Préparation du pli vocal du rat pour les analyses neuromusculaires

Résumé

Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour préparer les plis vocaux des rats pour l’étude neuromusculaire histochimique.

Résumé

Le but de ce tutoriel est de décrire la préparation du pli vocal du rat pour l’étude neuromusculaire histochimique. Ce protocole décrit les procédures de dissection laryngée chez le rat, de congélation éclair et de cryosection des plis vocaux. Cette étude décrit comment cryosectionner les plis vocaux dans les plans longitudinal et transversal. Une nouveauté de ce protocole est le suivi laryngé pendant la cryosection qui assure une identification précise des muscles laryngés intrinsèques et réduit le risque de perte de tissu. Les figures démontrent la cryosection progressive dans les deux plans. Vingt-neuf hémi-larynges de rats ont été cryosectionnés et suivis depuis l’émergence du cartilage thyroïdien jusqu’à l’apparition de la première section qui comprenait le pli vocal complet. Le pli vocal complet a été visualisé pour tous les animaux des deux plans. Il y avait une grande variabilité dans la distance entre l’apparition du cartilage thyroïdien et l’apparition du pli vocal complet dans les deux plans. Le poids n’était pas corrélé à la profondeur des repères laryngés, ce qui suggère que la variabilité individuelle et d’autres facteurs liés à la préparation des tissus peuvent être responsables de la grande variabilité de l’apparence des points de repère pendant la section. Cette étude détaille une méthodologie et présente des données morphologiques pour préparer le pli vocal du rat à l’investigation neuromusculaire histochimique. En raison de la grande variabilité individuelle, les repères laryngés doivent être suivis de près pendant la cryosection pour éviter la sursection des tissus et la perte de tissus. L’utilisation d’une méthodologie cohérente, y compris une préparation adéquate des tissus et la connaissance des points de repère dans le larynx du rat, aidera à obtenir des résultats cohérents dans toutes les études et aidera les nouveaux chercheurs intéressés à utiliser le pli vocal du rat comme modèle pour étudier les mécanismes neuromusculaires laryngés.

Introduction

Le larynx du rat est un modèle bien établi pour étudier les adaptations laryngées neuromusculaires structurelles et fonctionnelles au développement, au vieillissement, à la maladie et aux agents pharmacologiques1,2,3,4,5. La cohérence des méthodes histologiques est essentielle à cette ligne de travail, car il existe de multiples subtilités impliquées dans la préparation et l’analyse musculaires ainsi que des défis associés à la taille, à la forme et à la topographie des muscles laryngés encapsulés dans les cartilages laryngés1,6,7,8,9,10,11 . En raison de la petite taille des muscles laryngés intrinsèques du rat, l’intégration, la congélation et la cryosection systématiques sont essentielles pour obtenir des résultats cohérents et précis. Par exemple, lors de la section du pli vocal du rat dans le plan coronal, les jonctions neuromusculaires (NMJ) de quatre des muscles laryngés intrinsèques sont situées à moins de 1,8 mm de profondeur ^tissulaire11. Par conséquent, une surveillance précise de l’anatomie du muscle laryngé pendant la cryosection est impérative pour identifier avec précision la ou les sections d’intérêt et éviter la sursection des tissus. La sursection du muscle cible peut entraîner une identification inexacte du nombre et de la topographie des ^NMJ11 ou peut entraîner une réduction globale de la taille de l’échantillon si le muscle cible est écarté en raison d’une confusion d’orientation ^{de repère12}. Au fur et à mesure que de nouveaux modèles pour l’étude du muscle laryngé et de leurs adaptations respectives sont développés, des procédures opératoires normalisées sont essentielles pour garantir que les résultats sont précis, fiables et reproductibles dans toutes les études.

L’objectif de cet article est de détailler la préparation du pli vocal du rat pour une analyse longitudinale et transversale optimale. Des méthodes détaillées utilisées régulièrement dans notre laboratoire sont décrites pour identifier les repères musculaires cibles lors de la cryosection. Bien que des méthodes similaires soient utilisées dans plusieurs laboratoires, des détails plus détaillés sont fournis ici que dans la littérature pour assurer une réplication fiable et précise lorsqu’elle est mise en œuvre par des chercheurs novices. L’objectif de ce tutoriel est de fournir une méthodologie standard pour l’évaluation immunohistochimique (IHC) du pli vocal du rat afin d’améliorer la cohérence entre les laboratoires et les investigations.

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Protocole

Cette étude a été réalisée en conformité avec le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Faculté de médecine de l’Université de New York.

1. Disséquer le larynx du rat

1. Euthanasier le rat selon le protocole approuvé par l’institution. Raser le cou ventral de la mandibule au manubrium et écouvillonner avec de l’alcool pour éviter la contamination de la fourrure dans les échantillons de tissus.
2. Sous une lunette de dissection avec un grossissement de 10x, excisez tout le larynx en créant une incision du cou médiane avec un scalpel jusqu’à ce que la trachée soit exposée.
3. Séparez les muscles laryngés extrinsèques ventraux à la ligne médiane pour exposer le larynx à l’aide d’une pince et de ciseaux disséquants ou d’un scalpel.
4. Coupez la trachée caudale au troisième anneau trachéal et faites une incision rostrale à l’os hyoïde pour exciser tout le larynx à l’aide de ciseaux disséquants.
5. Retirez les tissus laryngés extrinsèques (œsophage, glande thyroïde et muscles laryngés extrinsèques) du larynx à l’aide d’outils de microdissection (pinces à épiler, épingles et microscisseurs) sous grossissement.
6. Avec les microcisseurs, coupez le larynx en deux entre les aryténoïdes en utilisant la ligne médiane entre les muscles cricoaryténoïdes postérieurs comme point de repère. Épingler les parois latérales du larynx pour exposer les plis vocaux, puis couper en deux par voie ventrale la ligne médiane du cartilage thyroïdien entre la commissure antérieure des plis vocaux avec des microscisseurs (Figure 1).
   REMARQUE : cette étape peut être facultative ; il peut être sauté pour garder le larynx entier. La bisection des larynges permet plusieurs techniques d’immunocoloration en utilisant séparément les côtés droit et gauche du même larynx.
7. Rincez chaque hémi-larynx dans une solution tamponnée au phosphate (PBS) pendant environ 10 s et séchez délicatement avec un essuie-glace pour réduire la formation de cristaux de glace pendant la congélation.

2. Fixer et/ou congeler le tissu laryngé

REMARQUE: La fixation peut ne pas être idéale pour tous les protocoles de coloration immunologique. Souvent, les tissus laryngés sont surgelés frais immédiatement après la dissection. Sautez l’étape 2.1 pour congeler le tissu laryngé sans fixation.

1. Pour fixer les hémi-larynges, placez les tissus dans un tube de centrifugeuse rempli de formaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur orbital à 70 tr / min. Transférer les tissus dans un tube de centrifugeuse propre et rincer 3x pendant 20 min dans PBS. Transférer ensuite dans un tube de centrifugeuse propre et immerger dans une solution de saccharose à 20 % / 5 % de glycérol (~18 h ou jusqu’à ce que le tissu coule) à 4 °C.
   ATTENTION : Le formaldéhyde est dangereux et doit être utilisé dans une hotte avec l’équipement de protection individuelle approprié.
2. Placez tous les hémi-larynges dans une position uniforme dans un cryo-moule rempli de composé de température de coupe optimale (OCT). Pour un hémilarynx, placez le tissu avec la surface médiale du pli vocal face au bas du cryomoulage et l’aspect longitudinal du pli vocal parallèle au bord inférieur de l’ouverture du cryomoulage. Pour les larynges entiers, placez le tissu avec les cricoaryténoïdes postérieurs face au fond du cryomoulage et l’aspect longitudinal du pli vocal parallèlement au bord inférieur de l’ouverture du cryomoulage.
   REMARQUE: Une orientation laryngée cohérente dans le composé OCT est essentielle pour la cryosection du pli vocal du rat. Une fois que l’hemilarynx est incrusté et congelé, il doit être décongelé pour changer d’orientation, introduisant ainsi des risques de lésions tissulaires dues à de multiples cycles de décongélation.
3. Tissus surgelés à l’aide d’isopentane (2-méthylbutane) réfrigéré dans un bécher en acier entouré d’azote liquide.
   REMARQUE: L’isopentane atteint une température optimale pour la congélation des tissus lorsque des précipités blancs commencent à se former sur les côtés et le fond du ^bécher13. L’isopentane est utilisé parce qu’il a une conductivité thermique plus élevée que l’azote liquide, ce qui aide à prévenir la fissuration du bloc tissulaire lors d’une congélation rapide. Pour une description plus détaillée de la congélation des tissus en vente libre, reportez-vous à Kumar et ^al.13.
4. Enveloppez chaque moule dans une feuille prélabellisée et placez-la dans un sac de congélation individuel pour éviter la déshydratation et conservez-la immédiatement sur de la glace carbonique jusqu’à ce qu’elle soit transférée pour être entreposée dans un congélateur à -80 °C.

3. Cryosection hemilarynx dans le plan de section transversale

1. Réglez la température de la chambre dans le cryostat à -20 °C, ce qui se situe au milieu de la plage de température (15−25 °C) recommandée pour le sectionnement des tissus musculaires par le manuel du fabricant.
2. Réglez l’épaisseur de la section du cryostat sur des sections de 10 μm d’épaisseur.
   REMARQUE: Pour l’analyse en coupe transversale des fibres musculaires, des sections de 10 μm d’épaisseur sont optimales pour permettre une coloration complète et une intensité d’imagerie robuste des fibres musculaires marquées pour l’analyse du typage des fibres14,15,16. Certains protocoles peuvent nécessiter une épaisseur de section différente en fonction des cibles neuromusculaires.
3. Transférez les tissus dans la chambre du cryostat, ajoutez une couche uniforme de composé OCT sur le disque de l’échantillon de cryostat (mandrin) et placez le bloc de tissu incorporé au-dessus du composé OCT sur le disque de l’échantillon. Pour obtenir des coupes transversales du pli vocal pour l’analyse des fibres musculaires thyroaryténoïdes (TA), fixez l’échantillon au mandrin de sorte que le cartilage thyroïdien ventral fasse face à la lame du cryostat et que le cartilage aryténoïde fasse face au disque de l’échantillon.
   REMARQUE: Il est essentiel de noter que ces points de repère ne sont pas visibles à ce stade, car le composé OCT devient blanc et opaque lorsqu’il est gelé. Ce manque de visibilité est la raison pour laquelle il est essentiel de noter l’orientation de l’hémilarynx pendant la phase de congélation du flash.
4. Couper le composé OCT en avançant la tête de l’échantillon de 100 μm jusqu’à ce que la partie ventrale du cartilage thyroïdien apparaisse.
5. Ensuite, coupez et suivez des sections de 30 μm depuis l’apparition du cartilage thyroïdien jusqu’à ce que la lamina propria, les muscles TA médiaux et le muscle TA latéral soient exposés.
   REMARQUE: Les repères laryngés doivent être suivis et notés dès l’apparition du cartilage thyroïdien tous les 100 μm pour s’assurer que l’angle de sectionnement n’est pas oblique. La figure 2 représente les deux ensembles de repères laryngés dans le plan de coupe transversale à un grossissement de 10x.
6. Une fois que le muscle TA cible est atteint, collectez des sections sur des lames chargées positivement à 10 μm.
7. Conservez les sections dans du PBS à 4 °C pour retenir l’humidité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être tachées.
   REMARQUE: Les tissus fixes peuvent être stockés dans le PBS jusqu’à une semaine en fonction de la cible IHC, tandis que les tissus non fixés doivent être immédiatement traités.

4. Cryosection hemilarynx dans le plan longitudinal

1. Avec la chambre de cryostat à nouveau réglée à -20 °C, modifiez l’épaisseur de la section à 30 μm.
   REMARQUE: Pour l’analyse NMJ, une épaisseur de tissu comprise entre 30 et 60 μm peut être utilisée pour capturer plusieurs NMJ complets dans les muscles laryngés sans fragmentation de la terminaison nerveuse ou de la plaque d’extrémité motrice11,12,17.
2. Pour obtenir des coupes longitudinales du pli vocal pour l’analyse NMJ du muscle TA, fixez les échantillons au mandrin de sorte que l’épiglotte soit orientée vers la lame du cryostat et que la lumière trachéale soit orientée vers le bas vers le disque de l’échantillon.
3. Coupez le composé OCT en avançant la tête de l’échantillon de 100 μm jusqu’à ce que le cartilage thyroïdien apparaisse.
4. Couper et suivre des sections de 30 μm depuis l’apparition de la thyroïde jusqu’à ce que la lamina propria et les divisions médiales et latérales du muscle TA soient exposées.
   REMARQUE: Cinq ensembles de repères laryngés dans le plan longitudinal sont recommandés pour suivre la progression de la profondeur des tissus vers le muscle TA cible. La figure 3 représente les repères laryngés dans le plan longitudinal à un grossissement de 10x.
5. Une fois le muscle TA cible atteint, collectez des sections sur des lames chargées positivement à 30 μm.
6. Conservez les sections dans du PBS à 4 °C pour retenir l’humidité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être tachées.

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Résultats

Les résultats représentatifs faisaient partie d’une étude en cours sur les effets de l’exercice vocal sur le système neuromusculaire laryngé. Vingt-neuf rats mâles Fischer 344/bruns de Norvège (12 âgés de 9 mois, 17 âgés de 24 mois) ont été pesés et euthanasiés par inhalation de _CO2 suivie d’une thoracotomie bilatérale.

Les procédures ont suivi le protocole décrit pour étiqueter les NMJ et la taille des fibres des muscles ta latéraux et médiaux. La distanc...

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Discussion

La préparation des plis vocaux des rats pour l’analyse neuromusculaire peut présenter divers défis. Non seulement les muscles laryngés sont petits et entourés de cartilage, ce qui rend difficile l’extraction directe du muscle cible, mais une grande variabilité a également été observée entre les animaux en profondeur des repères anatomiques laryngés. Pour le muscle, le protocole du plan de coupe transversale, des sections complètes du pli vocal sont apparues entre 21 et 85 sections (10 μm par section) ap...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane Certified	Fisher Chemical	35514
Aluminum Foil	Fisherbrand	1213101
Cryo Tongs SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Cryostat blades	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Disposable Underpads	Medline	23-666-062
Dissection kit	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Frozen Section Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Ice Bucket	Bel-Art	11999054
Immunostain Moisture Chamber	Ted Pella Inc	NC9425474
Needle holders	Assi	ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply	Quick Medical	9023
Orbital shaker	Troemner	02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes	Fisherbrand	5408129
Specimen Storage Bags	Fisherbrand	19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Task wiper	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Scissors	Assi	ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.