Preparación de la cuerda vocal de la rata para análisis neuromusculares

Resumen

Este protocolo describe los métodos utilizados para preparar las cuerdas vocales de las ratas para el estudio neuromuscular histoquímico.

Resumen

El propósito de este tutorial es describir la preparación de la cuerda vocal de la rata para el estudio neuromuscular histoquímico. Este protocolo describe los procedimientos para la disección laríngea de ratas, la congelación por flash y la crioseccionación de las cuerdas vocales. Este estudio describe cómo crioseccionar las cuerdas vocales tanto en planos longitudinales como transversales. Una novedad de este protocolo es el seguimiento laríngeo durante la crioseccionación que garantiza la identificación precisa de los músculos laríngeos intrínsecos y reduce la posibilidad de pérdida de tejido. Las cifras demuestran la crioseccionación progresiva en ambos planos. Veintinueve hemi-laringes de rata fueron crioseccionados y rastreados desde la aparición del cartílago tiroideo hasta la aparición de la primera sección que incluía el pliegue vocal completo. La cuerda vocal completa se visualizó para todos los animales en ambos planos. Hubo una alta variabilidad en la distancia desde la aparición del cartílago tiroideo hasta la aparición de la cuerda vocal completa en ambos planos. El peso no se correlacionó con la profundidad de los puntos de referencia laríngeos, lo que sugiere que la variabilidad individual y otros factores relacionados con la preparación del tejido pueden ser responsables de la alta variabilidad en la aparición de puntos de referencia durante la sección. Este estudio detalla una metodología y presenta datos morfológicos para la preparación de la cuerda vocal de la rata para la investigación neuromuscular histoquímica. Debido a la alta variabilidad individual, los puntos de referencia laríngeos deben rastrearse de cerca durante la criosecciona para evitar la sobresección del tejido y la pérdida de tejido. El uso de una metodología consistente, incluida la preparación adecuada del tejido y el conocimiento de los puntos de referencia dentro de la laringe de la rata, ayudará con resultados consistentes en todos los estudios y ayudará a los nuevos investigadores interesados en usar el pliegue vocal de la rata como modelo para investigar los mecanismos neuromusculares laríngeos.

Introducción

La laringe de rata es un modelo bien establecido para investigar las adaptaciones laríngeas neuromusculares estructurales y funcionales al desarrollo, el envejecimiento, la enfermedad y los agentes farmacológicos1,2,3,4,5. La consistencia de los métodos histológicos es fundamental para esta línea de trabajo, ya que existen múltiples complejidades involucradas en la preparación y el análisis muscular, así como desafíos asociados con el tamaño, la forma y la topografía de la laringe de los músculos encapsulados dentro de los cartílagos laríngeos1,6,7,8,9,10,11 . Debido al pequeño tamaño de los músculos laríngeos intrínsecos de la rata, la incrustación sistemática, la congelación y la crioseccionación son fundamentales para lograr resultados consistentes y precisos. Por ejemplo, al seccionar la cuerda vocal de la rata en el plano coronal, las uniones neuromusculares (NMJ) de cuatro de los músculos laríngeos intrínsecos se encuentran a menos de 1,8 mm de profundidad ^tisular11. Por lo tanto, el monitoreo preciso de la anatomía del músculo laríngeo durante la criosecciona es imperativo para identificar con precisión la (s) sección (s) de interés y evitar la sobreseccionamiento del tejido. La sobresección del músculo objetivo puede dar lugar a una identificación inexacta del número y la topografía de ^nmJs11 o puede dar lugar a reducciones generales en el tamaño de la muestra si el músculo objetivo se descarta debido a la confusión de orientación de punto de ^referencia12. A medida que se desarrollan nuevos modelos para el estudio del músculo laríngeo y sus respectivas adaptaciones, los procedimientos operativos estándar son esenciales para garantizar que los resultados sean precisos, confiables y reproducibles en todos los estudios.

El objetivo de este artículo es detallar la preparación de la cuerda vocal de la rata para un análisis longitudinal y transversal óptimo. Se describen métodos detallados utilizados regularmente en nuestro laboratorio para identificar puntos de referencia musculares objetivo durante la crioseccionación. Aunque se utilizan métodos similares en varios laboratorios, aquí se proporciona un mayor detalle que en la literatura para garantizar una replicación confiable y precisa cuando es implementada por investigadores novatos. El objetivo de este tutorial es proporcionar una metodología estándar para la evaluación inmunohistoquímica (IHC) de la cuerda vocal de la rata para mejorar la consistencia en los laboratorios e investigaciones.

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Protocolo

Este estudio se realizó de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York.

1. Diseccionar la laringe de la rata

1. Eutanasia de rata de acuerdo con el protocolo aprobado institucionalmente. Afeitar el cuello ventral desde la mandíbula hasta el manubrium e hisopo con alcohol para evitar la contaminación del pelaje en las muestras de tejido.
2. Bajo un endoscopio de disección con aumento de 10x extirpar toda la laringe creando una incisión en la línea media del cuello con un bisturí hasta que la tráquea esté expuesta.
3. Separe los músculos laríngeos extrínsecos ventrales en la línea media para exponer la laringe usando fórceps y diseccionando tijeras o un bisturí.
4. Corte la tráquea caudal hasta el tercer anillo traqueal y haga una incisión rostral en el hueso hioides para extirpar toda la laringe con tijeras de disección.
5. Extraiga los tejidos laríngeos extrínsecos (esófago, glándula tiroides y músculos laríngeos extrínsecos) de la laringe utilizando herramientas de microdisección (pinzas, alfileres y microescisores) bajo aumento.
6. Con microscisores, divida la laringe dorsalmente entre los aritenoides utilizando la línea media entre los músculos cricoaritenoides posteriores como punto de referencia. Pin paredes laterales de la laringe para exponer las cuerdas vocales y luego dividir ventralmente a través de la línea media del cartílago tiroideo entre la comisura anterior de las cuerdas vocales con microscisores (Figura 1).
   NOTA: Este paso puede ser opcional; se puede omitir para mantener la laringe entera. La bisección de las laringes permite múltiples técnicas de inmunotinción utilizando por separado los lados derecho e izquierdo de la misma laringe.
7. Enjuague cada hemilacinge en solución tamponada con fosfato (PBS) durante ~ 10 s y seque delicadamente con un limpiaparabrisas de tareas para reducir la formación de cristales de hielo durante la congelación.

2. Fijar y/o congelar el tejido laríngeo

NOTA: La fijación puede no ser ideal para todos los protocolos de inmunotinción. A menudo, los tejidos laríngeos se congelan frescos inmediatamente después de la disección. Omita el paso 2.1 para congelar el tejido laríngeo sin fijación.

1. Para fijar hemilaringes, coloque los tejidos en un tubo de centrífuga lleno de formaldehído al 4% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador orbital a 70 rpm. Transfiera los tejidos a un tubo de centrífuga limpio y enjuague 3 veces durante 20 minutos en PBS. Luego transfiera a un tubo de centrífuga limpio y sumérjalo en una solución de sacarosa al 20% / glicerol al 5% (~ 18 h o hasta que el tejido se hunda) a 4 ° C.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído es peligroso y debe usarse en una campana extractora de humos junto con el equipo de protección personal adecuado.
2. Coloque todos los hemi-laringnges en una posición uniforme en un criomolde lleno de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Para una hemilaringe, coloque el tejido con la superficie medial de la cuerda vocal mirando hacia la parte inferior del criomold y el aspecto longitudinal del pliegue vocal paralelo al borde inferior de la abertura criomold. Para laringes enteros, coloque el tejido con los cricoaritenoides posteriores mirando hacia la parte inferior del criomold y el aspecto longitudinal de la cuerda vocal paralelo al borde inferior de la abertura criomal.
   NOTA: La orientación laríngea consistente dentro del compuesto oct es fundamental para la criosecciona de la cuerda vocal de la rata. Una vez que la hemilinge está incrustada y congelada, debe descongelarse para cambiar su orientación, introduciendo así riesgos de daño tisular por múltiples ciclos de descongelación-congelación.
3. Tejidos de congelación instantánea utilizando isopentano (2-metilbutano) refrigerados en un vaso de precipitados de acero rodeado de nitrógeno líquido.
   NOTA: El isopentano alcanza la temperatura óptima para la congelación del tejido cuando los precipitados blancos comienzan a formarse en los lados y la parte inferior del vaso de ^{precipitados13}. El isopentano se usa porque tiene una conductividad térmica más alta que el nitrógeno líquido, lo que ayuda a prevenir el agrietamiento del bloque de tejido durante la congelación rápida. Para una descripción más detallada del tejido congelado en OTC, consulte Kumar et ^al.13.
4. Envuelva cada molde en papel de aluminio preetiquetado y colóquelo en una bolsa de congelador individual para evitar la deshidratación y guárdelo inmediatamente en hielo seco hasta que se transfiera para su almacenamiento en un congelador de -80 ° C.

3. Hemilaringe criosectante en plano transversal

1. Ajuste la temperatura de la cámara en el criostato a -20 ° C, que se encuentra en el medio del rango de temperatura (15-25 ° C) recomendado para la sección del tejido muscular por el manual del fabricante.
2. Ajuste el grosor de la sección del criostato a secciones de 10 μm de espesor.
   NOTA: Para el análisis transversal de fibras musculares, las secciones de 10 μm de espesor son óptimas para permitir una tinción completa y una intensidad de imagen robusta de las fibras musculares marcadas para el análisis de tipificación de fibras14,15,16. Algunos protocolos pueden requerir diferentes grosores de sección dependiendo de los objetivos neuromusculares.
3. Transfiera los tejidos a la cámara de criostato, agregue una capa uniforme de compuesto de OCT en el disco de muestra de criostato (chuck) y coloque el bloque de tejido incrustado encima del compuesto de OCT en el disco de muestra. Para obtener secciones transversales de la cuerda vocal para el análisis de la fibra muscular tiroaritenoide (TA), coloque la muestra en el mandril de modo que el cartílago tiroideo ventral se enfrente a la hoja del criostato y el cartílago aritenoide se enfrente al disco de la muestra.
   NOTA: Es fundamental tener en cuenta que estos puntos de referencia no son visibles en esta etapa, debido a que el compuesto OCT se vuelve blanco y opaco cuando se congela. Esta falta de visibilidad es la razón por la que es fundamental tener en cuenta la orientación de la hemilinge durante la etapa de congelación del flash.
4. Recorte el compuesto oct haciendo avanzar la cabeza de la muestra en 100 μm hasta que aparezca la porción ventral del cartílago tiroideo.
5. Luego recorte y rastree secciones de 30 μm desde el inicio del cartílago tiroideo hasta que se expongan la lámina propia, los músculos medial TA y el músculo TA lateral.
   NOTA: Los puntos de referencia laríngeos deben rastrearse y anotarse desde el inicio del cartílago tiroideo cada 100 μm para garantizar que el ángulo de seccionamiento no sea oblicuo. La Figura 2 representa los dos conjuntos de puntos de referencia laríngeos en el plano de la sección transversal con un aumento de 10x.
6. Una vez que se alcanza el músculo TA objetivo, recoja secciones en diapositivas cargadas positivamente a 10 μm.
7. Guarde las secciones en PBS a 4 °C para retener la humedad hasta que estén listas para teñirse.
   NOTA: El tejido fijo se puede almacenar en PBS hasta una semana dependiendo del objetivo de IHC, mientras que el tejido no fijo debe procesarse de inmediato.

4. Criosectación hemilaríngea en plano longitudinal

1. Con la cámara de criostato nuevamente ajustada a -20 °C, cambie el grosor de la sección a 30 μm.
   NOTA: Para el análisis de NMJ, se puede utilizar un espesor tisular entre 30-60 μm para capturar varios NMJ completos dentro de los músculos laríngeos sin fragmentación de la terminal nerviosa o la placa terminal ^{motora11,12,17}.
2. Para obtener secciones longitudinales de las cuerdas vocales para el análisis NMJ del músculo TA, fije las muestras al mandril de modo que la epiglotis esté orientada hacia la hoja del criostato y la luz traqueal mire hacia abajo hacia el disco de la muestra.
3. Recorte el compuesto oct haciendo avanzar la cabeza de la muestra en 100 μm hasta que aparezca el cartílago tiroideo.
4. Recorte y rastree secciones de 30 μm desde el inicio de la tiroides hasta que la lámina propia y las divisiones medial y lateral del músculo TA estén expuestas.
   NOTA: Se recomiendan cinco conjuntos de puntos de referencia laríngeos en el plano longitudinal para rastrear la progresión de la profundidad del tejido hacia el músculo TA objetivo. La Figura 3 representa los puntos de referencia laríngeos en el plano longitudinal a un aumento de 10x.
5. Una vez que se alcanza el músculo TA objetivo, recoja secciones en diapositivas cargadas positivamente a 30 μm.
6. Guarde las secciones en PBS a 4 °C para retener la humedad hasta que estén listas para teñirse.

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Resultados

Los resultados representativos fueron parte de una investigación en curso de los efectos del ejercicio vocal en el sistema neuromuscular laríngeo. Veintinueve machos de ratas Fischer 344/brown Norway (12 de 9 meses de edad, 17 de 24 meses de edad) fueron pesadas y sacrificadas con inhalación de _CO2 seguida de una toracotomía bilateral.

Los procedimientos siguieron el protocolo descrito para etiquetar nmj y el tamaño de la fibra de los músculos LATERALES y mediales de la AT. La...

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Discusión

La preparación de las cuerdas vocales de las ratas para el análisis neuromuscular puede presentar varios desafíos. Los músculos laríngeos no solo son pequeños y están rodeados de cartílago, lo que dificulta la extracción directa del músculo objetivo, sino que también se encontró una alta variabilidad entre los animales en la profundidad de los puntos de referencia anatómicos laríngeos. Para el protocolo del plano de sección transversal muscular, las secciones completas de las cuerdas vocales aparecieron en...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane Certified	Fisher Chemical	35514
Aluminum Foil	Fisherbrand	1213101
Cryo Tongs SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Cryostat blades	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Disposable Underpads	Medline	23-666-062
Dissection kit	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Frozen Section Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Ice Bucket	Bel-Art	11999054
Immunostain Moisture Chamber	Ted Pella Inc	NC9425474
Needle holders	Assi	ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply	Quick Medical	9023
Orbital shaker	Troemner	02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes	Fisherbrand	5408129
Specimen Storage Bags	Fisherbrand	19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Task wiper	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Scissors	Assi	ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.