إعداد أضعاف الصوتية الجرذ للتحليلات العصبية والعضلية

Summary

يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لإعداد طيات صوتية للفئران للدراسة العصبية العضلية الهسكيميائية.

Abstract

الغرض من هذا البرنامج التعليمي هو وصف إعداد أضعاف الصوتية الفئران لدراسة الهستوكيميائية العصبية والعضلية. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تشريح الحنجرة للفئران وتجميد الفلاش والتبريد للطيات الصوتية. تصف هذه الدراسة كيفية طيات صوتية بالتبريد في كل من الطائرات الطولية والمقطعية. الجدة من هذا البروتوكول هو تتبع الحنجرة أثناء عملية استئصال الشعر بالتبريد التي تضمن تحديد دقيق للعضلات الحنجرة الجوهرية ويقلل من فرصة فقدان الأنسجة. وتظهر الأرقام عملية البكاء التدريجية في كلا الطائرتين. تم استئصال 29 فأرا من الهيمي-لالحنجرة وتعقبها من ظهور غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور القسم الأول الذي تضمن الحظيرة الصوتية الكاملة. تم تصور أضعاف الصوتية الكاملة لجميع الحيوانات في كلا الطائرتين. كان هناك تباين كبير في المسافة من مظهر غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور أضعاف الصوتية الكاملة في كلا الطائرتين. لم يكن الوزن مرتبطا بعمق معالم الحنجرة ، مما يشير إلى أن التباين الفردي والعوامل الأخرى المتعلقة بإعداد الأنسجة قد تكون مسؤولة عن التباين العالي في ظهور المعالم أثناء القسمة. هذه الدراسة تفاصيل منهجية ويقدم البيانات المورفولوجية لإعداد حظيرة الفئران الصوتية للتحقيق العصبي العضلي الهسوشية. نظرا للتغير الفردي العالي ، يجب تتبع معالم الحنجرة عن كثب أثناء عملية استئصال الشعر لمنع فقدان الأنسجة والأنسجة. وسيساعد استخدام منهجية متسقة، بما في ذلك إعداد الأنسجة الكافية والوعي بالمعالم داخل حنجرة الفئران، في تحقيق نتائج متسقة عبر الدراسات ومساعدة الباحثين الجدد المهتمين باستخدام الحظيرة الصوتية للفئران كنموذج للتحقيق في الآليات العصبية العضلية الحنجرة.

Introduction

حنجرة الفئران هو نموذج راسخ للتحقيق في التكيف الهيكلي والوظيفي للحنجرة العصبية العضلية مع التنمية والشيخوخة والمرض والعوامل ^{الدوائية1،2،3،4،5}. اتساق الأساليب النسيجية أمر بالغ الأهمية لهذا الخط من العمل، كما أن هناك تعقيدات متعددة تشارك في إعداد العضلات وتحليلها، فضلا عن التحديات المرتبطة حجم الحنجرة، والشكل، وتضاريس العضلات مغلفة داخل الغضاريف الحنجرة1،^{6،7،8،9،10،11} . نظرا لصغر حجم عضلات الحنجرة الجوهرية للفئران ، فإن التضمين المنهجي والتجميد والتشخيص البردي أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج متسقة ودقيقة. على سبيل المثال، عند تقسيم أضعاف صوت الفئران في الطائرة التاجية، تقع التقاطعات العصبية العضلية (NMJs) لأربعة من عضلات الحنجرة الجوهرية ضمن أقل من 1.8 مم من عمق ^{الأنسجة11}. لذلك ، فإن الرصد الدقيق لتشريح العضلات الحنجرة أثناء عملية استئصال الأعصاب أمر حتمي لتحديد القسم (المقاطع) ذات الاهتمام بدقة ومنع الإفراط في استئصال الأنسجة. يمكن أن يؤدي الإفراط في استئصال العضلات المستهدفة إلى تحديد غير دقيق لعدد وتضاريس ^NMJs11 أو يمكن أن يؤدي إلى تخفيضات إجمالية في حجم العينة إذا تم التخلص من العضلات المستهدفة بسبب ارتباك التوجه ^{التاريخي12}. كما يتم تطوير نماذج جديدة لدراسة العضلات الحنجرة والتكيفات الخاصة بهم، إجراءات التشغيل القياسية ضرورية لضمان النتائج دقيقة وموثوق بها، وقابلة للاستنساخ عبر الدراسات.

الهدف من هذه المقالة هو إعداد مفصل للطية الصوتية الفئران للتحليل الطولي والمقطعي الأمثل. يتم وصف الطرق التفصيلية المستخدمة بانتظام في مختبرنا لتحديد معالم العضلات المستهدفة أثناء عملية استئصال التبريد. على الرغم من استخدام أساليب مماثلة في العديد من المختبرات ، يتم توفير تفاصيل أكبر هنا مما هو عليه في الأدبيات لضمان تكرار موثوق ودقيق عند تنفيذه من قبل المحققين المبتدئين. الهدف من هذا البرنامج التعليمي هو توفير منهجية قياسية لتقييم الكيمياء المناعية (IHC) للطية الصوتية الفئران لتحسين الاتساق عبر المختبرات والتحقيقات.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة لكلية الطب بجامعة نيويورك.

1. تشريح حنجرة الفئران

1. قتل الفئران وفقا للبروتوكول المعتمد مؤسسيا. حلق الرقبة البطنية من الفك السفلي إلى المانبوريوم ومسحة مع الكحول لمنع تلوث الفراء في عينات الأنسجة.
2. تحت نطاق تشريح مع 10x التكبير استئصال الحنجرة بأكملها عن طريق إنشاء شق الرقبة خط الوسط مع مشرط حتى يتم الكشف عن القصبة الهوائية.
3. فصل عضلات الحنجرة البطنية في خط الوسط لفضح الحنجرة باستخدام ملقط وتشريح مقص أو مشرط.
4. قطع القصبة الهوائية caudal إلى حلقة القصبة الهوائية الثالثة وجعل rostral شق إلى العظام هيويد لاستئصال الحنجرة كله باستخدام مقص تشريح.
5. إزالة أنسجة الحنجرة الخراجية (المريء والغدة الدرقية وعضلات الحنجرة الخراجية) من الحنجرة باستخدام أدوات التشذيب الدقيق (ملاقط ودبابيس وميكروسيسورس) تحت التكبير.
6. مع microscissors، تقسيم الحنجرة ظهريا بين الاريتينويدات باستخدام خط الوسط بين عضلات cricoarytenoid الخلفي كمعلم. دبوس الجدران الجانبية للحنجرة لفضح طيات الصوتية ومن ثم تقسيم ventrally من خلال خط الوسط من غضروف الغدة الدرقية بين commissure الأمامي للطيات الصوتية مع microscissors (الشكل 1).
   ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة اختيارية; يمكن تخطيها للحفاظ على الحنجرة كاملة. يسمح شفط الحنجرة بتقنيات متعددة لاحتواء المناعة باستخدام الجانبين الأيمن والأيساري لنفس الحنجرة بشكل منفصل.
7. شطف كل الحنجرة هيمي في محلول الفوسفات العازلة (PBS) ل ~ 10 ق وجافة بدقة مع ممسحة مهمة للحد من تشكيل الكريستال الجليد أثناء التجميد.

2. إصلاح و / أو فلاش تجميد الأنسجة الحنجرة

ملاحظة: التثبيت قد لا تكون مثالية لكافة بروتوكولات immunostaining. غالبا ما تكون أنسجة الحنجرة طازجة مجمدة بعد تشريحها مباشرة. تخطي الخطوة 2.1 إلى فلاش تجميد الأنسجة الحنجرة دون تثبيت.

1. لإصلاح الهيمي-larynges وضع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي مليئة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية في 70 دورة في الدقيقة. نقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وشطف 3x لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني. ثم نقل إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة وتغمر في محلول السكروز 20٪ / 5٪ الجلسرين (~ 18 ساعة أو حتى يغرق الأنسجة) في 4 درجة مئوية.
   تنبيه: الفورمالديهايد خطر ويجب استخدامه في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
2. ضع جميع الهيمي-larynges في وضع موحد في قالب التبريد مليئة درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مركب. لmilarynx، ضع الأنسجة مع السطح المتوسط من أضعاف الصوتية التي تواجه الجزء السفلي من cryomold والجانب الطولي للطية الصوتية موازية للحافة السفلى من افتتاح cryomold. لالحنجرة كله، ضع الأنسجة مع cricoarytenoids الخلفية التي تواجه الجزء السفلي من cryomold والجانب الطولي للطية الصوتية موازية للحافة السفلى من افتتاح cryomold.
   ملاحظة: اتجاه الحنجرة متسقة داخل مركب أكتوبر أمر بالغ الأهمية ل cryosectioning من أضعاف الصوتية الفئران. بمجرد أن يتم تضمين اللبن وتجميده ، يجب إذابته لتغيير اتجاهه ، وبالتالي إدخال مخاطر تلف الأنسجة من دورات تجميد ذوبان الجليد المتعددة.
3. أنسجة التجميد الفلاشي باستخدام الأزوبينتان (2-ميثيل بوتان) المبردة في كوب من الصلب محاط بالنيتروجين السائل.
   ملاحظة: تصل درجة الحرارة الاثيوبية إلى درجة الحرارة المثلى لتجميد الأنسجة عندما يبدأ الترسب الأبيض في التشكل على جانبي وأسفل ^الكأس13. يستخدم الإسوبينتان لأنه يحتوي على موصلية حرارية أعلى من النيتروجين السائل ، مما يساعد على منع تكسير كتلة الأنسجة أثناء التجميد السريع. للحصول على وصف أكثر تفصيلا للأنسجة المجمدة في OTC، راجع كومار ^{وآخرون.13}.
4. التفاف كل قالب في احباط prelabeled ووضعها في كيس التجميد الفردية لمنع الجفاف وتخزينها على الفور على الجليد الجاف حتى نقلها للتخزين في الثلاجة -80 درجة مئوية.

3. Cryosection الهيلاتريكس في طائرة مقطعية

1. تعيين درجة حرارة الغرفة في cryostat إلى -20 درجة مئوية، والتي هي في منتصف نطاق درجة الحرارة (15−25 درجة مئوية) الموصى بها لقسم الأنسجة العضلية من قبل دليل الشركة المصنعة.
2. تعيين سمك قسم cryostat إلى أقسام سميكة 10 ميكرومتر.
   ملاحظة: لتحليل الألياف العضلية المقطعية، تعتبر المقاطع السميكة 10 ميكرومترات مثالية للسماح بالتلطيخ الكامل وكثافة التصوير القوية لألياف العضلات المسماة لتحليل كتابة الألياف14,15,16. قد تتطلب بعض البروتوكولات سمك مقطع مختلف اعتمادا على الأهداف العصبية والعضلية.
3. نقل الأنسجة إلى غرفة cryostat، إضافة طبقة موحدة من مركب أكتوبر على قرص عينة cryostat (تشاك)، ووضع كتلة الأنسجة المضمنة على رأس مركب أكتوبر على قرص العينة. للحصول على مقاطع عرضية من أضعاف الصوتية لتحليل الألياف العضلية الغدة الدرقية (TA) ، لصق العينة إلى تشاك بحيث الغضروف الغدة الدرقية البطني يواجه شفرة cryostat والغضاريف أريتينويد يواجه قرص العينة.
   ملاحظة: من المهم ملاحظة أن هذه المعالم غير مرئية في هذه المرحلة، بسبب أن مركب OCT يصبح أبيض ومبهم عند تجميده. هذا النقص في الرؤية هو السبب في أنه من الأهمية بمكان ملاحظة اتجاه الهميلاتريكس خلال مرحلة تجميد الفلاش.
4. تقليم مركب أكتوبر عن طريق التقدم رأس العينة من قبل 100 ميكرومتر حتى الجزء البطني من غضروف الغدة الدرقية يظهر.
5. ثم تقليم وتتبع 30 مقطع μm من بداية غضروف الغدة الدرقية حتى يتم الكشف عن البربريا الصفيحة, عضلات TA وسيطة, والعضلات TA الجانبية.
   ملاحظة: يجب تتبع معالم الحنجرة والملاحظة منذ بداية غضروف الغدة الدرقية كل 100 ميكرومتر لضمان عدم انحراف زاوية المقطع. الشكل 2 يمثل مجموعتين من معالم الحنجرة في الطائرة المقطعية العرضية في التكبير 10x.
6. بمجرد الوصول إلى عضلة TA المستهدفة ، اجمع مقاطع على الشرائح المشحونة بشكل إيجابي عند 10 ميكرومتر.
7. تخزين أقسام في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية للاحتفاظ الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة.
   ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة الثابتة في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى أسبوع واحد اعتمادا على هدف IHC في حين يجب معالجة الأنسجة غير المثبتة على الفور.

4. Cryosection الهميلاتريكس في الطائرة الطولية

1. مع غرفة cryostat تعيين مرة أخرى إلى -20 درجة مئوية، تغيير سمك القسم إلى 30 ميكرومتر.
   ملاحظة: بالنسبة لتحليل NMJ، يمكن استخدام سمك الأنسجة بين 30−60 ميكرومتر لالتقاط العديد من NMJs كاملة داخل عضلات الحنجرة دون تجزئة إما محطة الأعصاب أو لوحة النهاية الحركية11,12,17.
2. للحصول على أقسام طيات صوتية طولية لتحليل NMJ لعضلات TA ، قم بلصق العينات على تشاك بحيث يتم توجيه epiglottis نحو شفرة cryostat ويواجه التجويف القصبي لأسفل نحو قرص العينة.
3. تقليم مركب أكتوبر عن طريق التقدم رأس العينة من قبل 100 ميكرومتر حتى يظهر غضروف الغدة الدرقية.
4. تقليم وتتبع أقسام من 30 ميكرومتر من بداية الغدة الدرقية حتى يتم الكشف عن البربريا الصفيحة والانقسامات الوسيطة والظرية من عضلة TA.
   ملاحظة: يوصى بخمس مجموعات من معالم الحنجرة في الطائرة الطولية لتتبع تطور عمق الأنسجة نحو عضلة TA المستهدفة. الشكل 3 يمثل معالم الحنجرة في الطائرة الطولية في التكبير 10x.
5. بمجرد الوصول إلى عضلة TA المستهدفة ، اجمع المقاطع على الشرائح المشحونة بشكل إيجابي عند 30 ميكرومتر.
6. تخزين أقسام في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية للاحتفاظ الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة.

النتائج

وكانت النتائج التمثيلية جزءا من تحقيق جار في آثار التمارين الصوتية على الجهاز العصبي العضلي الحنجري. تم وزن وقتل تسعة وعشرين من الذكور فيشر 344/brown النرويج الفئران (12 9 أشهر من العمر، 17 24 شهرا) مع استنشاق ثاني _أكسيد الكربون تليها استئصال الصدر الثنائية.

اتبعت الإجراءات ا?...

Discussion

إعداد طيات الفئران الصوتية للتحليل العصبي العضلي يمكن أن تقدم مع تحديات مختلفة. ليس فقط عضلات الحنجرة صغيرة ومحاطة الغضاريف، مما يجعل من الصعب استخراج العضلات المستهدفة مباشرة، تم العثور على تباين كبير أيضا بين الحيوانات في عمق المعالم التشريحية الحنجرة. بالنسبة للعضلات بروتوكول مستوى ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane Certified	Fisher Chemical	35514
Aluminum Foil	Fisherbrand	1213101
Cryo Tongs SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Cryostat blades	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Disposable Underpads	Medline	23-666-062
Dissection kit	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Frozen Section Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Ice Bucket	Bel-Art	11999054
Immunostain Moisture Chamber	Ted Pella Inc	NC9425474
Needle holders	Assi	ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply	Quick Medical	9023
Orbital shaker	Troemner	02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes	Fisherbrand	5408129
Specimen Storage Bags	Fisherbrand	19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Task wiper	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Scissors	Assi	ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.