Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Tutorials ist es, die Vorbereitung der Rattengespinstfalte für histochemische neuromuskuläre Studien zu beschreiben. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Larynxdissektion von Ratten, das Schockgefrieren und die Kryosektion der Stimmlippen. Diese Studie beschreibt, wie man Stimmlippen sowohl in Längs- als auch in Querschnittsebene kryosektioniert. Eine Neuheit dieses Protokolls ist die Kehlkopfverfolgung während der Kryosektion, die eine genaue Identifizierung der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur gewährleistet und die Wahrscheinlichkeit eines Gewebeverlusts verringert. Die Abbildungen zeigen die fortschreitende Kryosektion in beiden Ebenen. Neunundzwanzig Ratten-Hemi-Laryngen wurden kryosektiert und vom Aufkommen des Schilddrüsenknorpels bis zum Erscheinen des ersten Abschnitts verfolgt, der die volle Stimmlippe enthielt. Die volle Stimmlippe wurde für alle Tiere in beiden Ebenen visualisiert. Es gab eine hohe Variabilität im Abstand vom Auftreten des Schilddrüsenknorpels bis zum Auftreten der vollen Stimmlippe in beiden Ebenen. Das Gewicht korrelierte nicht mit der Tiefe der Kehlkopfmarkierungen, was darauf hindeutet, dass die individuelle Variabilität und andere Faktoren im Zusammenhang mit der Gewebepräparation für die hohe Variabilität des Auftretens von Landmarken während des Schneidens verantwortlich sein könnten. Diese Studie beschreibt eine Methodik und präsentiert morphologische Daten zur Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für histochemische neuromuskuläre Untersuchungen. Aufgrund der hohen individuellen Variabilität sollten Kehlkopfmarkierungen während der Kryosektion genau verfolgt werden, um eine Übersektion von Gewebe und Gewebeverlust zu verhindern. Die Verwendung einer konsistenten Methodik, einschließlich einer angemessenen Gewebevorbereitung und des Bewusstseins für Landmarken im Kehlkopf der Ratte, wird zu konsistenten Ergebnissen in allen Studien beitragen und neuen Forschern helfen, die daran interessiert sind, die Stimmlippe der Ratte als Modell zur Untersuchung der neuromuskulären Kehlkopfmechanismen zu verwenden.

Einleitung

Der Kehlkopf der Ratte ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung struktureller und funktioneller neuromuskulärer Kehlkopfanpassungen an Entwicklung, Alterung, Krankheit und pharmakologische Wirkstoffe1,2,3,4,5. Die Konsistenz histologischer Methoden ist für diese Arbeit von entscheidender Bedeutung, da bei der Muskelvorbereitung und -analyse mehrere Feinheiten beteiligt sind, sowie Herausforderungen im Zusammenhang mit der Größe, Form und Topographie der in den Kehlkopfknorpeln eingekapselten Muskeln1,6,7,8,9,10,11 . Aufgrund der geringen Größe der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur der Ratte sind systematisches Einbetten, Einfrieren und Kryosektion entscheidend, um konsistente und genaue Ergebnisse zu erzielen. Wenn beispielsweise die Stimmlippe der Ratte in der koronalen Ebene geschnitten wird, befinden sich die neuromuskulären Verbindungen (NMJs) von vier der intrinsischen Kehlkopfmuskeln innerhalb von weniger als 1,8 mm ^{Gewebetiefe11}. Daher ist eine präzise Überwachung der Anatomie der Kehlkopfmuskulatur während der Kryosektion unerlässlich, um die interessierenden Abschnitte genau zu identifizieren und eine Übersektion des Gewebes zu verhindern. Eine Übersektion des Zielmuskels kann zu einer ungenauen Identifizierung der Anzahl und Topographie von ^NMJs11 oder zu einer Gesamtverringerung der Stichprobengröße führen, wenn der Zielmuskel aufgrund von Orientierungsverwechslungen verworfen ^wird12. Da neuartige Modelle für die Untersuchung des Kehlkopfmuskels und ihrer jeweiligen Anpassungen entwickelt werden, sind Standardarbeitsanweisungen unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse in allen Studien präzise, zuverlässig und reproduzierbar sind.

Ziel dieses Artikels ist es, die Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für eine optimale Längs- und Querschnittsanalyse detailliert zu beschreiben. Detaillierte Methoden, die regelmäßig in unserem Labor angewendet werden, werden beschrieben, um Zielmuskelmarker während der Kryosektion zu identifizieren. Obwohl ähnliche Methoden in mehreren Labors verwendet werden, werden hier mehr Details als in der Literatur bereitgestellt, um eine zuverlässige und genaue Replikation zu gewährleisten, wenn sie von unerfahrenen Forschern implementiert wird. Ziel dieses Tutorials ist es, eine Standardmethodik für die immunhistochemische (IHC) Bewertung der Rattengespinstfalte bereitzustellen, um die Konsistenz zwischen Labors und Untersuchungen zu verbessern.

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Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der New York University School of Medicine durchgeführt.

1. Zerlegen Sie den Kehlkopf der Ratte

1. Euthanasierung der Ratte gemäß dem institutionell genehmigten Protokoll. Rasieren Sie den ventralen Hals vom Unterkiefer bis zum Manubrium und tupfen Sie ihn mit Alkohol ab, um eine Fellkontamination in den Gewebeproben zu verhindern.
2. Unter einem Sezierfernrohr mit 10-facher Vergrößerung wird der gesamte Kehlkopf ausgeschnitten, indem mit einem Skalpell ein Mittellinien-Halsschnitt erstellt wird, bis die Luftröhre freigelegt wird.
3. Trennen Sie die ventralen extrinsischen Kehlkopfmuskeln an der Mittellinie, um den Kehlkopf mit einer Pinzette und einer Schere oder einem Skalpell freizulegen.
4. Trennen Sie die Luftröhre kaudal zum dritten Trachealring und machen Sie einen Rostralschnitt zum Zungenbein, um den gesamten Kehlkopf mit einer Sezierschere zu entfernen.
5. Entfernen Sie das extrinsische Kehlkopfgewebe (Speiseröhre, Schilddrüse und extrinsische Kehlkopfmuskeln) mit Mikrodesektionswerkzeugen (Pinzette, Stifte und Mikroscheren) unter Vergrößerung aus dem Kehlkopf.
6. Mit Mikroscheren den Kehlkopf dorsal zwischen den Arytenoiden halbieren, wobei die Mittellinie zwischen den hinteren Cricoarytenoidmuskeln als Orientierungspunkt verwendet wird. Pin seitenwände des Kehlkopfes, um die Stimmlippen freizulegen, und halbieren Sie dann ventral durch die Mittellinie des Schilddrüsenknorpels zwischen der vorderen Kommissur der Stimmlippen mit Mikroscheren (Abbildung 1).
   HINWEIS: Dieser Schritt kann optional sein. es kann übersprungen werden, um den Kehlkopf ganz zu halten. Die Bisektion von Kehlköpfen ermöglicht mehrere Immunfärbungstechniken, indem die rechte und linke Seite desselben Kehlkopfes getrennt verwendet wird.
7. Spülen Sie jeden Hemi-Larynx in phosphatgepufferter Lösung (PBS) für ~ 10 s und trocknen Sie ihn vorsichtig mit einem Task-Wischer, um die Eiskristallbildung während des Einfrierens zu reduzieren.

2. Larynxgewebe fixieren und/oder schockgefrieren

HINWEIS: Die Fixierung ist möglicherweise nicht für alle Immunfärbungsprotokolle ideal. Oft werden Kehlkopfgewebe unmittelbar nach der Dissektion frisch schockgefroren. Überspringen Sie Schritt 2.1, um Kehlkopfgewebe ohne Fixierung einzufrieren.

1. Zur Fixierung von Hemi-Laryngen legen Sie Gewebe in ein mit 4% Formaldehyd gefülltes Zentrifugenröhrchen in PBS für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 70 U / min. Gewebe in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und 3x für 20 min in PBS abspülen. Dann in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und bei 4 °C in eine 20% ige Saccharose/5%ige Glycerinlösung (~18 h oder bis das Gewebe sinkt) tauchen.
   VORSICHT: Formaldehyd ist gefährlich und sollte zusammen mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung in einem Abzug verwendet werden.
2. Legen Sie alle Hemi-Laryngen in eine gleichmäßige Position in eine Kryoform, die mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) gefüllt ist. Für einen Hemilarynx platzieren Sie das Gewebe mit der medialen Oberfläche der Stimmlippe, die der Unterseite der Kryomold zugewandt ist, und dem Längsaspekt der Stimmlippe parallel zum unteren Rand der Kryomalöffnung. Für ganze Laryngen platzieren Sie das Gewebe mit den hinteren Cricoarytenoiden, die der Unterseite der Kryomold und dem Längsaspekt der Stimmlippe zugewandt sind, parallel zum unteren Rand der Kryomalöffnung.
   HINWEIS: Eine konsistente Kehlkopforientierung innerhalb der OCT-Verbindung ist entscheidend für die Kryosektion der Stimmlippe der Ratte. Sobald der Hemilarynx eingebettet und eingefroren ist, muss er aufgetaut werden, um seine Orientierung zu ändern, wodurch das Risiko von Gewebeschäden durch mehrere Tau-Gefrier-Zyklen entsteht.
3. Schockfrostgewebe mit Isopentan (2-Methylbutan), gekühlt in einem Stahlbecherglas, umgeben von flüssigem Stickstoff.
   HINWEIS: Das Isopentan erreicht eine optimale Temperatur für das Einfrieren des Gewebes, wenn sich weiße Ausscheidungen an den Seiten und am Boden des Becherglases ^bilden13. Isopentan wird verwendet, weil es eine höhere Wärmeleitfähigkeit als flüssiger Stickstoff aufweist, was ein Reißen des Gewebeblocks beim schnellen Einfrieren verhindert. Für eine detailliertere Beschreibung des Einfrierens von Gewebe bei OTC siehe Kumar et ^al.13.
4. Wickeln Sie jede Form in voretikettierte Folie und legen Sie sie in einen einzelnen Gefrierbeutel, um Austrocknung zu verhindern, und lagern Sie sie sofort auf Trockeneis, bis sie zur Lagerung in einem -80 ° C-Gefrierschrank überführt werden.

3. Kryosektions-Hemilarynx in der Querschnittsebene

1. Stellen Sie die Kammertemperatur im Kryostaten auf -20 °C ein, was in der Mitte des Temperaturbereichs (15−25 °C) liegt, der im Handbuch des Herstellers für die Muskelgewebeschnitte empfohlen wird.
2. Stellen Sie die Dicke des Kryostatenabschnitts auf 10 μm dicke Abschnitte ein.
   HINWEIS: Für die Muskelfaserquerschnittsanalyse sind 10 μm dicke Abschnitte optimal, um eine vollständige Färbung und eine robuste Bildgebungsintensität der markierten Muskelfasern für die Fasertypisierungsanalyse zu ermöglichen14,15,16. Einige Protokolle können je nach neuromuskulären Zielen eine unterschiedliche Abschnittsdicke erfordern.
3. Übertragen Sie Gewebe in die Kryostatenkammer, fügen Sie eine gleichmäßige Schicht OCT-Verbindung auf die Kryostatprobenscheibe (Chuck) hinzu und legen Sie den eingebetteten Gewebeblock auf die OCT-Verbindung auf die Probenscheibe. Um Querschnitte der Stimmlippe für die Thyroarytenoid (TA) Muskelfaseranalyse zu erhalten, befestigen Sie die Probe am Chuck, so dass der ventrale Schilddrüsenknorpel der Kryostatenklinge und der Arytenoidknorpel der Probenscheibe zugewandt ist.
   HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass diese Landmarken zu diesem Zeitpunkt nicht sichtbar sind, da die OCT-Verbindung beim Einfrieren weiß und undurchsichtig wird. Dieser Mangel an Sichtbarkeit ist der Grund, warum es wichtig ist, die Ausrichtung des Hemilarynx während des Schockfroststadiums zu beachten.
4. Trimmen Sie die OCT-Verbindung, indem Sie den Probenkopf um 100 μm vorrücken, bis der ventrale Teil des Schilddrüsenknorpels erscheint.
5. Dann trimmen und verfolgen Sie 30 μm Abschnitte vom Beginn des Schilddrüsenknorpels bis die Lamina propria, die medialen TA-Muskeln und der laterale TA-Muskel freigelegt sind.
   HINWEIS: Kehlkopfmarkierungen sollten vom Beginn des Schilddrüsenknorpels alle 100 μm verfolgt und notiert werden, um sicherzustellen, dass der Schnittwinkel nicht schräg ist. Abbildung 2 zeigt die beiden Sätze von Kehlkopf-Landmarken in der Querschnittsebene bei 10-facher Vergrößerung.
6. Sobald der Ziel-TA-Muskel erreicht ist, sammeln Sie Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern bei 10 μm.
7. Lagern Sie die Abschnitte in PBS bei 4 °C, um Feuchtigkeit zu speichern, bis sie zum Färben bereit sind.
   HINWEIS: Festes Gewebe kann je nach IHC-Ziel bis zu einer Woche in PBS gelagert werden, während nicht fixiertes Gewebe sofort verarbeitet werden sollte.

4. Kryosektions-Hemilarynx in Längsebene

1. Wenn die Kryostatenkammer wieder auf -20 °C eingestellt ist, ändern Sie die Querschnittsdicke auf 30 μm.
   HINWEIS: Für die NMJ-Analyse kann eine Gewebedicke zwischen 30−60 μm verwendet werden, um mehrere vollständige NMJs innerhalb der Kehlkopfmuskulatur ohne Fragmentierung der Nervenend- oder motorischen Endplatte zu erfassen11,12,17.
2. Um longitudinale Stimmlippenschnitte für die NMJ-Analyse des TA-Muskels zu erhalten, befestigen Sie die Proben am Chuck, so dass die Epiglottis auf die Kryostatenklinge ausgerichtet ist und das Tracheallumen nach unten zur Probenscheibe zeigt.
3. Trimmen Sie die OCT-Verbindung, indem Sie den Probenkopf um 100 μm vorrücken, bis der Schilddrüsenknorpel erscheint.
4. Trimm- und Spurabschnitte von 30 μm vom Einsetzen der Schilddrüse bis zur Lamina propria sowie mediale und laterale Unterteilungen des TA-Muskels werden freigelegt.
   HINWEIS: Fünf Sätze von Kehlkopfmarkierungen in der Längsebene werden empfohlen, um die Progression der Gewebetiefe in Richtung des Ziel-TA-Muskels zu verfolgen. Abbildung 3 zeigt die Kehlkopfmarkerpunkte in der Längsebene bei 10-facher Vergrößerung.
5. Sobald der Ziel-TA-Muskel erreicht ist, sammeln Sie Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern bei 30 μm.
6. Lagern Sie die Abschnitte in PBS bei 4 °C, um Feuchtigkeit zu speichern, bis sie zum Färben bereit sind.

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Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse waren Teil einer laufenden Untersuchung der Auswirkungen von Stimmübungen auf das kehlkopfe neuromuskuläre System. Neunundzwanzig männliche Fischer 344/braune Wanderratten (12 9 Monate alt, 17 24 Monate alt) wurden gewogen und mit _{CO2-Inhalation} gefolgt von einer bilateralen Thorakotomie eingeschläfert.

Die Verfahren folgten dem skizzierten Protokoll zur Kennzeichnung von NMJs und Fasergröße der lateralen und medialen TA-Muskeln. Der Abstand zwi...

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Diskussion

Die Vorbereitung der Stimmlippen von Ratten für die neuromuskuläre Analyse kann verschiedene Herausforderungen mit sich bringen. Die Kehlkopfmuskulatur ist nicht nur klein und von Knorpel umgeben, was es schwierig macht, den Zielmuskel direkt zu extrahieren, sondern es wurde auch eine hohe Variabilität zwischen Tieren in der Tiefe der anatomischen Kehlkopfmarkierungen festgestellt. Für das Protokoll der Querschnittsebene des Muskels traten vollständige Stimmlippenabschnitte zwischen 21-85 Abschnitten (10 μm pro Abs...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane Certified	Fisher Chemical	35514
Aluminum Foil	Fisherbrand	1213101
Cryo Tongs SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Cryostat blades	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Disposable Underpads	Medline	23-666-062
Dissection kit	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Frozen Section Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Ice Bucket	Bel-Art	11999054
Immunostain Moisture Chamber	Ted Pella Inc	NC9425474
Needle holders	Assi	ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply	Quick Medical	9023
Orbital shaker	Troemner	02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes	Fisherbrand	5408129
Specimen Storage Bags	Fisherbrand	19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Task wiper	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Scissors	Assi	ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.