A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
الحمض النووي الريبي المحسن (eRNAs) عبارة عن RNAs غير مشفرة يتم إنتاجها من معززات نشطة. يتمثل النهج الأمثل لدراسة وظائف الحمض النووي الريبي في معالجة مستوياتها في مناطق الكروماتين الأصلية. نقدم هنا نظاما قويا لدراسات eRNA باستخدام منشطات النسخ المدمجة CRISPR-dCas9 للحث على التعبير عن eRNAs ذات الأهمية.
المعززات هي عناصر جينومية محورية منتشرة عبر جينوم الثدييات وتملي برامج التعبير الجيني الخاصة بالأنسجة. أظهرت الأدلة المتزايدة أن المعززات لا توفر فقط أشكال ربط الحمض النووي لعوامل النسخ (TFs) ولكنها تولد أيضا RNAs غير مشفرة يشار إليها باسم eRNAs. أظهرت الدراسات أن نصوص الحمض النووي الريبي يمكن أن تلعب أدوارا مهمة في تنظيم الجينات في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض. تقتصر الطرق الشائعة الاستخدام للتحقيق في وظيفة eRNAs على مناهج "فقدان الوظيفة" عن طريق ضربة قاضية من eRNAs ، أو عن طريق التثبيط الكيميائي لنسخ المحسن. لم تكن هناك طريقة قوية لإجراء دراسات "اكتساب الوظيفة" لل eRNAs لتقليد حالات مرضية معينة مثل السرطان البشري ، حيث غالبا ما يتم التعبير عن eRNAs بشكل مفرط. هنا ، نقدم طريقة لتنشيط eRNAs بدقة وقوة للاستجواب الوظيفي لأدوارها من خلال تطبيق نظام وسطاء التنشيط التآزري (SAM) بوساطة dCas9. نقدم سير العمل الكامل لتنشيط eRNA ، بدءا من اختيار eRNAs ، وتصميم gRNAs إلى التحقق من صحة تنشيط eRNA بواسطة RT-qPCR. تمثل هذه الطريقة نهجا فريدا لدراسة أدوار eRNA معين في تنظيم الجينات وتطور المرض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام لفحص كريسبر غير المتحيز لتحديد أهداف الحمض النووي الريبي المرسال التي تقود النمط الظاهري في سياق مرض معين.
يحتوي الجينوم البشري على كوكبة من العناصر التنظيمية1،2،3. من بين هذه ، تظهر المعززات لتكون واحدة من أكثر الفئات أهمية4،5،6. تلعب المعززات أدوارا أساسية في تنظيم التطور ، وهي مسؤولة عن إنشاء برامج التعبير الجيني المكاني والزماني لتحديد هوية الخلية5،6،7. تقليديا ، تعتبر المعززات فقط عناصر الحمض النووي التي توفر زخارف ملزمة لعوامل النسخ (TFs) ، والتي تتحكم بعد ذلك في التعبير الجيني المستهدف6،8. ومع ذلك ، وجدت سلسلة من الدراسات أن العديد من المعززات النشطة تقوم أيضا بنسخ الحمض النووي الريبي غير المشفر (أي eRNAs)4،9،10.
تم العثور على مستوى نسخ eRNA للارتباط بنشاط محسن4،10. تنتج المعززات النشطة المزيد من نصوص eRNA وتظهر مستويات أعلى من علامات epigenome المرتبطة بالنسخ النشط ، مثل H3K27ac و H3K4me19،11،12. أظهرت بعض الدراسات أن نسخ الحمض النووي الريبي يمكن أن تلعب أدوارا مهمة في التنشيط النسخي للجينات المستهدفة10،12. تم تحديد عدد كبير من eRNAs ليتم تحريرها في السرطانات البشرية13،14،15،16 ، والتي أظهر العديد منها خصوصية عالية من نوع السرطان وأهمية سريرية. توفر هذه النتائج فرصا بأن توضيح eRNAs التي يمكن أن تقود / تعزز تكوين الأورام قد يوفر أهدافا جديدة للتدخل العلاجي13،15.
تعتمد الطرق الحالية لدراسة وظائف eRNA بشكل حصري تقريبا على استراتيجيات الضربة القاضية التي استخدمت الحمض النووي الريبي التداخل الصغير (siRNA) ، أو الحمض النووي الريبي القصير (shRNAs) ، أو قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى (ASOs ، والتي تعتبر الأحماض النووية المقفلة (LNAs) هي النوع الشائع الاستخدام في البحث) 10،12،17. ومع ذلك ، فإن الأمراض البشرية مثل السرطان تظهر في الغالب الإفراط في التعبير عن eRNAs مقارنة بالأنسجة الطبيعية المجاورةلها 15 ، مما يتطلب أدوات "للإفراط في التعبير" عن eRNAs لتقليد أنماط التعبير الخاصة بها ذات الصلة بالمرض للدراسات الوظيفية. لتحقيق ذلك ، فإن نظام الإفراط في التعبير خارج الرحم القائم على البلازميد ليس مثاليا لأن مواقع بدء النسخ الدقيقة وإنهائه ل eRNAs لا تزال غير واضحة إلى حد كبير. بالإضافة إلى ذلك ، قد يغير نظام التعبير عن البلازميد موقع eRNAs ، مما يتسبب في القطع الأثرية المحتملة لوظائفها18. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لتسهيل التوصيف الوظيفي ل eRNAs من خلال فرض "الإفراط في التعبير" في الموضع الجينومي الأصلي لإنتاجها (أي في الموقع) ، والذي يعتمد على نظام وسطاء التنشيط التآزري CRISPR / dCas9 (SAM).
تم تطوير نظام SAM في البداية لتنشيط جينات الترميز والحمض النووي الريبي غير المشفرة الطويلة بين الجينات (lincRNAs) المرتبطة بمقاومة مثبطات BRAF في خلايا الورم الميلانيني19. على عكس تقنيات تنشيط كريسبر الأخرى (CRISPRa) ، يتكون نظام SAM من مجموعة من منشطات النسخ لمنح تنشيط نسخ قوي للمناطق المستهدفة. وتشمل هذه المنشطات: Cas9 ميت إنزيميا (dCas9) مدمج مع VP64 (أي dCas9-VP64); دليل الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على اثنين من أبتامرات الحمض النووي الريبي MS2 ، وبروتين منشط الانصهار MS2-p65-HSF1. يمكن أن يؤدي وجود أبتامير MS2 في gRNA إلى تجنيد بروتين اندماج MS2-p65-HSF1 بالقرب من مواقع ربط dCas9 / gRNA. من بين هؤلاء ، VP64 هو رباعي مصمم هندسيا لمجال منشط النسخ VP16 الهربس البسيط ، والذي ثبت أنه ينشط بقوة النسخ الجيني عن طريق تجنيد عوامل النسخ العامة20،21،22. يتكون بروتين الاندماج MS2-p65-HSF1 من ثلاثة أجزاء. الجزء الأول ، MS2-N55K ، هو شكل متحور من بروتين ربط MS2 الذي له تقارب أقوى23. الجزءان الآخران من بروتين الاندماج هذا هما مجال التنشيط ل p65 وعامل الصدمة الحرارية 1 (HSF1) ، وكلاهما من عوامل النسخ التي تمتلك مجالات نقل قوية ويمكن أن تحفز برامج نسخ قوية24،25. لذلك ، أنشأ نظام SAM بشكل أساسي مركبا منشطا قويا للغاية لتنشيط نسخ جينات الترميز المعينة و lincRNAs19.
يظهر سير العمل الكامل لهذا البروتوكول في الشكل 1.
1. اختيار الحمض النووي الريبي المحسن (eRNA)
2. تصميم الحمض النووي الريبي
3. استنساخ gRNAs في بنية عدسية
4. اختبار كفاءة الحمض النووي الريبي
ملاحظة: على الرغم من أنه قد لا يكون ضروريا لكل gRNA ، فمن المستحسن أن يقوم الباحثون بفحص جودة gRNA عن طريق إجراء مقايسة Surveyor (أي مقايسة انقسام عدم التطابق) للكشف عن indels أو الطفرات التي لا يمكن إنشاؤها بكفاءة إلا بواسطة gRNAs عالية الجودة33،34. يمكن أيضا استخدام طرق أخرى مثل تتبع Indels عن طريق التحلل (TIDE) لتحديد كفاءة الحمض النووي الريبي30،35. نوكلياز المساح هو عضو في عائلة من نوكليازات داخلية خاصة بعدم التطابق يمكنها قطع الحمض النووي مزدوج الخيط مع عدم التطابق (الشكل 3 أ). يمكن الكشف عن جودة الحمض النووي الريبي من خلال فعالية إنتاج أنواع أصغر من الحمض النووي. عمليا ، يمكن أن تتأثر فعالية قطع المساح أيضا بكفاءة تعداء gRNAs و Cas9.
5. توليد فيروس العدسي
6. زراعة الخلايا
7. عدوى الخلايا والاختيار
8. استخراج الحمض النووي الريبي والكمي RT-PCR لفحص مستويات eRNA
9. dCas9 ChIP و qPCR
ملاحظة: هذه الخطوة هي تجربة اختيارية للتحقق من صحة ارتباط مركب dCas9 / SAM-gRNA بمحسن الهدف بواسطة gRNAs المحددة. بينما يتم تشجيع المستخدمين على تنفيذ هذه الخطوة ، فليس من الضروري اختبار كل gRNA على حدة. راجع المثال الموضح في الشكل 5 ب. راجع البادئات المدرجة في الجدول التكميلي 1.
10. مقايسة نمو الخلية والاختبارات الوظيفية الأخرى للتنشيط المفرط للحمض النووي الريبي المرسال
يوضح الشكل 1 سير العمل العام لهذا البروتوكول. كان تركيزنا على الحمض النووي الريبي التمثيلي ، NET1e15 ، والذي يتم التعبير عنه بشكل مفرط في سرطان الثدي ، والذي تم استخدام نظام SAM لتنشيط ودراسة دوره البيولوجي في تنظيم التعبير الجيني وتكاثر الخ?...
بناء على بياناتنا ، نستنتج أن نظام SAM مناسب لدراسة دور eRNAs في تنظيم الأنماط الظاهرية الخلوية ، على سبيل المثال ، نمو الخلايا أو مقاومة الأدوية. ومع ذلك ، فإن تصميم الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي الدقيق مطلوب لتنشيط الحمض النووي الريبي المرسال القوي ، للأسباب الت?...
المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية لمعهد الوقاية من السرطان وأبحاثه في تكساس.
يتم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى WL (معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس ، CPRIT RR160083 و RP180734. المعهد الوطني للتحقيق K22CA204468; NIGMS R21GM132778; جائزة جامعة تكساس UT Stars ؛ ومؤسسة ويلش AU-2000-20190330) وزمالة ما بعد الدكتوراه إلى JL (برنامج UTHealth للابتكار لأبحاث الوقاية من السرطان ، زمالة ما بعد الدكتوراه ، CPRIT RP160015). نحن نقر بالدعايةالأصلية 15 حيث تم اعتماد بعض أرقامنا الحالية (مع التعديلات) ، والتي تتبع ترخيص المشاع الإبداعي (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Blasticidin | Goldbio | B-800-100 | |
BsmBI restriction enzyme | New England BioLabs Inc. | R0580S | |
Cas9 mAb | Active Motif | 61757 | Lot: 10216001 |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs Inc. | N0447S | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | 10-013-CM | |
Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 65002 | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP118-500 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Fetal Bovine Serum | GenDEPOT | F0900-050 | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | 10814010 | |
Hepes-KOH | Thermo Fisher Scientific | BP310-100 | |
Hexadimethrine Bromide | Sigma | H9268 | |
Hygromycin B | Goldbio | H-270-25 | |
IGEPAL CA630 | Sigma | D6750 | |
IncuCyte live-cell imager | Essen BioScience | IncuCyte S3 Live-Cell Analysis System | |
lenti_dCAS-VP64_Blast | Addgene | 61425 | |
lenti_gRNA(MS2)_zeo backbone | Addgene | 61427 | |
lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro | Addgene | 61426 | |
LiCL | Sigma | L9650 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-500 | |
NaCl | Sigma | S3014 | |
Na-Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
N-lauroylsarcosine | Sigma | 97-78-9 | |
Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
PES syringe filter | BASIX | 13-1001-07 | |
Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche Diagnostic | 11836145001 | |
pSpCas9(BB)-2A-Puro | Addgene | 62988 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs Inc. | M0491S | |
Q5 Reaction Buffer | New England BioLabs Inc. | B9027S | |
Quick-DNA Miniprep | ZYMO Research | D3025 | |
Quick-RNA Miniprep | ZYMO Research | R1054 | |
Restriction enzyme buffer | New England BioLabs Inc. | B7203S | |
RT-qPCR Detection System | Thermo Fisher Scientific | Quant Studio3 | |
SDS | Thermo Fisher Scientific | BP359-500 | |
Sonicator | Qsonica | Q800R2 | |
Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725274 | |
Stbl3 competent cell | Thermo Fisher Scientific | C7373-03 | |
Superscript IV reverse transcript | Thermo Fisher Scientific | 719000 | |
Surveyor Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs Inc. | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs Inc. | B0202S | |
TE buffer | Thermo Fisher Scientific | 46009CM | |
Thermal cycler | Bio-Rad Laboratories | T100 | |
Thermomixer | Sigma | 5384000020 | |
Zeocin | Thermo Fisher Scientific | ant-zn-1p |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved