de nutrientes introduce nuevos procesos metabólicos y dificulta la respuesta deseada del circuito. La temperatura del experimento reduce la efectividad de los inductores y los antibióticos, lo que puede dañar aún más la fiabilidad de la señal. El gel de medios mínimo se encoge y se seca, y como resultado el enfoque óptico cambia con el tiempo. Desarrollamos este método para superar estos desafíos en Escherichia coli,similar a trabajos anteriores que desarrollan métodos análogos para otros microorganismos. Además, este método ofrece un algoritmo para cuantificar el ruido estocástico total en celdas sin modificar y alteradas, encontrando que los resultados son consistentes con las predicciones del analizador de flujo como se muestra en un coeficiente similar de variación (CV).

Introducción

La biología sintética es un campo multidisciplinar que ha surgido en la última década y tiene como objetivo traducir los principios de diseño de ingeniería en diseño biológico racional^1,2,3,en un esfuerzo por lograr la integración y procesamiento multi-señal en células vivas para entender la ciencia básica^4,5,aplicaciones diagnósticas, terapéuticas y biotecnológicas^6,7,8,9,10. Nuestra capacidad para cuantificar la respuesta de entrada y salida de los circuitos genéticos sintéticos se ha visto revolucionada por los recientes avances en la tecnología unicelular, incluido el analizador de flujo y las imágenes de células vivas mediante microscopía automatizada de lapso de tiempo^11. A menudo se utiliza un analizador de flujo para medir la respuesta de estos circuitos en el estado estacionaria^1,12,y la microscopía invertida se utiliza para medir la respuesta dinámica de los circuitos genéticos sintéticos a nivel de una sola célula^3. Por ejemplo, uno de los primeros trabajos en biología sintética implicó la construcción de redes de osciladores genéticos en células vivas utilizando bucles de retroalimentación negativos con un retraso^{de 3}. Más tarde, los circuitos osciladores genéticos se aplicaron para entender el control metabólico en el entorno dinámico de las células vivas^4. La microscopía automatizada de lapso de tiempo es un método para caracterizar estos circuitos. Suponemos que las células huésped, Escherichia coli,se sincronizan al formar micro colonias, permitiendo la medición de la señal y el cálculo del ruido sin rastrear las relaciones exactas madre-hija.

El ruido es un aspecto fundamental e inherente de los sistemas biológicos que a menudo surgen de múltiples fuentes. Consideremos, por ejemplo, las reacciones bioquímicas que implican señales que se originan en el transporte de portadores aleatorios discretos, como la difusión de proteínas^13. Estas señales se propagan con fluctuaciones aleatorias¹⁴. Otras fuentes de ruido son la disponibilidad de recursos, la división celular y las variaciones en condiciones ambientales como la temperatura, la humedad y la presión. Las señales biológicas que se propagan en circuitos genéticos sintéticos a menudo tienen una relación señal-ruido (SNR) muy baja, lo que perturba el rendimiento de dichos circuitos. Por lo tanto, el diseño de circuitos genéticos sigue siendo uno de los aspectos más desafiantes de la ingeniería genética^15. Por ejemplo, a diferencia de la mayoría de los enfoques que calculan sólo la expresión génica media (medida sobre toda la población celular), la varianza de la señal medida se considera con el fin de diseñar un comportamiento predecible a través de redes genéticas sintéticas¹². Como tal, los niveles de variabilidad o ruido en la expresión proteica desempeñan un papel dominante en el diseño y el rendimiento de los circuitos genéticos analógicos y digitales^1,16,17.

Se han desarrollado muchos enfoques para cuantificar la variabilidad de célula a célula, incluso en Escherichia coli^3,7,18. Estos métodos se utilizan a menudo para estudiar la activación genética y las vías metabólicas, sin embargo, con menos enfoque en el estudio de la dinámica del ruido estocástico, como medir y desenredar fuentes de ruido específicas, especialmente para los circuitos genéticos en las células vivas donde este es un desafío fundamental^19,20,21. Varios factores, tanto heredados al propio circuito (intrínsecos) como derivados de las células huésped (extrínsecos), pueden perturbar el rendimiento continuo de los circuitos genéticos. En este documento, desarrollamos un protocolo que tiene como objetivo cuantificar el ruido total en las células de Escherichia coli, incluidas las fuentes de ruido intrínsecas y extrínsecas^6,22. Al cuantificar el ruido total y luego evaluar el SNR^23,se puede mejorar el diseño de los circuitos genéticos. Este método se puede modificar para medir fuentes de ruido independientes por separado, mediante la monitorización de varias proteínas fluorescentes^6,20. Para el protocolo descrito aquí, mantenemos las condiciones ambientales bien controladas y medimos continuamente la actividad de las células sin la influencia de factores externos. Medimos la señal de las proteínas fluorescentes en células individuales con el tiempo y las imagen simultáneamente bajo un sustrato de agarose. Las imágenes resultantes se analizan utilizando el MATLAB personalizado del laboratorio.

Idealmente, la medición continua de la actividad en tiempo real de las proteínas fluorescentes dentro de una célula producirá datos precisos a través del crecimiento y la división de las células. Sin embargo, es difícil adquirir esos datos. Esto se debe a la degradación de las proteínas fluorescentes, conocidas como foto-blanqueamiento^7,cuando están expuestas a la radiación en el proceso de excitación. Además, las células de Escherichia coli también son sensibles para la excitación, lo que podría conducir a la fototoxicidad^7. Ambas emisiones limitan la cantidad de marcos de fotos que se pueden adquirir y el tiempo entre adquisiciones. El sustrato y los tipos medios (por ejemplo, caldo de lisógena) que se utiliza para cultivar las células durante la toma de imágenes también tienen un papel crítico. Recomendamos encarecidamente el uso de un medio mínimo, que minimice el fondo no fluorescente y amplíe el tiempo de división celular.

Además, la muestra debe prepararse teniendo en cuenta los siguientes requisitos (1) La baja tasa de división celular permite exposiciones menos frecuentes para realizar imágenes cercanas del ciclo de división y reducir la probabilidad de fototoxicidad y fotobleaching. Establecemos el tiempo de adquisición en aproximadamente la mitad del tiempo de mitosis pronosticado (2) La baja densidad celular al comienzo del experimento permite una mejor uniformidad y seguimiento de la división. La densidad celular se ve afectada por la relación de dilución de las células de Escherichia coli, que es un parámetro significativo para el éxito de este protocolo y debe determinarse para cada laboratorio. Para establecer la relación, cada nueva cepa o medio de Escherichia coli utilizado debe estar equipado con gráficos de tasa de crecimiento(Figura Suplementaria 1). Se ha logrado una relación adecuada si las células pueden crecer sin agitación adicional después de una breve incubación de una densidad inicial de aproximadamente_600nm OD = 0.1. Las células en esta fase se dividirán de acuerdo con la temperatura ambiente solamente (3) Restricción del movimiento celular: el movimiento celular depende fuertemente de la firmeza del sustrato (almohadilla de agarose). La firmeza del sustrato depende de la cantidad de agarose total y el tiempo de solidificación del gel. Los geles no se pueden dejar solidificar durante la noche a temperatura ambiente, ya que la Escherichia coli se someterá a mitosis. Otros factores que afectan la estabilidad del sustrato incluyen la cantidad de agua en la muestra y la humedad. Las cuestiones adicionales se examinan en detalle en los Resultados del Representante. Este protocolo proporciona muchos detalles y se mueve gradualmente de un paso a otro. El protocolo ofrece una larga estabilidad para experimentos de imágenes y proporciona una herramienta básica de procesamiento de imágenes.

Protocolo

1. Preparación de los medios de comunicación y la cultura

1. Preparar solución de stock de 1.000x carbenicilina (50 mg/ml) o antibiótico relevante.
   1. . Pesar 0,5 g de carbenicilina. Añadir 10 ml de estéril H₂O. Disolver por completo.
   2. Esterilizar el stock de carbenicilina a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Aliquot la solución antibiótica y almacenar a -20 °C.
2. Para preparar placas de caldo de lisógena (LB), mezcle 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extracto de levadura y 7,5 g de agar Bacto con 0,5 L de estéril H₂O. Autoclave la solución a 121 °C durante 20 minutos.
   1. Sumerja parcialmente la mezcla de gel fundido en un baño de agua de 50 °C. Añadir 1.000 μL de carbenicilina (50 mg/ml).
   2. Prepare platos de Petri en un ambiente estéril. Deje los platos para ajustar antes de guardarlos en la nevera.
3. Para medios mínimos M9, prepare soluciones de stock separadas de lo siguiente: sales de 5x M9 (56,4 g/L), glucosa de 2 M y 2% de homeminoácidos libres de biotinas. Autoclave las soluciones a 121 °C durante 20 min.
4. Para preparar 5 placas De Petri, mezclar 1125 mg de agar de baja fusión y 400 mg de agar con 89,2 ml de medios mínimos (1x M9). Añadir 10 ml de 2% de homeminoácidos (2% [vol/vol]) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
   NOTA: Asegúrese de verter los medios en los labios internos del matraz.
5. Microondas la solución en ráfagas cortas de 3 a 4 segundos. Repita la repetición hasta que la solución esté clara.
   NOTA: Asegúrese de no llegar al punto de ebullición.
6. Coloque el matraz Erlenmeyer de 250 ml en un baño de agua caliente (60 °C) para mezclarlo aún más por difusión, y déjelo enfriar hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.
7. Enciende la llama en el banco que vierte la placa.
8. Añada rápidamente todas las soluciones en el siguiente orden:
   800 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
   100 μL de tiamina (B1)
   1100 μL de glucosa (2M)
   100 μL de carbenicilina (50 mg/ml).
9. Arremolina el matraz Erlenmeyer para asegurar una distribución uniforme de todos los ingredientes en todo el agar.
10. Abra una placa a la vez junto a la llama y comience a verter.
    1. Deje las placas en el banco durante unos minutos hasta la solidificación inicial.
    2. Ponga las placas boca abajo para evitar que la condensación de agua gotee sobre el gel.
    3. Deje que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 h.
    4. Una vez que las placas se han solidificado y secado, se pueden almacenar a 4 °C durante aproximadamente 3 meses.

2. Construcción de cepas bacterianas y plásmidos

NOTA: El circuito genético contiene una parte; una proteína fluorescente verde (GFP) impulsada por un promotor de_{P tetO} que resulta en expresión constitutiva. Todos los plásmidos de este trabajo fueron construidos utilizando técnicas básicas de clonación molecular y se transformaron en Escherichia coli 10β, utilizando un protocolo estándar de choque térmico^24. La construcción final se transformó en cepa de tipo salvaje Escherichia coli MG1655 para pruebas.

1. Transforme el plásmido deseado en células Escherichia coli MG1655 con el protocolo de choque térmico estándar²⁴.
2. Cultiva las células transformadas en una placa de agar LB durante la noche a 37°C.
   NOTA: Es posible mantener las placas Petri desde el paso 2.2 hasta 3 días para uso de microscopía.
3. Inocular una sola colonia en 5 ml de caldo LB complementado con los antibióticos relevantes en un tubo de vidrio.
4. Cultivar células a 37 °C con 250 rpm de velocidad de agitación en incubadora durante 2 h hasta que el líquido esté nublado.
5. Prepare 1 ml de solución de dilución de la siguiente manera:
   892 μL de medios mínimos (1x M9)
   8 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
   100 μL de 2% de ácidos Casamino (0,2% [wt/vol])
   1 μL de tiamina (B1)
   11 μL de glucosa (2 M)
   1 μL de antibióticos relevantes
   1. Mezcle y gire hacia abajo.
6. Diluir el cultivo celular (1:30) del paso 2.4 en un tubo de 2 ml añadiendo 30 μL de crecimiento de Escherichia coli a 1000 μL de solución de dilución (paso 2.5).
7. Incubar el tubo durante 1 h con agitación (250 rpm) a 37 °C.
8. Crecer 40 μL - 60 μL en placas M9 preparadas en el paso 1.10. Incubar la placa a 37 °C durante la noche.
   NOTA: La densidad óptica (OD_600nm)para el chapado debe ser de alrededor de 0,1.
9. Coloque hasta tres placas inferiores de vidrio de 35 mm en el banco.
   NOTA: Asegúrese de que el vidrio de la placa tenga el grosor correcto para las lentes del microscopio utilizadas.
10. Preparar el cultivo para la siembra en placas de gel, repita los pasos 2.3 a 2.6 para las colonias de la placa preparada en las mediciones del microscopio del paso 2.9.
11. Prepare la siguiente solución para hacer tres placas de microscopio.
    1. Precalentar el baño de agua a 60 °C.
    2. Mezclar 112,5 mg de agar de baja fusión y 40 mg de agar con 8,92 ml de medios mínimos (1x M9) y añadir 1 ml de 2% de homeminoácidos (0,2% [vol/vol]) en un matraz Erlenmeyer de 25 ml.
       NOTA: Asegúrese de verter los medios en los labios internos del matraz.
12. Microondas la solución en ráfagas cortas de 2 a 3 segundos. Repita la repetición hasta que la solución esté clara.
    NOTA:Asegúrese de no llegar al punto de ebullición.
13. Coloque el matraz Erlenmeyer de 25 ml en un baño de agua caliente (60 °C) para mezclarlo aún más por difusión, y déjelo enfriar en el banco hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.

3. Preparación de almohadillas de agarose

1. Banco limpio con 70% etanol. Estirar la cinta en el banco limpiado. Asegúrese de que la cinta esté lisa y nivelada.
2. Prepare dos coverslips: uno en la cinta y otro cerca. Prepara un párpado.
3. Retire el matraz (preparado en el paso 2.14) del baño de agua, limpie el exterior del matraz y déjelo enfriar hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.
4. Para hacer la solución de gel, mezcle rápidamente todas las soluciones en el siguiente orden:
   80 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol])
   1 ml de 2% de homeminoácidos (0,2% [wt/vol])
   10 μL de tiamina (B1)
   110 μL de glucosa (2 M)
   10 μL de antibióticos relevantes.
5. Vierta 1,5 ml del gel en el coverlip y cúbralo con la segunda pieza haciendo un "sándwich".
6. Devuélvele el Erlenmeyer al baño de agua caliente. Cubra el sándwich con la tapa y ajuste el temporizador durante 20 minutos.
7. Al mismo tiempo, incubar el tubo desde el paso 2.11 para 1 h a 37 °C con agitación (250 rpm)
8. Después de 20 minutos voltea el sándwich (paso 3.5), cúbrelo y deja reposar durante 1 h.
   NOTA: Para obtener mejores resultados, deje que el "sándwich" descanse a 4 °C durante el paso 3.8.
9. Cultivo de semillas escherichia coli desde el paso 3.7 pipeteando la muestra en el plato de 35 mm.
   NOTA: Pipetear 6 μL de células como pequeñas gotas separadas da los mejores resultados.
10. Deje que las gotas se sequen durante al menos 15 minutos y hasta 30 minutos.
11. Exponga el gel solidificado del sándwich desde el paso 3.8 deslizando el deslizamiento de las cubiertas.
12. Corte el sándwich en pequeñas almohadillas individuales con ponche o punta de biopsia.
13. Inclínate suavemente sobre la muestra (paso 3.9). Deje el plato durante 20 minutos en el banco.

4. Preparación de la muestra para imágenes de microscopía

1. Retire el matraz del baño de agua del paso 3.6. Limpie el exterior del matraz y deje enfriar a temperatura ambiente (25 °C).
   NOTA: Retire el matraz en el paso 4.1 unos 3 minutos antes de que termine el temporizador.
2. Vierta 3 ml del gel constantemente al perímetro de la placa en un movimiento circular. Dejar solidificar durante unos minutos.
3. Sellar placas con cinta adhesiva y perforar varios agujeros con aguja de 25 G. Voltea todos los platos para evitar que la condensación de agua gotee sobre el gel.
4. Incubar todos los platos a 4 °C durante 30 min para permitir la solidificación completa mientras se previene la mitosis celular.
   NOTA: Deje las muestras a 4 °C para mediciones sucesivas, no más de un día.
5. Inicie el microscopio según las instrucciones del fabricante.
6. Encuentre el enfoque inicial utilizando la lente de amplificación más baja y enganche el sistema de enfoque automático (AFS).
7. Utilice aceite si es necesario, ahogue la lente con aceite y esparce cuidadosamente moviendo la placa con un controlador de plataforma (no manualmente) y AFS se puede volver a enganchar.
8. Utilice la sección transversal relativa en dirección Z, siguiendo la sugerencia predeterminada para las secciones transversales del paso Z.
   NOTA: Tomamos imágenes de campo brillantes cada 5 minutos e imágenes fluorescentes cada 20 minutos. A veces, el enfoque debe ajustarse durante los primeros 30 minutos. El precalentamiento de la caja de incubadora de microscopios y el aceite, mientras que la refrigeración de la muestra tiende a ayudar a reducir la pérdida inicial de enfoque.

5. Análisis de datos

NOTA: Con el fin de procesar datos de microscopía, diseñamos un software basado en computadora en MATLAB. Este software facilita la identificación de los límites celulares de las imágenes y segmentos de tiff de campo brillante y clasifica las celdas por área. La salida de este análisis de imagen se puede utilizar como una máscara en imágenes fluorescentes tiff para derivar niveles de intensidad celular y cancelar artefactos en el dominio fluorescente como halo celular debido a los límites de resolución del microscopio. El software desarrollado se inspiró en obras similares^{7,25,26,27,28,29,30} y proporciona una solución elegante adaptada para el laboratorio.

1. En primer lugar, defina los siguientes parámetros en main_code.m.
   1. Defina la carpeta de las imágenes de adquisición.
   2. Defina el período de tiempo de imagen - paso de tiempo de canal de campo brillante en minutos.
   3. Defina la frecuencia GFP - tasa de adquisición de imágenes GFP.
   4. Defina la resolución del microscopio (es decir, cuántos píxeles son iguales a 1 μm).
   5. Definir rango de ubicación de histograma - rango de área celular.
      NOTA: El proceso de clasificación de los datos según el área de la célula es similar a los principios de gating en el análisis de datos de citometría de flujo. Las compuertas se colocan alrededor de poblaciones de células con características comunes, generalmente dispersas hacia adelante y dispersas lateralmente, para aislar y cuantificar estas poblaciones de interés. La microscopía permite gatear, investigar y cuantificar varios grupos celulares.
   6. Definir kernel de convolución (3,3): este parámetro detecta los límites de las celdas mediante umbrales globales(count_cells.m).
      NOTA: Esta configuración solo es necesaria al cambiar el laboratorio o el microscopio. El software requiere que el canal de campo brillante de entrada se etiquete con el índice c1, canal de fluorescencia etiquetado como c2.
2. Ejecute main_code.m, que ejecutará todos los demás scripts automáticamente (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
   1. Programa segmenta automáticamente imágenes de campo brillantes (ver Figura suplementaria 2-4).
   2. Combine la imagen de segmentación con la imagen fluorescente (GFP) para extraer el nivel de intensidad por célula.
   3. Calcule el gráfico de la cantidad de células por tiempo y ajuste según el crecimiento exponencial.
   4. Calcule la desviación media y estándar (ETS) para cada rango de área celular.
   5. Calcule la relación señal-ruido (SNR) para cada rango de área celular.
   6. Trace y ajuste la distribución de la cantidad de células por intensidad.
   7. Calcule el coeficiente de Varianza (CV) y compárese con los datos del analizador de flujo.
      NOTA: El software dará como salida las imágenes de segmentación final para ajustar conv_kernel en una nueva carpeta "yourfolder/Segmented". El software dará como salida los gráficos en una nueva carpeta "yourfolder/Graphs.
3. Para comparar entre experimentos, utilice compare_experiments.m.
   1. Defina directorios para los gráficos guardados y la dirección del directorio \CompareResult.
   2. Ejecute el archivo.

Resultados

El software analiza imágenes de dominio de campo brillante que son fuera de blanco y negro. La Escherichia coli se verá como formas oblongas negras sobre un fondo blanquecino y el rango dinámico de luminancia debe mostrar un pico en su centro(Figura 1). En las imágenes fluorescentes las células pueden tener un halo pequeño, pero las células individuales con formas oblongas todavía se pueden resolver. Primero se debe detectar un evento de mitosis después de 30 minutos. El en...

Discusión

En este trabajo, desarrollamos un protocolo que permite el rastreo por ordenador de células vivas de Escherichia coli, siguiendo niveles de división y fluorescentes durante un período de horas. Este protocolo nos permite cuantificar la dinámica estocástica de los circuitos genéticos en Escherichia coli midiendo el CV y el SNR en tiempo real. En este protocolo, comparamos los comportamientos estocásticos de dos circuitos diferentes como se muestra en la Figura 10. Se ha demostrado...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD - Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD - Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD - Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation