Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

Özet

Bu protokol, histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımları hazırlamak için kullanılan yöntemleri açıklar.

Özet

Bu öğreticinin amacı histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımının hazırlanmasını tanımlamaktır. Bu protokol, sıçan gırtlağım diseksiyonu, flaş dondurma ve ses kıvrımlarının kriyoseksiyonu için prosedürleri özetlemektedir. Bu çalışmada hem boyuna hem de kesitsel düzlemlerde kriyoseksiyon vokal kıvrımlarının nasıl ağlaşılacağı açıklanmaktadır. Bu protokolün bir yeniliği, kriyoseksiyon sırasında içsel gırtlağın doğru tanımlanmasını sağlayan ve doku kaybı olasılığını azaltan gırtlağı takibidir. Rakamlar her iki düzlemde de ilerleyici kriyoseksiyon olduğunu gösteriyor. Tiroid kıkırdılmasının ortaya çıkışından tam vokal kıvrımını içeren ilk bölümün görünümüne kadar yirmi dokuz sıçan hemi-larynges kriyoseksiyon ve izlendi. Tam vokal kıvrımı her iki düzlemdeki tüm hayvanlar için görselleştirildi. Tiroid kıkırdajının görünümünden her iki düzlemde de tam ses kıvrımının görünümüne kadar olan mesafede yüksek değişkenlik vardı. Ağırlık, laringeal yer işaretlerinin derinliği ile ilişkili değildi, bu da bireysel değişkenlik ve doku hazırlığı ile ilgili diğer faktörlerin, bölümleme sırasında yer işaretlerinin görünümündeki yüksek değişkenliklerden sorumlu olabileceğini düşündürdü. Bu çalışma bir metodolojiyi detaylandırıyor ve sıçan vokal kıvrımını histokimyasal nöromüsküler araştırma için hazırlamak için morfolojik veriler sunuyor. Yüksek bireysel değişkenlik nedeniyle, aşırı doku ve doku kaybını önlemek için kriyoseksiyon sırasında gırtlağı yer işaretleri yakından takip edilmelidir. Yeterli doku hazırlama ve sıçan larinks içindeki yer işaretlerinin farkındalığı da dahil olmak üzere tutarlı bir metodolojinin kullanılması, çalışmalar genelinde tutarlı sonuçlara yardımcı olacak ve laringeal nöromüsküler mekanizmaları araştırmak için sıçan vokal kıvrımını bir model olarak kullanmakla ilgilenen yeni araştırmacılara yardımcı olacaktır.

Giriş

Sıçan larinksi, gelişim, yaşlanma, hastalık ve farmakolojik ajanlara yapısal ve fonksiyonel nöromüsküler laringeal adaptasyonları araştırmak için iyi kurulmuş bir modeldir1,2,3,4,5. Histolojik yöntemlerin tutarlılığı, kas hazırlama ve analizinde birden fazla incelik olduğu gibi gırtlağı kıkırdaklar içinde kapsüllenen kasların gırtlağı boyutu, şekli ve topografyası ile ilgili zorluklar olduğu için bu iş kolu için kritik öneme sahiptir1,6,7,8,9,10,11 . Sıçan içsel gırtlağım kaslarının küçük boyutu nedeniyle, tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için sistematik gömme, dondurma ve kriyoseksiyon kritik öneme sahiptir. Örneğin, sıçan ses kıvrımını koronal düzlemde bölümlerken, içsel gırtlağı kaslarının dördünün nöromüsküler kavşakları (NMJs) doku derinliğinin 1,8 mm'den daha az içinde ^bulunur11. Bu nedenle, kriyoseksiyon sırasında gırtlaj kas anatomisinin hassas bir şekilde izlenmesi, ilgi alanlarını doğru bir şekilde tanımlamak ve dokunun aşırı bölümünü önlemek için zorunludur. Hedef kasın aşırı gözden belirlenmesi, NMJs11'in sayısının ve topografyasının yanlış tanımlanmasına neden olabilir veya hedef kas dönüm noktası oryantasyon karışıklığı nedeniyle atılırsa örnek boyutunda genel azalmalara neden ^olabilir12. Laringeal kasların ve ilgili adaptasyonlarının incelenmesi için yeni modeller geliştirildiği için, sonuçların kesin, güvenilir ve çalışmalar arasında tekrarlanabilir olmasını sağlamak için standart çalışma prosedürleri gereklidir.

Bu makalenin amacı, sıçan vokal kıvrımının optimal boyuna ve kesitsel analiz için hazırlanmasını detaylandırmaktır. Kriyoseksiyon sırasında hedef kas yer işaretlerini belirlemek için laboratuvarımızda düzenli olarak kullanılan ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Benzer yöntemler birkaç laboratuvarda kullanılsa da, acemi araştırmacılar tarafından uygulandığında güvenilir ve doğru replikasyon sağlamak için burada literatüre göre daha fazla ayrıntı sağlanmaktadır. Bu öğreticinin amacı, laboratuvarlar ve araştırmalar arasında tutarlılığı artırmak için sıçan vokal kıvrımının immünohistokimyasal (IHC) değerlendirilmesi için standart bir metodoloji sağlamaktır.

Protokol

Bu çalışma New York Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.

1. Sıçan larinksi diseksiyon

1. Kurumsal olarak onaylanmış protokole göre sıçanı ötenazi edin. Doku örneklerinde kürk kirlenmesini önlemek için ventral boynu mandibuladan manubriuma tıraş edin ve alkolle sürün.
2. 10x büyütmeli bir diseksiyon dürbün altında, nefes borusu açığa çıkına kadar neşterle orta hat boyun kesisi oluşturarak tüm larinksi kesinleştirin.
3. Dış dıştrinsik gırtlaj kaslarını orta çizgide ayırarak, karaçamı, önps ve diseksiyon makası veya neşter kullanarak ortaya çıkarır.
4. Trakea kaudalini üçüncü trakeal halkaya kesin ve diseksiyon makası kullanarak tüm larinksi çıkarmak için hyoid kemiğine bir kesi rostral yapın.
5. Dışsal gırtlak dokularını (yemek borusu, tiroid bezi ve dıştrinsik gırtlak kasları) büyütme altında mikrodiseksiyon araçları (cımbız, pim ve mikros makas) kullanarak gırtlaktan çıkarın.
6. Mikroscisörlerle, arka krikoarytenoid kasları arasındaki orta çizgiyi bir dönüm noktası olarak kullanarak gırtlağı arytenoidler arasında dorsally olarak ikiye ayırın. Ses kıvrımlarını ortaya çıkarmak için larinksin yanal duvarlarını sabitleyin ve daha sonra mikroscisörlerle ses kıvrımlarının ön komiseri arasındaki tiroid kıkırdayının orta çizgisi boyunca ventral olarak ikiye ayırın (Şekil 1).
   NOT: Bu adım isteğe bağlı olabilir; larinksi bütün tutmak için atlanabilir. Laringlerin bizeksiyonu, aynı larinksin sağ ve sol taraflarını ayrı ayrı kullanarak birden fazla immünostainasyon tekniğine izin verir.
7. Her bir hemi-gırtlağı fosfat tamponlu çözeltide (PBS) ~10 s durulayın ve donma sırasında buz kristali oluşumunu azaltmak için bir görev silecek ile hassas bir şekilde kurulayın.

2. Largeal dokuyu düzeltin ve/veya flaş dondurun

NOT: Fiksasyon tüm immün sistemi baskılama protokolleri için ideal olmayabilir. Genellikle laringeal dokular diseksiyondan hemen sonra flaş donmuş tazedir. Fiksasyon yapmadan laringeal dokuyu flaş dondurmak için adım 2.1'i atlayın.

1. Hemi-larynges sabitlemek için dokuları PBS'de% 4 formaldehit ile dolu santrifüj tüpüne 70 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat yerleştirin. Dokuları temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve PBS'de 20 dakika boyunca 3x durulayın. Daha sonra temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de% 20 sakkaroz /% 5 gliserol çözeltisine (~ 18 saat veya doku batana kadar) batırın.
   DİkKAT: Formaldehit tehlikelidir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla birlikte duman kaputunda kullanılmalıdır.
2. Tüm hemi-larynges'i düzgün bir konuma, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile dolu bir kriyo kalıbına yerleştirin. Hemilarynx için, ses kıvrımının medial yüzeyine sahip dokuyu kriyodoldun altına ve vokal kıvrımının boyuna yönüne kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak yerleştirin. Tüm larynges için, arka krikoarytenoidler kriyooldun altına ve kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak vokal kıvrımının boyuna yönüne bakan dokuyu yerleştirin.
   NOT: OCT bileşiği içindeki tutarlı gırtlaj yönelimi, sıçan vokal kıvrımının kriyoseksiyonu için kritik öneme sahiptir. Hemilarynx gömülüp dondurulduktan sonra, yönünü değiştirmek için çözülmelidir, böylece birden fazla çözülme-donma döngüsünden doku hasarı riskleri ortaya getirilmelidir.
3. Sıvı nitrojenle çevrili çelik bir beherde soğutulmuş izopentan (2-metilbütan) kullanarak flaş donduran dokular.
   NOT: Beherin yanlarında ve dibinde beyaz çökeltiler oluşmaya başladığında izopentan doku dondurma için en uygun sıcaklığa ^ulaşır13. Izopentan, sıvı nitrojenden daha yüksek bir termal iletkenliğe sahip olduğu için kullanılır, bu da hızlı donma sırasında doku bloğunun çatlamasını önlemeye yardımcı olur. OTC'deki donma dokusunun daha ayrıntılı bir açıklaması için Kumar ve ^ark.13'e bakın.
4. Her kalıbı önceden etiketlenmiş folyoya sarın ve dehidrasyonu önlemek için ayrı bir dondurucu torbasına yerleştirin ve -80 °C dondurucuda saklanmak üzere transfer edilene kadar hemen kuru buzda saklayın.

3. Kesit düzleminde kriyoseksiyon hemilarynx

1. Kriyostattaki oda sıcaklığını, üretici kılavuzu tarafından kas dokusu kesiti için önerilen sıcaklık aralığının (15−25 °C) ortasındaki -20 °C'ye ayarlayın.
2. Kriyostat kesit kalınlığını 10 μm kalınlığında bölümlere ayarlayın.
   NOT: Kas lifi kesit analizi için, 10 μm kalınlığındaki bölümler, fiber tipleme analizi için etiketli kas liflerinin tam boyama ve sağlam görüntüleme yoğunluğuna izin vermek için en uygun bölümlerdir14,15,16. Bazı protokoller nöromüsküler hedeflere bağlı olarak farklı kesit kalınlığı gerektirebilir.
3. Dokuları kriyostat odasına aktarın, kriyostat numune diskine (chuck) düzgün bir OCT bileşiği katmanı ekleyin ve gömülü doku bloğunu örnek diskteki OCT bileşiğin üzerine yerleştirin. Tirarytenoid (TA) kas lifi analizi için vokal kıvrımının kesitlerini elde etmek için, numuneyi aynaya yapıştırın, böylece ventral tiroid kıkırdağı kriyostat bıçağına ve arytenoid kıkırdak örnek diske bakacaktır.
   NOT: OCT bileşiği dondurulduğunda beyaz ve opak hale geldiğinden, bu yer işaretlerinin bu aşamada görünmediğini belirtmek önemlidir. Bu görünürlük eksikliği, flaş dondurma aşamasında hemilarynx'in yönünü not etmenin kritik öneme sahip olmasının nedenidir.
4. Tiroid kıkırdantının ventral kısmı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.
5. Daha sonra tiroid kıkırdılmasının başlangıcından lamina propria, medial TA kasları ve lateral TA kası açığa çıkarana kadar 30 μm kesitleri kırpın ve izleyin.
   NOT: Gırtlağı simgesel yapılar izlenmeli ve kesit açısının eğik olmadığından emin olmak için tiroid kıkırdajının başlangıcından itibaren her 100 μm'de bir not edilmelidir. Şekil 2 , kesit düzlemdeki iki laringeal yer işareti kümesini 10x büyütmede temsil eder.
6. Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 10 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.
7. Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın.
   NOT: Sabit doku IHC hedefine bağlı olarak PBS'de bir haftaya kadar saklanabilirken, düzeltilmemiş doku derhal işlenmelidir.

4. Boyuna düzlemde kriyoseksiyon hemilarynx

1. Kriyostat odası tekrar -20 ° C'ye ayarlanmışken, kesit kalınlığını 30 μm'ye değiştirin.
   NOT: NMJ analizi için, sinir terminali veya motor plakasının parçalanması olmadan gırtlaj kasları içindeki birkaç tam NMJ'yi yakalamak için 30−60 μm arasında bir doku kalınlığı ^{kullanılabilir11,12,17}.
2. TA kasının NMJ analizi için boyuna vokal katlama bölümleri elde etmek için, numuneleri aynaya yapıştırın, böylece epiglottis kriyostat bıçağına ve trakeal lümen numune diskine doğru aşağı doğru yönelir.
3. Tiroid kıkırdağı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.
4. Tiroidin başlangıcından TA kasının lamina propria ve medial ve lateral bölünmelerine kadar 30 μm'lik bölümleri kırpın ve izleyin.
   NOT: Boyuna düzlemdeki beş laringeal yer işareti seti, doku derinliğinin hedef TA kasına doğru ilerlemesini izlemek için önerilir. Şekil 3 , 10x büyütmede boyuna düzlemdeki laringeal işaretleri temsil eder.
5. Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 30 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.
6. Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Temsili sonuçlar, vokal egzersizinin laringeal nöromüsküler sistem üzerindeki etkilerinin devam eden bir araştırmasının bir parçasıydı. 29 erkek Fischer 344/kahverengi Norveç sıçanı (12 9 aylık, 17 24 aylık) _CO2 inhalasyonu ve ardından bilateral torakotomi ile tartıldı ve ötenaziye tabi tökezlendi.

Prosedürler, lateral ve medial TA kaslarının NMJ'leri ve lif boyutunu etiketlemek için belirtilen protokolü izledi. Gırtlağı simgesel yapıları arasındaki...

Tartışmalar

Nöromüsküler analiz için sıçan vokal kıvrımlarının hazırlanması çeşitli zorluklarla karşı karşıya olabilir. Gırtlağı kasları sadece küçük ve kıkırdakla çevrili değildir, böylece doğrudan hedef kasın çıkarılmasını zorlaştırır, ayrıca gırtlağı anatomik yer işaretlerinin derinliğinde hayvanlar arasında yüksek değişkenlik bulunmuştur. Kesit düzlem protokolünü kaslamak için, ventral tiroid kıkırdajının ilk görünümünden sonra 21−85 bölüm (bölüm başına 10 μ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane Certified	Fisher Chemical	35514
Aluminum Foil	Fisherbrand	1213101
Cryo Tongs SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Cryostat blades	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Disposable Underpads	Medline	23-666-062
Dissection kit	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Frozen Section Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Ice Bucket	Bel-Art	11999054
Immunostain Moisture Chamber	Ted Pella Inc	NC9425474
Needle holders	Assi	ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply	Quick Medical	9023
Orbital shaker	Troemner	02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes	Fisherbrand	5408129
Specimen Storage Bags	Fisherbrand	19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Task wiper	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Scissors	Assi	ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.