Preparazione della piega vocale del ratto per le analisi neuromuscolari

Riepilogo

Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per preparare le corde vocali dei ratti per lo studio neuromuscolare istochimico.

Abstract

Lo scopo di questo tutorial è descrivere la preparazione della piega vocale del ratto per lo studio neuromuscolare istochimico. Questo protocollo delinea le procedure per la dissezione laringea del ratto, il congelamento flash e la criosezione delle corde vocali. Questo studio descrive come criosezionare le corde vocali sia sul piano longitudinale che su quello della sezione trasversale. Una novità di questo protocollo è il tracciamento laringeo durante la criosezione che garantisce un'accurata identificazione dei muscoli laringei intrinseci e riduce la possibilità di perdita di tessuto. Le cifre dimostrano la criosezione progressiva in entrambi i piani. Ventinove emi-laringi di ratto sono state criosezionate e tracciate dall'emergere della cartilagine tiroidea alla comparsa della prima sezione che includeva l'intera piega vocale. La piega vocale completa è stata visualizzata per tutti gli animali in entrambi i piani. C'era un'alta variabilità nella distanza dalla comparsa della cartilagine tiroidea alla comparsa della piega vocale completa in entrambi i piani. Il peso non era correlato alla profondità dei punti di riferimento laringei, suggerendo che la variabilità individuale e altri fattori legati alla preparazione dei tessuti possono essere responsabili dell'elevata variabilità nell'aspetto dei punti di riferimento durante il sezionamento. Questo studio descrive in dettaglio una metodologia e presenta dati morfologici per la preparazione della piega vocale del ratto per l'indagine neuromuscolare istochimica. A causa dell'elevata variabilità individuale, i punti di riferimento laringei devono essere monitorati attentamente durante la criosezione per prevenire la sovraselezione di tessuti e perdite di tessuto. L'uso di una metodologia coerente, compresa un'adeguata preparazione dei tessuti e la consapevolezza dei punti di riferimento all'interno della laringe del ratto, aiuterà con risultati coerenti in tutti gli studi e aiuterà i nuovi ricercatori interessati a utilizzare la piega vocale del ratto come modello per studiare i meccanismi neuromuscolari laringei.

Introduzione

La laringe di ratto è un modello consolidato per studiare gli adattamenti laringei neuromuscolari strutturali e funzionali allo sviluppo, all'invecchiamento, alla malattia e agli agenti farmacologici1,2,3,4,5. La coerenza dei metodi istologici è fondamentale per questa linea di lavoro, in quanto vi sono molteplici complessità coinvolte nella preparazione e nell'analisi muscolare, nonché sfide associate alle dimensioni laringee, alla forma e alla topografia dei muscoli incapsulati all'interno delle cartilagini laringee1,6,7,8,9,10,11 . A causa delle piccole dimensioni dei muscoli laringei intrinseci del ratto, l'incorporamento sistematico, il congelamento e la criosezione sono fondamentali per ottenere risultati coerenti e accurati. Ad esempio, quando si seziona la piega vocale del ratto nel piano coronale, le giunzioni neuromuscolari (NMJ) di quattro dei muscoli laringei intrinseci si trovano a meno di 1,8 mm di profondità del ^tessuto11. Pertanto, il monitoraggio preciso dell'anatomia del muscolo laringeo durante la criosezione è indispensabile per identificare con precisione le sezioni di interesse e prevenire la sovraselezione del tessuto. La sovraselezione del muscolo bersaglio può comportare un'identificazione imprecisa del numero e della topografia di ^NMJs11 o può comportare riduzioni complessive delle dimensioni del campione se il muscolo bersaglio viene scartato a causa della confusione dell'orientamento del punto di ^{riferimento12}. Man mano che vengono sviluppati nuovi modelli per lo studio del muscolo laringeo e dei rispettivi adattamenti, le procedure operative standard sono essenziali per garantire che i risultati siano precisi, affidabili e riproducibili tra gli studi.

L'obiettivo di questo articolo è quello di dettagliare la preparazione della piega vocale del ratto per un'analisi longitudinale e trasversale ottimale. Vengono descritti metodi dettagliati utilizzati regolarmente nel nostro laboratorio per identificare i punti di riferimento muscolari target durante la criosezione. Sebbene metodi simili siano utilizzati in diversi laboratori, qui vengono forniti maggiori dettagli rispetto alla letteratura per garantire una replica affidabile e accurata quando implementata da sperimentatori alle prime armi. L'obiettivo di questo tutorial è quello di fornire una metodologia standard per la valutazione immunoistochimica (IHC) della piega vocale del ratto per migliorare la coerenza tra laboratori e indagini.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee della New York University School of Medicine.

1. Sezionare la laringe di ratto

1. Eutanasia ratto secondo il protocollo istituzionalmente approvato. Rasare il collo ventrale dalla mandibola al manubrio e tamponare con alcool per prevenire la contaminazione della pelliccia nei campioni di tessuto.
2. Sotto un cannocchiale di dissezione con ingrandimento 10x asportare l'intera laringe creando un'incisione del collo della linea mediana con un bisturi fino a quando la trachea non è esposta.
3. Separare i muscoli laringei estrinseci ventrali sulla linea mediana per esporre la laringe usando una pinza e sezionando le forbici o un bisturi.
4. Tagliare la trachea caudale al terzo anello tracheale e fare un'incisione rostrale all'osso ioide per asportare l'intera laringe usando le forbici sezionanti.
5. Rimuovere i tessuti laringei estrinseci (esofago, ghiandola tiroidea e muscoli laringei estrinseci) dalla laringe utilizzando strumenti di microdissezione (pinzette, spilli e microscissori) sotto ingrandimento.
6. Con i microscissori, tagliare in due la laringe dorsalmente tra gli aritenoidi usando la linea mediana tra i muscoli cricoarytenoidi posteriori come punto di riferimento. Appuntare le pareti laterali della laringe per esporre le corde vocali e quindi tagliare in due ventralmente attraverso la linea mediana della cartilagine tiroidea tra la commissura anteriore delle corde vocali con microscissori (Figura 1).
   NOTA: questo passaggio può essere facoltativo; può essere saltato per mantenere la laringe intera. La bisezione delle laringi consente più tecniche di immunocolorazione utilizzando separatamente i lati destro e sinistro della stessa laringe.
7. Risciacquare ogni emi-laringe in soluzione tamponata con fosfato (PBS) per ~ 10 s e asciugare delicatamente con un tergicristallo per ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento.

2. Fissare e/o congelare il tessuto laringeo

NOTA: la fissazione potrebbe non essere ideale per tutti i protocolli di immunocolorazione. Spesso i tessuti laringei sono congelati con il flash fresco immediatamente dopo la dissezione. Saltare il passaggio 2.1 per congelare il tessuto laringeo senza fissazione.

1. Per fissare le emi-laringi posizionare i tessuti in un tubo di centrifuga riempito con formaldeide al 4% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 70 giri / min. Trasferire i tessuti in un tubo centrifugo pulito e risciacquare 3 volte per 20 minuti in PBS. Quindi trasferire in un tubo di centrifuga pulito e immergere in una soluzione di saccarosio al 20% / glicerolo al 5% (~ 18 ore o fino a quando il tessuto non affonda) a 4 ° C.
   ATTENZIONE: La formaldeide è pericolosa e deve essere utilizzata in una cappa aspirante insieme a dispositivi di protezione individuale appropriati.
2. Posizionare tutte le emi-laringi in una posizione uniforme in un criostampo riempito con un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT). Per un'emilaringe, posizionare il tessuto con la superficie mediale della corda vocale rivolta verso il fondo della criostampe e l'aspetto longitudinale della piega vocale parallelo al bordo inferiore dell'apertura del criostampo. Per le laringi intere, posizionare il tessuto con i cricoarytenoidi posteriori rivolti verso il fondo del criostampo e l'aspetto longitudinale della piega vocale parallelo al bordo inferiore dell'apertura del criostampo.
   NOTA: l'orientamento laringeo coerente all'interno del composto OCT è fondamentale per la criosezione della piega vocale del ratto. Una volta che l'emilaringe è incorporata e congelata, deve essere scongelata per cambiare il suo orientamento, introducendo così rischi di danni ai tessuti da più cicli di disgelo-congelamento.
3. Flash-freeze tessuti utilizzando isopentano (2-metilbutano) refrigerato in un becher di acciaio circondato da azoto liquido.
   NOTA: L'isopentano raggiunge la temperatura ottimale per il congelamento dei tessuti quando iniziano a formarsi precipitati bianchi sui lati e sul fondo del ^becher13. L'isopentano viene utilizzato perché ha una conduttività termica più elevata rispetto all'azoto liquido, che aiuta a prevenire la fessurazione del blocco tissutale durante il congelamento rapido. Per una descrizione più dettagliata del congelamento del tessuto in OTC fare riferimento a Kumar et ^al.13.
4. Avvolgere ogni stampo in un foglio premarcato e metterlo in un singolo sacchetto congelatore per evitare la disidratazione e conservare immediatamente su ghiaccio secco fino a quando non viene trasferito per la conservazione in un congelatore a -80 °C.

3. Criosezione dell'emilaringe nel piano della sezione trasversale

1. Impostare la temperatura della camera nel criostato a -20 °C, che si trova nel mezzo dell'intervallo di temperatura (15-25 °C) raccomandato per il sezionamento del tessuto muscolare dal manuale del produttore.
2. Impostare lo spessore della sezione criostato su sezioni spesse 10 μm.
   NOTA: per l'analisi della sezione trasversale delle fibre muscolari, le sezioni spesse 10 μm sono ottimali per consentire una colorazione completa e un'intensità di imaging robusta delle fibre muscolari etichettate per l'analisi della tipizzazione delle fibre14,15,16. Alcuni protocolli possono richiedere uno spessore di sezione diverso a seconda dei bersagli neuromuscolari.
3. Trasferire i tessuti nella camera criostata, aggiungere uno strato uniforme di composto OCT sul disco del campione criostato (mandrino) e posizionare il blocco di tessuto incorporato sopra il composto OCT sul disco del campione. Per ottenere sezioni trasversali della piega vocale per l'analisi delle fibre muscolari tireoatenoidi (TA), apporre il campione al mandrino in modo che la cartilagine tiroidea ventrale sia rivolta verso la lama del criostato e la cartilagine aritenoide sia rivolta verso il disco del campione.
   NOTA: è fondamentale notare che questi punti di riferimento non sono visibili in questa fase, a causa del composto OCT che diventa bianco e opaco quando congelato. Questa mancanza di visibilità è il motivo per cui è fondamentale notare l'orientamento dell'emilaringe durante la fase di congelamento del flash.
4. Tagliare il composto OCT facendo avanzare la testa del campione di 100 μm fino a quando appare la porzione ventrale della cartilagine tiroidea.
5. Quindi tagliare e tracciare sezioni di 30 μm dall'inizio della cartilagine tiroidea fino a quando la lamina propria, i muscoli TA mediali e il muscolo TA laterale sono esposti.
   NOTA: i punti di riferimento laringei devono essere tracciati e annotati dall'inizio della cartilagine tiroidea ogni 100 μm per garantire che l'angolo di sezionamento non sia obliquo. La Figura 2 rappresenta i due insiemi di punti di riferimento laringei nel piano della sezione trasversale con ingrandimento 10x.
6. Una volta raggiunto il muscolo TA target, raccogliere sezioni su vetrini caricati positivamente a 10 μm.
7. Conservare le sezioni in PBS a 4 °C per trattenere l'umidità fino a quando non sono pronte per essere macchiate.
   NOTA: il tessuto fisso può essere conservato in PBS fino a una settimana a seconda del target IHC, mentre il tessuto non fissato deve essere immediatamente elaborato.

4. Criosezione emilaringe nel piano longitudinale

1. Con la camera criostata nuovamente impostata a -20 °C, modificare lo spessore della sezione a 30 μm.
   NOTA: Per l'analisi NMJ, uno spessore del tessuto compreso tra 30-60 μm può essere utilizzato per catturare diversi NMJ completi all'interno dei muscoli laringei senza frammentazione del terminale nervoso o della piastra terminale del ^{motore11,12,17}.
2. Per ottenere sezioni longitudinali della piega vocale per l'analisi NMJ del muscolo TA, apporre i campioni al mandrino in modo che l'epiglottide sia orientata verso la lama criostatale e il lume tracheale rivolto verso il basso verso il disco del campione.
3. Tagliare il composto OCT facendo avanzare la testa del campione di 100 μm fino a quando appare la cartilagine tiroidea.
4. Tagliare e tracciare sezioni di 30 μm dall'inizio della tiroide fino a quando la lamina propria e le divisioni mediali e laterali del muscolo TA sono esposte.
   NOTA: Si raccomandano cinque serie di punti di riferimento laringei nel piano longitudinale per tracciare la progressione della profondità del tessuto verso il muscolo TA target. La Figura 3 rappresenta i punti di riferimento laringei nel piano longitudinale con ingrandimento 10x.
5. Una volta raggiunto il muscolo TA target, raccogliere sezioni su vetrini caricati positivamente a 30 μm.
6. Conservare le sezioni in PBS a 4 °C per trattenere l'umidità fino a quando non sono pronte per essere macchiate.

Risultati

I risultati rappresentativi facevano parte di un'indagine in corso sugli effetti dell'esercizio vocale sul sistema neuromuscolare laringeo. Ventinove ratti maschi Fischer 344/brown Norway (12 di 9 mesi, 17 di 24 mesi) sono stati pesati ed eutanasizzati con inalazione di _CO2 seguita da una toracotomia bilaterale.

Le procedure hanno seguito il protocollo delineato per etichettare NMJ e dimensioni delle fibre dei muscoli TA laterali e mediali. La distanza tra i punti di riferimento lar...

Discussione

La preparazione delle corde vocali dei ratti per l'analisi neuromuscolare può presentare varie sfide. Non solo i muscoli laringei sono piccoli e circondati da cartilagine, rendendo così difficile estrarre direttamente il muscolo bersaglio, ma è stata trovata anche un'elevata variabilità tra gli animali nella profondità dei punti di riferimento anatomici laringei. Per il muscolo il protocollo del piano della sezione trasversale, le sezioni complete della piega vocale sono apparse tra 21-85 sezioni (10 μm per sezione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane Certified	Fisher Chemical	35514
Aluminum Foil	Fisherbrand	1213101
Cryo Tongs SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Cryostat blades	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Disposable Underpads	Medline	23-666-062
Dissection kit	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Frozen Section Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Ice Bucket	Bel-Art	11999054
Immunostain Moisture Chamber	Ted Pella Inc	NC9425474
Needle holders	Assi	ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply	Quick Medical	9023
Orbital shaker	Troemner	02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes	Fisherbrand	5408129
Specimen Storage Bags	Fisherbrand	19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Task wiper	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Scissors	Assi	ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.