用于神经肌肉分析的大鼠声带的制备

摘要

该协议描述了用于准备大鼠声带以进行组织化学神经肌肉研究的方法。

摘要

本教程的目的是描述用于组织化学神经肌肉研究的大鼠声带的准备工作。该协议概述了大鼠喉部解剖，闪光冷冻和声带冷冻切除术的程序。本研究描述了如何在纵向和横截面上冷冻切除声带。该协议的新颖之处在于冷冻切除过程中的喉部跟踪，可确保准确识别内在喉部肌肉并减少组织丢失的机会。数字显示了两个平面的渐进式冷冻切除。对29只大鼠半喉部进行了冷冻切除术，并从甲状腺软骨的出现到包括整个声带的第一部分的外观进行了跟踪。两个平面上所有动物的完整声带都可视化了。从甲状腺软骨的外观到两个平面上的完整声带的距离存在很高的变异性。体重与喉部标志物的深度无关，这表明个体变异性以及与组织准备相关的其他因素可能是切片过程中标志物外观高变异性的原因。本研究详细介绍了一种方法，并提供了用于准备大鼠声带以进行组织化学神经肌肉检查的形态学数据。由于个体变异性高，在冷冻切除过程中应密切跟踪喉部标志物，以防止过度切除组织和组织丢失。使用一致的方法，包括足够的组织准备和对大鼠喉内标志物的认识，将有助于在研究中获得一致的结果，并帮助有兴趣使用大鼠声带作为模型的新研究人员研究喉神经肌肉机制。

引言

大鼠喉是一个成熟的模型，用于研究结构和功能神经肌肉喉对发育，衰老，疾病和药理药物的适应性^{1，2，3，4，5}。组织学方法的一致性对于这项工作至关重要，因为肌肉制备和分析涉及多种复杂性，以及与喉软骨内封装的肌肉的喉部大小，形状和形貌相关的挑战^1，6，^{7，8，9，10，11}.由于大鼠内在喉部肌肉的尺寸很小，系统地嵌入，冷冻和冷冻切除对于获得一致和准确的结果至关重要。例如，当在冠状平面上切割大鼠声带时，四个内在喉肌的神经肌肉接头（NMJ）位于组织深度小于1.8 mm以内¹¹。因此，在冷冻切除过程中精确监测喉部肌肉解剖结构对于准确识别感兴趣的部分并防止组织过度切除至关重要。目标肌肉的过度切除可能导致 ^NMJs11 的数量和形貌识别不准确，或者如果目标肌肉由于特征性方向混淆而被丢弃，则可能导致样本量总体减少¹²。随着喉部肌肉研究及其各自适应性的新模型的开发，标准操作程序对于确保结果在研究中精确，可靠和可重复至关重要。

本文的目的是详细准备大鼠声带，以实现最佳纵向和横截面分析。描述了我们实验室中经常使用的详细方法，以在冷冻切除过程中识别目标肌肉标志物。虽然在几个实验室中使用了类似的方法，但这里提供了比文献中更多的细节，以确保新手研究人员实施时可靠和准确的复制。本教程的目标是为大鼠声带的免疫组织化学（IHC）评估提供标准方法，以提高实验室和研究的一致性。

研究方案

本研究是根据纽约大学医学院机构动物护理和使用委员会进行的。

1. 解剖大鼠喉部

1. 根据机构批准的协议对大鼠实施安乐死。将腹颈部从下颌骨剃到手洗，并用酒精拭子擦拭，以防止组织标本中的毛皮污染。
2. 在具有10倍放大倍率的解剖镜下，通过用手术刀创建中线颈部切口来切除整个喉部，直到气管暴露。
3. 将腹侧外侧喉肌分开，使用镊子和解剖剪刀或手术刀暴露喉部。
4. 将气管尾部切开到第三气管环，并在舌骨上做一个切口，用解剖剪刀切除整个喉部。
5. 使用显微切割工具（镊子、销和微剪刀）从喉部取出外源性喉组织（食道、甲状腺和外源性喉肌）。
6. 使用微剪刀，使用后腱肌之间的中线作为标志，将喉背侧的肛门一分为二。用微剪刀将喉部的侧壁固定以暴露声带，然后通过声带前部之间的甲状腺软骨中线将腹侧一分为二（图1）。
   注意:此步骤可以是可选的;可以跳过它以保持喉部完整。喉部的两切允许通过分别使用同一喉部的右侧和左侧来进行多种免疫染色技术。
7. 在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中冲洗每个半喉部约10秒，并用任务刮水器轻轻干燥，以减少冷冻过程中的冰晶形成。

2. 固定和/或快速冷冻喉组织

注意:固定可能不适用于所有免疫染色方案。喉组织通常在解剖后立即被快速冷冻。跳过步骤2.1，无需固定即可快速冷冻喉部组织。

1. 为了固定半喉，将组织置于装有4%甲醛的PBS离心管中，室温下在70rpm的轨道振荡器上1小时。将组织转移到干净的离心管中，并在PBS中冲洗3次20分钟。然后转移到干净的离心管中，并在4°C下浸没在20%蔗糖/ 5%甘油溶液中（约18小时或直到组织下沉）。
   注意:甲醛是危险的，应与适当的个人防护设备一起在通风橱中使用。
2. 将所有半喉部均匀放置到充满最佳切割温度（OCT）化合物的冷冻模具中。对于半边，将声带内侧表面面向冷冻器底部的组织放置，并将声带的纵向面平行于冷冻器开口的下边缘。对于整个喉部，将后侧胪骨的组织朝向冷冻膜的底部，并且声带的纵向面平行于冷冻孔的下边缘。
   注意:OCT化合物内一致的喉部方向对于大鼠声带的冷冻切除至关重要。一旦包埋并冷冻了半边，就必须解冻以改变其方向，从而引入多次解冻-冷冻循环导致组织损伤的风险。
3. 使用异戊烷（2-甲基丁烷）在被液氮包围的钢制烧杯中冷却的闪冻组织。
   注:当烧杯的侧面和底部开始形成白色沉淀物时，异戊烷达到组织冷冻的最佳温度¹³。使用异戊烷是因为它具有比液氮更高的导热性，这有助于防止组织块在快速冷冻过程中开裂。有关OTC中冷冻组织的更详细说明，请参阅Kumar等人¹³。
4. 将每个模具包裹在预先标记的箔中，并放入单独的冷冻袋中以防止脱水，并立即储存在干冰上，直到转移到-80°C的冰箱中储存。

3. 横截面上的冷冻切除术

1. 将低温恒温器中的腔室温度设置为-20°C，该温度介于制造商手册推荐用于肌肉组织切片的温度范围（15-25°C）的中间。
2. 将低温恒温器截面厚度设置为 10 μm 厚截面。
   注意:对于肌肉纤维横截面分析，10μm厚的切片是最佳的，可以对标记的肌肉纤维进行完整的染色和强大的成像强度，以进行纤维分型分析^14，15，16。某些方案可能需要不同的切片厚度，具体取决于神经肌肉靶标。
3. 将组织转移到低温恒温器室，在低温恒温器标本盘（卡盘）上加入一层均匀的OCT化合物，并将嵌入的组织块放在标本盘上的OCT化合物的顶部。要获得用于甲状腺样动脉 （TA） 肌纤维分析的声带横截面，请将标本贴在卡盘上，使腹侧甲状腺软骨面向低温恒温器叶片，而类肾上腺软骨面向标本盘。
   注意:重要的是要注意，这些地标在此阶段是不可见的，因为OCT化合物在冷冻时会变白和不透明。这种可见性的缺乏是为什么在闪光冻结阶段注意下颌的方向至关重要的原因。
4. 通过将标本头部推进100μm直到甲状腺软骨的腹侧部分出现来修剪OCT化合物。
5. 然后修剪并跟踪从甲状腺软骨开始的30μm切片，直到固有层，内侧TA肌肉和外侧TA肌肉暴露。
   注意:从甲状腺软骨开始，每100μm一次，应跟踪并注意喉部标志，以确保切片的角度不倾斜。 图2 表示横截面上以10倍放大倍率下的两组喉部特征。
6. 一旦达到目标TA肌肉，在10μm处收集带正电荷的载玻片上的切片。
7. 将切片储存在4°C的PBS中以保持水分，直到它们准备好染色。
   注意:固定组织可以在PBS中储存长达一周，具体取决于IHC靶标，而未固定的组织应立即处理。

4. 纵平面冷冻切除术

1. 将低温恒温器室再次设置为-20°C，将截面厚度更改为30μm。
   注意:对于 NMJ 分析，30−60 μm 的组织厚度可用于捕获喉肌内的几个完整的 NMJ，而不会碎裂神经末梢或运动终板^11，12，17。
2. 为了获得用于TA肌肉NMJ分析的纵向声带切片，请将标本贴在卡盘上，使会厌朝向低温恒温器叶片，气管腔朝下朝向标本盘。
3. 通过将标本头部向前推进100μm直到甲状腺软骨出现来修剪OCT化合物。
4. 修剪和跟踪从甲状腺发病到TA肌肉的内侧和外侧分裂暴露的30μm切片。
   注意:建议在纵平面上使用五组喉部标志，以跟踪组织向目标TA肌的深度进展。 图3 显示了纵平面上10倍放大镜下的喉部特征。
5. 一旦达到目标TA肌肉，在30μm处收集带正电荷的载玻片上的切片。
6. 将切片储存在4°C的PBS中以保持水分，直到它们准备好染色。

结果

代表性的结果是正在进行的声乐运动对喉神经肌肉系统影响的研究的一部分。对29只雄性Fischer 344/棕色挪威大鼠（12只9个月大，17只24个月大）进行称重和安乐死，吸入_CO2 ，然后进行双侧开胸术。

这些程序遵循概述的协议来标记外侧和内侧TA肌肉的NMJ和纤维大小。使用喉部肌肉和周围软骨在纵向和横截面中跟踪喉标志物之间的距离，以确定冷冻切除术期间的进展（

讨论

准备用于神经肌肉分析的大鼠声带可能会带来各种挑战。喉部肌肉不仅小且被软骨包围，从而难以直接提取目标肌肉，而且在喉部解剖学标志物的深度上还发现了动物之间的高变异性。对于肌肉横截面方案，在腹侧甲状腺软骨最初出现后，完整的声带切片出现在21-85个切片（每节10μm）之间，这比NMJ分析方案纵平面中的63-126个截面（每节35μm）要少得多（表1）。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane Certified	Fisher Chemical	35514
Aluminum Foil	Fisherbrand	1213101
Cryo Tongs SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Cryostat blades	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Disposable Underpads	Medline	23-666-062
Dissection kit	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Frozen Section Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Ice Bucket	Bel-Art	11999054
Immunostain Moisture Chamber	Ted Pella Inc	NC9425474
Needle holders	Assi	ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply	Quick Medical	9023
Orbital shaker	Troemner	02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes	Fisherbrand	5408129
Specimen Storage Bags	Fisherbrand	19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Task wiper	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Scissors	Assi	ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.